覃 媛，何艷華，張根水，張貴平，羅健東

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1．蛇毒研究所、2．藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510182）

激活Sonic hedgehog通路改善1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能

覃 媛1，何艷華1，張根水2，張貴平2，羅健東2

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1．蛇毒研究所、2．藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510182）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R329．24；R329．25；R364．3；R587.1

摘要：目的 研究激活Sonic hedgehog通路對(duì)1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）生物學(xué)功能的影響。方法 用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立1型糖尿病小鼠模型；采用密度梯度離心法分離并培養(yǎng)糖尿病小鼠骨髓EPCs；體外給予Sonic hedgehog（Shh）信號(hào)通路配體蛋白Shh和受體激動(dòng)劑SAG，通過MTT法、改良Boyden小室、Matrigel和β-半乳糖苷酶分別檢測(cè)各組EPCs的增殖、遷移、小管形成和衰老的功能性指標(biāo)。結(jié)果 1型糖尿病小鼠EPCs與正常對(duì)照組相比功能明顯下降，體外給予Shh蛋白和受體激動(dòng)劑SAG，可促進(jìn)糖尿病EPCs增殖，減少衰老，改善遷移和小管形成能力。結(jié)論體外激活Sonic hedgehog通路可以改善1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞受損的功能。

關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞；1型糖尿??；Sonic hedgehog信號(hào)通路；增殖；遷移；小管形成；衰老

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．011．html

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是能定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。大量研究表明，EPCs不僅參與胚胎時(shí)期的血管生成，在出生后的血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)和血管新生中都起著重要作用。近來的一些臨床前和臨床研究報(bào)道在四肢和心肌的缺血疾病中，給予EPCs治療可以促進(jìn)組織的血管再生［1－2］。然而研究發(fā)現(xiàn)，無論1型還是2型糖尿病患者均存在EPCs數(shù)量減少，增殖能力、黏附能力和血管形成能力的下降，EPCs功能及數(shù)量的改變?cè)谔悄虿〔l(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［3－4］。因此，增加糖尿病患者EPCs數(shù)量和改善其功能對(duì)于糖尿病血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要意義。

Hedgehog信號(hào)通路在胚胎發(fā)育期調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、組織的形成和器官的發(fā)生，在出生后及成年期可維護(hù)組織的穩(wěn)態(tài)及受損后的修復(fù)及再生［5－6］。許多的研究表明［7－8］，Sonic hedgehog（Shh）信號(hào)通路可以促進(jìn)多種組織中血管的生長(zhǎng)，缺血損傷時(shí)激活Shh通路可促進(jìn)血管新生的生成過程。我們之前的研究證實(shí)，在1型糖尿病小鼠心肌梗死模型中，給予Shh信號(hào)通路受體激動(dòng)劑SAG，能增加梗死周邊區(qū)心肌組織毛細(xì)血管密度，明顯改善心肌梗死后的心臟功能［9］。那么Shh通路促進(jìn)糖尿病血管新生的機(jī)制是否與EPCs有關(guān)，尚未見相關(guān)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了激活Shh信號(hào)通路對(duì)糖尿病EPCs增殖、遷移和小管形成等多種功能的影響，旨在探討Shh信號(hào)通路對(duì)糖尿病EPCs的影響，闡明其促進(jìn)糖尿病血管新生的機(jī)制。

1　材料

1．1動(dòng)物 C57／B6♂小鼠為SPF級(jí)，體質(zhì)量20～23 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2藥品與試劑 DiI-acLDL購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司；鏈脲佐菌素（STZ）、FITC-UEA-1、淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；EGM-2培養(yǎng)基購(gòu)自Lonza公司；Sonic hedgehog信號(hào)通路Smo受體激動(dòng)劑SAG購(gòu)自于美國(guó)Merck公司；Shh重組蛋白購(gòu)自R＆D公司。

2　方法

2．1建立1型糖尿病小鼠模型 取7～8周的C57／B6♂小鼠，腹腔注射溶于無菌枸櫞酸緩沖液（pH 4.5，0.05 mmol·L－1枸櫞酸鈉）的STZ，劑量為45 mg·kg－1。正常對(duì)照組給予等量的檸檬酸緩沖液，連續(xù)給藥5 d。1周后取尾部靜脈血，用強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖分析儀，血糖高于280 g·L－1者，確認(rèn)為糖尿病小鼠模型。

2．2骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定 成年小鼠經(jīng)脫頸致死后，無菌解剖分離四肢長(zhǎng)骨，生理鹽水沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞。取15 mL離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液5 mL，將細(xì)胞懸液小心加至分離液面上層，2 000 r·min－1離心30 min。吸取中間白色云霧狀層細(xì)胞，PBS洗滌2次。用含5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以1×109·L－1的密度接種于包有纖連蛋白的培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取培養(yǎng)7 d的貼壁細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取培養(yǎng)d 7原代EPCs，在培養(yǎng)液中加入DiI-acLDL（2.4 mg·L－1），37℃孵育4 h，用冰冷的75%乙醇固定10 min。加入FITC-UEA-1（10 mg· L－1），室溫暗處孵育1 h。PBS洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察。

2．3EPCs增殖實(shí)驗(yàn) 糖尿病和對(duì)照小鼠的EPCs加入96孔板，5%CO2、37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入2 mg·L－1Shh重組蛋白和500 nmol· L－1激動(dòng)劑SAG，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37℃孵育48 h。每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L－1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

2．4EPCs遷移實(shí)驗(yàn) 采用改良的Boyden小室法觀察細(xì)胞遷移情況，用胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs。用EBM培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液，100 μL （2×108·L－1）的細(xì)胞懸液加入孔徑為5 μm的Tran-swell小室的上室，下室加入10%FBS的1640培養(yǎng)基，加入2 mg·L－1Shh重組蛋白和500 nmol·L－1的SAG。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h后用棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)膜上面未遷移的細(xì)胞，100%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。

2．5EPCs小管形成實(shí)驗(yàn) 在冰上用Matrigel包被24孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)使Matrigel聚合30 min。用EGM培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液，每孔加入500 μL細(xì)胞懸液，輕拍使細(xì)胞分布均勻，加入2 mg· L－1的Shh重組蛋白和500 nmol·L－1的SAG，37℃、5%CO2培養(yǎng)16 h。顯微鏡下觀察并拍照，選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)小管長(zhǎng)度。

2．6EPCs衰老實(shí)驗(yàn) 采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老。取培養(yǎng)的正常和糖尿病小鼠EPCs，用EBM培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液，等量接種24孔板，EGM培養(yǎng)鋪滿后，換無血清EBM培養(yǎng)48 h。加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育過夜，顯微鏡下拍照，選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

3　結(jié)果

3．1EPCs分離與培養(yǎng) 新鮮分離的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形。d 4起，細(xì)胞逐漸拉長(zhǎng)，呈梭形生長(zhǎng)。d 7時(shí)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，多處可見呈“集落”樣放射狀生長(zhǎng)，集落中央細(xì)胞圓形，由中央向外周伸展出梭形細(xì)胞，細(xì)胞呈紡錘形，近似單層生長(zhǎng)。培養(yǎng)14 d左右，細(xì)胞呈鵝卵石樣改變，融合成鋪路石樣內(nèi)皮細(xì)胞單層（Fig 1A）。EPCs的DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染法鑒定，顯示紅色熒光的為ac-LDL陽性，顯示綠色熒光為UEA-1陽性，顯示雙熒光陽性（橙黃色）的細(xì)胞則認(rèn)為是EPCs，其比例占貼壁細(xì)胞總數(shù)的80%以上，證實(shí)絕大多數(shù)貼壁細(xì)胞為EPCs（Fig 1B）。

Fig 1 Characteristics of EPCs derived from bone marrow

3．2激活Sonic hedgehog通路增強(qiáng)1型糖尿病小鼠EPCs增殖能力 用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果如Fig 2所示，糖尿病小鼠EPCs比正常對(duì)照組EPCs增殖能力明顯減弱（P＜0.05）。當(dāng)給予Shh通路Shh重組蛋白和激動(dòng)劑SAG，糖尿病小鼠EPCs增殖能力明顯增強(qiáng)加（P＜0.05）。

Fig 2 Activating Sonic hedgehog pathway can increase EPCs proliferation in type 1 diabetes（n＝4）

3．3激活Sonic hedgehog通路改善1型糖尿病小鼠EPCs遷移能力 用Transwell小室檢測(cè)EPCs的遷移能力，計(jì)數(shù)遷移至膜下表面的細(xì)胞數(shù)。如Fig 3所示，糖尿病小鼠骨髓培養(yǎng)的EPCs比正常對(duì)照組小鼠EPCs遷移能力明顯下降（P＜0.05）。當(dāng)給予Shh通路Shh重組蛋白和Sonic hedgehog激動(dòng)劑SAG，糖尿病小鼠EPCs細(xì)胞遷移數(shù)量明顯增加（P

＜0.05）。

3．4激活Sonic hedgehog通路促進(jìn)1型糖尿病小鼠EPCs小管形成 體外成血管實(shí)驗(yàn)顯示，EPCs具有體外成血管能力，種植于Matrigel上的細(xì)胞首尾相連成條索狀，形成血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)。糖尿病小鼠骨髓培養(yǎng)的EPCs比正常對(duì)照組小管形成明顯減少（P ＜0.05）。當(dāng)給予Shh重組蛋白和激動(dòng)劑SAG，糖尿病小鼠EPCs形成的血管樣結(jié)構(gòu)管腔明顯增長(zhǎng)（P ＜0.05）（Fig 4）。

3．5激活Sonic hedgehog通路減少1型糖尿病小鼠EPCs衰老 采用β-半乳糖苷酶法檢測(cè)EPCs衰老，染為藍(lán)色的即為衰老細(xì)胞。結(jié)果如Fig 5所示，糖尿病小鼠骨髓培養(yǎng)的EPCs比正常對(duì)照組小鼠EPCs衰老明顯增多（P＜0.05）。給予Shh通路Shh重組蛋白和Shh激動(dòng)劑SAG，糖尿病小鼠EPCs衰老細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。

4　討論

Fig 3 Activating Sonic hedgehog pathway can impove migratory ability of EPCs in type 1 diabetes（n＝4）

隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展和生活方式的快速轉(zhuǎn)變，糖尿病在中國(guó)不僅發(fā)病率高，而且處于快速增長(zhǎng)階段。最近的調(diào)查表明，目前我國(guó)糖尿病患者已有9千多萬，準(zhǔn)糖尿病患者達(dá)1億4千多萬［10］。代謝紊亂導(dǎo)致的糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。如何有效預(yù)防和治療糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，成為亟待解決的問題。

1997年，Asahara等［11］首次發(fā)現(xiàn)成人外周血中CD34＋細(xì)胞能在體外增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞。1998年，Shi等［12］報(bào)道骨髓來源的CD34＋細(xì)胞亞群可動(dòng)員入血，并分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞。由于EPCs的數(shù)量極其稀少，純化困難，體外培養(yǎng)周期短，成功分離培養(yǎng)EPCs成為科研人員研究EPCs的一個(gè)難點(diǎn)。我們通過腹腔小劑量注射STZ誘導(dǎo)了1型糖尿病小鼠模型，并經(jīng)過不同的實(shí)驗(yàn)方法，終于通過密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)EGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，成功分離培養(yǎng)出糖尿病小鼠骨髓EPCs。

Fig 4 Activating Sonic hedgehog pathway can increase EPCs tube formation in type 1 diabetes（n＝4）

EPCs具有增殖、遷移能力，并能摻入受損的血管，參與血管的修復(fù)和新生。我們首先檢測(cè)了培養(yǎng)的1型糖尿病小鼠EPCs的這些功能。結(jié)果顯示，糖尿病小鼠EPCs與正常對(duì)照相比，增殖能力減弱，遷移明顯下降，小管形成能力明顯下降，細(xì)胞衰老明顯增多，這與之前的研究結(jié)果相一致。而當(dāng)我們將1型糖尿病小鼠EPCs給予Sonic hedgehog蛋白和Smo受體激動(dòng)劑SAG時(shí)，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠EPCs增殖能力增強(qiáng)，遷移數(shù)量增多，小管形成能力明顯增強(qiáng)，而且細(xì)胞衰老減少。這些結(jié)果表明激活Sonic hedgehog通路可以明顯改善糖尿病小鼠EPCs的功能。

糖尿病患者的外周循環(huán)EPCs數(shù)量比非糖尿病者的明顯減少，這種減少在1型和2型糖尿病患者都被報(bào)道［13－14］。Loomans等［15］報(bào)道1型糖尿病患者外周血中EPCs數(shù)目比正常對(duì)照平均降低44%，而且EPCs數(shù)目減少的程度與HbA1C的水平呈正相關(guān)。我們的研究結(jié)果證實(shí)1型糖尿病小鼠EPCs增殖能力減弱，且衰老增多，這些都會(huì)導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少。而激活Sonic hedgehog既可促進(jìn)糖尿病EPCs的增殖，也減少EPCs的衰老，這都可以增加循環(huán)EPCs的數(shù)量。Fu等［16］報(bào)道Sonic hedgehog蛋白通過PI3K／Akt信號(hào)通路促進(jìn)正常EPCs增殖和遷移。而Sonic hedgehog是否通過PI3K／Akt通路促進(jìn)糖尿病EPCs的增殖，有待進(jìn)一步研究。

Fig 5 Activating Sonic hedgehog pathway can decrease EPCs senescence in type 1 diabetes（×40，n＝4）

EPCs的遷移能力對(duì)其參與血管新生具有重要意義。在血管損傷或組織缺血的情況下，存在于骨髓中的EPCs可以動(dòng)員并特異性地歸巢于損傷或缺血部位，參與血管的修復(fù)和新生。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sonic hedgehog可以促進(jìn)糖尿病EPCs的遷移。研究表明CXCR4在EPCs表面高度表達(dá)，SDF-1通過與CXCR4結(jié)合，促進(jìn)EPCs的遷移和歸巢［17］。而CX-CR4是Sonic hedgehog經(jīng)典通路的靶基因，Sonic hedgehog可能通過調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)而促進(jìn)EPCs的趨化遷移。

EPCs成血管能力的強(qiáng)弱直接關(guān)系著血管的自身修復(fù)和新生血管的形成。EPCs的成血管能力主要受細(xì)胞增殖、黏附及遷移等多種因素的影響。本研究證實(shí)激活Sonic hedgehog通路可使糖尿病小鼠EPCs的增殖及遷移能力增強(qiáng)，這都有助于EPCs的體外成血管能力。

本實(shí)驗(yàn)通過給予Sonic hedgehog通路配體蛋白和激動(dòng)劑，首次證實(shí)了激活Shh通路可以促進(jìn)1型糖尿病小鼠EPCs的增殖，改善其受損的遷移和小管形成能力。激活Sonic hedgehog通路可通過改善1型糖尿病EPCs功能，促進(jìn)組織的血管修復(fù)和新生，恢復(fù)缺血組織的功能，為糖尿病血管并發(fā)癥的治療提供了新的作用靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。有關(guān)Sonic hedgehog作用于糖尿病EPCs的具體分子生物學(xué)機(jī)制，尚需進(jìn)一步的研究和探討。

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Activating Sonic hedgehog pathway can improve the impaired function of endothelial progenitor cells in type 1 diabetic mice

QIN Yuan1，HE Yan-hua1，ZHANG Gen-shui2，ZHANG Gui-ping2，LUO Jian-dong2
（1．Guangzhou Snake Venom Research Institute，2．Dept of Pharmacology，School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China）

Abstract：Aim To study the effect of activating Sonic hedgehog（Shh）pathway on the function of endothelial progenitor cells（EPCs）in type 1 diabetic mice．Methods EPCs were isolated and cultured by density gradient method from diabetic mice．The effects of Shh N-terminal peptide and agonist SAG on EPCs prolifera-tion were evaluated by using the MTT colorimetric as-say．EPCs migration was measured by Transwell meth-od．EPCs tube formation ability was estimated by Matrigel．EPCs senescence activity was determined bybook=1071,ebook=40β-galactosidase staining．Results Compared with control mice，the function of EPCs in type 1 diabetic mice was impaired．The proliferation，migration and tube formation of diabetic EPCs could be promoted by Shh peptide and agonist SAG．The senescence of dia-betic EPCs could be decreased by Shh peptide and ag- onist SAG．Conclusion Activating Shh signaling pathway can improve the impared function of diabetic EPCs in type 1 diabetic mice．

Key words：endothelial progenitor cells；type 1 diabe-tes mellitus；Sonic hedgehog pathway；proliferation；migration；tube formation；senescence

作者簡(jiǎn)介：覃 媛（1978－），女，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，Tel：020-37103277，E-mail：307842880＠qq．com；何艷華（1977－），女，博士，助理研究員，研究方向：心血管藥理學(xué)，并列第一作者，E-mail：790641003＠qq．com；羅健東（1961－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：jiandongluo＠hotmail．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81173062）；廣州市屬高校科研計(jì)劃項(xiàng)目（No 2012C205）；廣州醫(yī)科大學(xué)科研項(xiàng)目（No 2013C2205）

收稿日期：2015－04－01，修回日期：2015－05－06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1066－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．008