宋 英，張?jiān)伱罚?潔，花 嶸

（1．徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004；2．中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院急診科，江蘇徐州 221000）

楊梅黃酮對(duì)炎性痛大鼠的外周鎮(zhèn)痛作用

宋 英1，張?jiān)伱?，徐 潔1，花 嶸2

（1．徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004；2．中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院急診科，江蘇徐州 221000）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284．1；R322．85；R364．5；R441．1；R971.1

摘要：目的 研究楊梅黃酮對(duì)炎性痛大鼠的外周鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制。方法 采用大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下注射完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）建立慢性炎性痛模型。檢測(cè)給予楊梅黃酮前后大鼠熱縮足反射潛伏期（ther-mal withdrawal latency，TWL）的改變。電生理學(xué)方法分析楊梅黃酮對(duì)背根節(jié)神經(jīng)元放電頻率及電壓依賴性鉀電流的影響。結(jié)果 大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA致炎后，TWL明顯降低（P＜0.05），腹腔注射50、500 mg·kg－1楊梅黃酮使CFA組大鼠TWL明顯升高（P＜0.05），電流鉗記錄顯示楊梅黃酮抑制背根節(jié)小神經(jīng)元的放電頻率（P＜0.01），且該抑制作用是通過(guò)增加鈣依賴性鉀通道電流（P＜0.05）產(chǎn)生的。結(jié)論 楊梅黃酮通過(guò)增加背根節(jié)神經(jīng)元鈣依賴性鉀電流，抑制神經(jīng)元興奮性而發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞：楊梅黃酮；完全弗氏佐劑；鉀電流；炎性痛；背根神經(jīng)節(jié)；膜片鉗

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．019．html

疼痛是身體和內(nèi)臟受到損害的警報(bào)信號(hào)，是許多疾病的共同癥狀，不僅給病人帶來(lái)痛苦，而且嚴(yán)重的疼痛可以產(chǎn)生疼痛性休克，威脅病人生命。因此，開發(fā)高效、低毒的鎮(zhèn)痛藥一直受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。

楊梅黃酮（myricetin）是從常綠灌木楊梅的葉子中提取的黃酮類化合物，具有特殊的化學(xué)活性和生理作用，目前已有許多的文獻(xiàn)報(bào)道了黃酮類化合物的鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物學(xué)作用［1－2］。楊梅葉在自然界具有極易獲取的優(yōu)勢(shì)，天然植物中黃酮類化合物的分析和性能研究已成為植物化學(xué)研究的前沿。研究顯示，黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞膜的興奮性具有調(diào)節(jié)作用，能通過(guò)促進(jìn)電壓依賴性K＋外流，降低細(xì)胞膜的興奮性［3］。但從楊梅葉中提取分離出來(lái)的天然活性物質(zhì)黃酮類單體化合物的鎮(zhèn)痛作用及作用機(jī)制報(bào)道較少，我們擬應(yīng)用行為學(xué)和電生理方法對(duì)楊梅黃酮的外周鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制進(jìn)行初步的探討，為楊梅黃酮能否開發(fā)成安全、高效的鎮(zhèn)痛藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料 本研究選用Sprague-Dawley大鼠24只，性別不限，體質(zhì)量180～250 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)在12 h／12 h明暗光線交替的安靜環(huán)境中，自由進(jìn)食、水。所有實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。采用隨機(jī)數(shù)字法分為兩組（每組30只）：生理鹽水對(duì)照組（Saline組）、完全弗氏佐劑致炎性痛組（CFA組）。

1．2炎性痛模型的建立 大鼠在異氟烷（2%～4%）吸入麻醉下，應(yīng)用100 μL微量注射器將用生理鹽水稀釋后的100 μL濃度為50%的完全弗氏佐劑（CFA）注入大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下，建立慢性炎性痛模型。對(duì)照組僅足底皮下注射生理鹽水100 μL。

1．3熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal la-tency，TWL）測(cè)定 大鼠在有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30 min后，按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15 cm×15 cm的有機(jī)玻璃箱中，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側(cè)。從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為TWL。此過(guò)程中光源刺激強(qiáng)度恒定不變。自動(dòng)切斷時(shí)間為25 s，以防止組織損傷。每只動(dòng)物連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)量間隔3 min，取后3次比較平穩(wěn)的數(shù)據(jù)平均值為大鼠TWL。

1．4離體膜片鉗記錄 大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（40 mg ·kg－1）腹腔麻醉，暴露L4和L5背根節(jié)，取出背根節(jié)放于正常人工腦脊液（artificial cerebral spinal flu-id，ACSF）（mmol·L－1）：NaCl 125、KCl 3.8、NaH2PO31.2、NaHCO326、glucose 10、MgCl21.0、CaCl22.0，剝除表面被膜，放置在2 mL消化液（1 mg蛋白酶及1.6 mg膠原酶用ACSF稀釋至2 mL備用）消化45 min，取出孵育1 h后移至記錄槽，壓片固定。在顯微鏡下選擇直徑＜15 μmol·L－1的小神經(jīng)元進(jìn)行記錄。用電阻為4～8 MΩ，充灌電極內(nèi)液（mmol·L－1）：KCl 140、NaCl 9、HEPES 10、EGTA 0.2、MgCl21、K2-ATP 3、Na-GTP 1玻璃微電極進(jìn)行巨阻封接，破膜后形成全細(xì)胞模式。

在檢測(cè)鉀電流時(shí)時(shí)將細(xì)胞外液更換為測(cè)鉀外液（mmol·L－1）：choline chloride 150、KCl 5、CaCl22、KCl 3、MgCl21、HEPES 10、CdCl21、D-glucose 10，并且在液槽中加入0.5 μmol·L－1TTX孵育5 min，將細(xì)胞鉗置于－90 mV持續(xù)500 ms，然后給予－75～35 mV階躍電壓刺激，每次遞增10 mV，持續(xù)時(shí)間300 ms，記錄到外向鉀電流。上述液體調(diào)整pH值為7.3左右，滲透壓調(diào)整至280～300 mmol·L－1，以上藥品均購(gòu)自Sigma公司。

2　結(jié)果

2．1行為學(xué)結(jié)果 CFA組（n＝12）和Saline組（n ＝12）比較，術(shù)前TWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。左側(cè)足底皮下注射CFA致炎后1、3、5 d TWL明顯降低，低于術(shù)前的基礎(chǔ)值（14.03±0.88）s （P＜0.05），與Saline組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。同時(shí)伴有患足典型外周炎癥表現(xiàn)，包括紅腫、縮爪等保護(hù)性行為，而且這一效果持續(xù)5 d左右后逐漸減輕。Saline組大鼠術(shù)前和術(shù)后的TWL未見明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見Fig 1。

Fig 1 Timecourse of development of thermal hypersensitivity in rats after intraplanta with CFA or saline

2．2楊梅黃酮對(duì)大鼠熱痛敏行為的影響 CFA組大鼠腹腔注射楊梅黃酮5 mg·kg－1對(duì)大鼠TWL無(wú)明顯影響（P＞0.05）。腹腔注射楊梅黃酮50 mg· kg－1后TWL明顯升高（9.37 s±0.47 s，n＝10），與給藥前TWL（5.49 s±0.37 s）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與CFA組相比也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；這一效應(yīng)在給藥后30 min達(dá)到最大，3 h后衰減至接近給藥前水平（6.35 s±0.69 s）。腹腔注射楊梅黃酮50、500與5 mg·kg－1相比結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見Fig 2。

Fig 2 Intraperitoneal administration of myricetin attenuated thermal hyperalgesia induced by CFA（n＝10）

2．3楊梅黃酮對(duì)DRG神經(jīng)元放電頻率的影響當(dāng)全細(xì)胞記錄模式形成后，在電流鉗模式下記錄DRG神經(jīng)元的放電特性。當(dāng)給予一個(gè)步階為200 pA，持續(xù)時(shí)間為400 ms的階躍電流時(shí)，結(jié)果如Fig 3A所示，膜電位去極化時(shí)爆發(fā)多個(gè)動(dòng)作電位。5、50 μmol·L－1的楊梅黃酮明顯抑制神經(jīng)元的放電頻率（P＜0.01），其作用有劑量相關(guān)性（Fig 3B）。

2．4楊梅黃酮對(duì)DRG神經(jīng)元K＋通道電流的影響在電壓鉗模式下記錄到外向鉀電流（Fig 4A），楊梅黃酮5 μmol·L－1增加電流幅度。電流－電壓曲線表明，在－10 mV至＋30 mV之間，楊梅黃酮明顯增加了K＋通道電流（P＜0.05）（Fig 4B）。為進(jìn)一步研究鈣離子在楊梅黃酮引起的K＋通道電流增強(qiáng)中的作用，更換灌流液為不含Ca2＋且含有200 μmol·L－1CdCl2的細(xì)胞外液，當(dāng)用此灌流液處理時(shí)，楊梅黃酮引起的K＋通道電流增強(qiáng)的現(xiàn)象被完全阻斷（Fig 5）。

3　討論

楊梅為楊梅科、楊梅屬常綠灌木，原產(chǎn)中國(guó)的亞熱帶。明代的《本草綱目》和宋代的《食療本草》對(duì)楊梅的藥用功效均有記載。隨著對(duì)楊梅葉所含成分的深入研究，人們已從楊梅葉中分離出黃酮類、三萜類等活性成分［4］，目前認(rèn)為楊梅黃酮，又稱楊梅樹皮素是發(fā)揮藥理作用的主要化學(xué)成分之一。黃酮類化合物常有特殊的化學(xué)和生理活性，天然植物中黃酮類化合物的分析和性能研究已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外植物化學(xué)研究的前沿。楊梅黃酮是黃酮類化合物家族中的一種，屬于黃酮醇類，具有廣泛的生物學(xué)活性。人們已發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用。而DRG作為痛覺傳入的第一級(jí)神經(jīng)元在痛覺的外周機(jī)制中起著極為重要的作用［5］。實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到楊梅黃酮能夠抑制炎癥痛大鼠的熱痛敏行為，且楊梅黃酮能抑制背根節(jié)小神經(jīng)元的放電頻率，降低神經(jīng)元的興奮性，使其向中樞傳入的沖動(dòng)減少，表明楊梅黃酮的鎮(zhèn)痛作用可能是通過(guò)直接抑制背根節(jié)神經(jīng)元的興奮性實(shí)現(xiàn)的。

Fig 3 The inhibitory effect of myricetin on action potential frequency of DRG neurons in rats

Fig 4 Effects of myricetin on potassium channel currents in DRG neurons

電壓依賴性鉀通道在生物體內(nèi)分布非常廣泛，是目前已知種類最多的一種通道。其在調(diào)節(jié)膜電位、動(dòng)作電位波形［6］、放電模式及頻率［7］等方面均有重要作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察到楊梅黃酮可以增強(qiáng)背根節(jié)神經(jīng)元電壓依賴性K＋通道的電流，而且此現(xiàn)象依賴于細(xì)胞外液中Ca2＋的存在。因此，我們推測(cè)楊梅黃酮引起的胞內(nèi)Ca2＋濃度的增加會(huì)激活鈣依賴性鉀電流，引起電壓依賴性K＋外流增加，從而加強(qiáng)了對(duì)DRG神經(jīng)元興奮性的抑制作用。此外，楊梅黃酮是否可以通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等其他的途徑產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用還不清楚，其能否研發(fā)為新型、高效的鎮(zhèn)痛藥物還需要深入探討。

Fig 5 Effects of myricetin on potassium channel currents in DRG neurons in calcium free perfusion solution

參考文獻(xiàn)：

［1］ Ma Z G，Wang J，Jiang H，et al．Myricetin reduces 6-hydroxydo-pamine-induced dopamine neuron degeneration in rats［J］．Neuro-report，2007，18（11）：1181－5．

［2］ Shimmyo Y，Kihara T，Akaike A，et al．Three distinct neuropro-tective functions of myricetin against glutamate-induced neuronal cell death：involvement of direct inhibition of caspase-3［J］．J Neurosci Res，2008，86（8）：1836－45．

［3］ Cermak R，Wolffram S，Kuhn G．Effect of the flavonol quercetin on membrane conductances in rat colonic crypt cells［J］．Eur J Pharmacol，2004，503（1－3）：31－4．

［4］ 廖華衛(wèi)，劉恩桂，王定勇．楊梅樹皮的化學(xué)成分研究［J］．中南藥學(xué)，2006，4（3）：196－9．

［4］ Liao H W，Liu E G，Wang D Y．Chemical constituents of the bark of Myrica ruba［J］．Cent S Pharm，2006，4（3）：196－9．

［5］ 吳海璇，馮璐璐，賀秋蘭，魏 明．蛇床子素對(duì)髓核致坐骨神經(jīng)痛大鼠DRG中CGRPR1表達(dá)的影響［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（2）：241－7

［5］ Wu H X，F(xiàn)eng L L，He Q L，Wei M．Effect of osthole on expres-sion of CGRPR1 in DRG of rats with nucleus pulposus-induced sciatica［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：241－7．

［6］ Tsantoulas C，Zhu L，Shaifta Y，et al．Sensory neuron downregu-lation of the Kv9．1 potassium channel subunit mediates neuropath-ic pain following nerve injury［J］．J Neurosci，2012，32（48）：17502－13．

［7］ Hao J，Padilla F，Dandonneau M，et al．Kv1．1 channels act as mechanical brake in the senses of touch and pain［J］．Neuron，2013，77（5）：899－914．

Periphery analgesic effect of myricetin on a rat model of inflammatory pain

SONG Ying1，ZHANG Yong-mei1，XU Jie1，HUA Rong2
（1．Key Laboratory of Anesthesiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221004，China；2．Dept of Emergency Medicine，the 97th Hospital of PLA，Xuzhou Jiangsu 221000，China）

Abstract：Aim To investigate the periphery analge-sic effect of myricetin on a rat model of inflammatory pain and the mechanism．Methods Rat models of in-flammatory pain were induced by complete Freund’s adjuvant（CFA）injection in left hindlimb plantar cen-ter．The thermal withdrawal latency（TWL）was meas-ured before and after CFA or myricetin treatment．Elec-trophysiological method was used to identify the effect of myricetin on the action potential frequency and the voltage dependent potassium channel currents in small DRG neurons．Results Rats with CFA injected showed thermal hyperalgesia（P＜0.05）and TWL in-creased significantly after myricetin intraperitoneally in- jected（P＜0.05）．Current clamp recording showed the action potential frequency of small DRG neurons in rats was inhibited by myricetin（P＜0.01）and voltage calmap recording showed the inhibitory effect of myr-icetin was enhanced by calcium depended potassium channel currents（P＜0.05）．Conclusion Myricetin exerts periphery analgesic effect by enhancing calcium depended potassium channel currents and inhibiting excitability of small neurons of dorsal root ganglion．

Key words：myricetin；complete Freund′s adjuvant；potassium channel currents；inflammatory pain；dorsal root ganglion；patch clamp

作者簡(jiǎn)介：宋 英（1979－），女，博士，副教授，研究方向：疼痛外周機(jī)制，通訊作者，Tel：0516-83262663；E-mail：jysongy-ing979＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No 31200836）；徐州醫(yī)學(xué)院振興計(jì)劃資助項(xiàng)目、院長(zhǎng)專項(xiàng)人才基金（No 2012KJZ15）；青藍(lán)工程資助

收稿日期：2015－05－22，修回日期：2015－06－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1108－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．016