陳紅英，冀雅靜，吳 丹，吳 瑤，蔣 維

（四川大學(xué)華西醫(yī)院1．公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心、2．分子醫(yī)學(xué)研究中心，四川成都 610041）

白藜蘆醇對(duì)于小鼠敗血癥休克的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的研究

陳紅英1，2，冀雅靜2，吳 丹2，吳 瑤2，蔣 維2

（四川大學(xué)華西醫(yī)院1．公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心、2．分子醫(yī)學(xué)研究中心，四川成都 610041）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R329.24；R631.402.2

摘要：目的 從動(dòng)物休克模型和細(xì)胞水平上研究白藜蘆醇（resveratrol，Res）對(duì)敗血癥的調(diào)節(jié)作用及其分子藥理學(xué)作用機(jī)制。方法 通過(guò)建立小鼠盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的敗血癥休克模型（CLP），研究白藜蘆醇給藥后的小鼠的存活率。然后利用體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞建立LPS損傷模型，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α、SIRT1等的mRNA的表達(dá)水平，Western blot分析NF-κB重要亞基的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與單純休克模型組相比較，腹腔注射白藜蘆醇（1和5 mg·kg－1·d－1）治療明顯增加敗血癥休克小鼠的存活率；白藜蘆醇處理明顯促進(jìn)SIRT1、SIRT6和SIRT7的mRNA表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位。結(jié)論 適當(dāng)劑量的白藜蘆醇可能通過(guò)上調(diào)SIRT家族成員，并抑制NF-κB炎癥反應(yīng)通路，對(duì)敗血癥休克具有潛在的藥理學(xué)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：敗血癥；LPS；白藜蘆醇；SIRTs；NF-κB；TNF-α

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．008．html

敗血癥是導(dǎo)致重病患者死亡的重要原因，近年來(lái)，臨床敗血癥的發(fā)生率仍有繼續(xù)上升的趨勢(shì)［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁糖脂成分，感染時(shí)釋放的LPS作為一種潛在的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致敗血癥性休克和死亡。敗血癥急性反應(yīng)階段的特征是發(fā)熱，白細(xì)胞增多，血小板減少，血管通透性發(fā)生變化，代謝反應(yīng)變化，還有器官功能性障礙。目前，探討敗血癥的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，以期開發(fā)新的治療方案是該疾病的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種葡萄、梅子、花生和紅酒中常見(jiàn)的具有抗氧化和抗炎癥作用的天然多酚［2］。白藜蘆醇被廣泛用于消炎、抗腫瘤、抗衰老等不同方向的研究［3－4］，其抗炎作用可能與其降低脂質(zhì)過(guò)氧化、提高M(jìn)DA指數(shù)等有關(guān)。Bishayee等［5］研究發(fā)現(xiàn)，其在抗肝癌中具有明顯的抗炎癥作用，幾乎可以抑制LPS引起的不良反應(yīng)。最新研究認(rèn)為，白藜蘆醇是Sirtuin家族成員蛋白的激動(dòng)劑，但白藜蘆醇抗炎癥的具體作用機(jī)制并未闡明，其抗感染性休克的研究亦未見(jiàn)報(bào)道。

哺乳動(dòng)物Sirtuin基因家族，是酵母Sir2（silen-cing information regulator）基因的類似物，具有煙酰胺腺苷酸核酸（nicotimide adenosine dinucleotide，NAD）依賴的組蛋白／非組蛋白脫乙?；富钚约岸姿嵯佘眨╝denosine diphosphate，ADP）核糖轉(zhuǎn)移酶活性，與許多細(xì)胞功能密切相關(guān)。Sirtuin家族成員參與調(diào)節(jié)敗血癥過(guò)程中的免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞的能量代謝過(guò)程，如SIRT1本身具有多樣的非細(xì)胞核作用，這些作用直接參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。SIRT1增強(qiáng)作為能源替代途徑的自噬過(guò)程、改變晝夜節(jié)律、提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的生成、促進(jìn)線粒體的生物合成，這些都利于細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。SIRT2也表現(xiàn)出抗炎作用［6］。SIRT6也像SIRT1一樣，可以和核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）的主要亞基RelA／p65相結(jié)合并使其失活，也可以抑制急性炎癥反應(yīng)的THP-1細(xì)胞中的TNF-α表達(dá)，可能具有與SIRT1類似的抗炎作用。這些研究表明Sirtuin家族成員可能在多種細(xì)胞類型中通過(guò)不同的空間和時(shí)間調(diào)節(jié)過(guò)程將能量代謝和炎癥聯(lián)系起來(lái)［7］。

NF-κB蛋白是在固定免疫反應(yīng)和炎癥因子基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。炎癥刺激引起的NF-κB由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也是心肌細(xì)胞炎癥過(guò)程所特有的。心肌細(xì)胞暴露于LPS、細(xì)胞因子、活性氧或缺血／再灌等因素的刺激下，激活I(lǐng)KK介導(dǎo)的IκBα的磷酸化，導(dǎo)致其自身降解，誘導(dǎo)p65／p50二聚體由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位。

已有研究表明，白藜蘆醇是一種Sirtuin家族成員的非特異性激動(dòng)劑，可通過(guò)去乙?；饔靡种芅F-κB的轉(zhuǎn)錄活性［8］。本研究建立敗血癥動(dòng)物休克模型和LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥模型，研究白藜蘆醇的抗感染性休克作用，并進(jìn)一步闡明白藜蘆醇

通過(guò)調(diào)控Sirtuin家族成員與核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB之間的相互作用，進(jìn)而調(diào)控下游的炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)抗炎作用的機(jī)制，為感染性休克疾病的治療提供新的理論基礎(chǔ)及治療策略。

1　材料與方法

1．1主要試劑 白藜蘆醇（純度99.5%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，LPS購(gòu)自Sigma公司，TR-Izol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Re-verse Transcriptase購(gòu)自Promega公司，反轉(zhuǎn)錄PCR 與Real-time PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa，NF-κB一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，Histone一抗購(gòu)自Santa Cruz公司。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57小鼠30只購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8周齡，♂，置于符合標(biāo)準(zhǔn)溫度空氣等條件的培養(yǎng)室進(jìn)行飼養(yǎng)。

1．3細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞株為國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子醫(yī)學(xué)中心凍存。用含有10%胎牛血清，1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO237℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。0.25%胰酶消化傳代。

1．4實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1敗血癥休克小鼠模型的建立及處理 敗血癥休克模型的構(gòu)建：用戊巴比妥鈉麻醉劑（40 mg· kg－1）將動(dòng)物淺度麻醉后，在小鼠腹部做1．5厘米的切口，尋得盲腸后在回盲瓣下方，用6-0絲線進(jìn)行結(jié)扎，導(dǎo)致腸梗阻。然后，19號(hào)針對(duì)盲腸穿孔。將盲腸復(fù)位回腹腔，縫合傷口。注意，小鼠的手術(shù)順序隨機(jī)，以避免手術(shù)操作者操作時(shí)帶來(lái)的誤差。給藥處理：將白藜蘆醇溶于酒精中，分別得到1 g·L－1和5 g·L－1溶液；將8周齡大小的30只♂C57小鼠隨機(jī)分為3組（每組10只），根據(jù)稱量的小鼠體重計(jì)算給藥劑量，以腹腔注射生理鹽水的小鼠為對(duì)照組，白藜蘆醇治療組分為低劑量組（1 mg·kg－1·d－1）和高劑量組（5 mg·kg－1·d－1），小鼠術(shù)前2周接受每天1次的不同濃度的白藜蘆醇腹腔注射，術(shù)后，繼續(xù)按上述劑量每天給藥1次。小鼠的狀態(tài)觀察和死亡時(shí)間統(tǒng)計(jì)：每日密切觀察各組小鼠的病情發(fā)展。小鼠的存活率按小時(shí)計(jì)，誤差控制在6 h以內(nèi)。

1．4．2不同濃度的白藜蘆醇與LPS刺激H9C2細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞分組與處理H9C2細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后用0.25%胰酶消化細(xì)胞后收集計(jì)數(shù)（臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活率≥95%），接種細(xì)胞至6孔板，每孔3×105個(gè)。于95%O2、5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁。按實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞分為空白對(duì)照組；2 g·L－1白藜蘆醇處理組；1 mg ·L－1LPS處理組，Res＋LPS組：根據(jù)Res濃度的不同（2 g·L－1和10 g·L－1）分為2個(gè)亞組，在每個(gè)亞組中，Res提前處理細(xì)胞24 h后，再與1 mg·L－1LPS共孵育3 h。收集細(xì)胞，提取RNA，然后檢測(cè)TNF-α的mRNA表達(dá)水平，每實(shí)驗(yàn)組4個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1．4．3白藜蘆醇和LPS作用后H9C2細(xì)胞SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的mRNA表達(dá)水平變化 實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞分組與處理。細(xì)胞培養(yǎng)與傳代方法同上，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后用0．25%胰酶消化細(xì)胞后收集計(jì)數(shù)（臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活率≥95%），接種細(xì)胞至6孔板，每孔3×105個(gè)。于95%O2、5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁。按實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞分為空白對(duì)照組；10 g·L－1白藜蘆醇單獨(dú)預(yù)處理24 h作為對(duì)照；剩余6組細(xì)胞分為3批，每批2組，分別為單獨(dú)1 mg·L－1的LPS刺激的一組，和10 g·L－1白藜蘆醇預(yù)處理24 h后再進(jìn)行LPS刺激的一組。這3批細(xì)胞形成時(shí)間梯度，LPS處理時(shí)間依次為0.5、3、6 h。之后，收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)獲得cDNA，用Real-time PCR檢測(cè)SIRT1、SIRT2、SIRT6、SIRT7的mRNA表達(dá)水平的變化。每實(shí)驗(yàn)組4個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1．4．4RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α的mRNA的表達(dá) TRIzol試劑盒提取H9C2細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶和通用引物oligo（dT），以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。再以cDNA為模板，用目標(biāo)引物與內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行特異性的PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。TNF-α引物序列上游：5′-CAGGGACCAGAACCACAAG-3′，下游：5′-TG-GCAGCACTGAGGTAGAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物：194 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5′-AGAAGGCTGGGGCT-CATTTG-3′，下游：5′-AGGGGCCATCCACGTCTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物：258 bp；PCR條件為95℃5 min，95℃，30 s，54℃，30 s（內(nèi)參58℃，30 s），72℃，30 s，72℃10 min，共30個(gè)循環(huán)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色，在凝膠成像分析儀下成像，用Imagequant軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描分析，TNF-α基因的表達(dá)強(qiáng)度用TNF-α條帶灰度與內(nèi)標(biāo)GAPDH條帶灰度的比值表示。

1．4．5Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的表達(dá) 提取H9C2細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄后參照說(shuō)明書進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，SIRT1的上游引物：5′-TTCAGAACCACCAAAGCG-3′，下游引物5′-CAGCAAGGCGAGC-ATAAA-3′；SIRT2的上

游引物：5′-TGGTGGGTCCTATTGTCG-3′，下游引物5′-CCTGCGGATGTGGAGATT-3′；SIRT6的上游引物：5′-GCCGTCTGGTCATTGTCA-3′，下游引物5′-AGCCTTGGGTGCTACTGG-3′；SIRT7的上游引物：5′-AGCGAAGCAGAGCCTAC-3′，下游引物5′-GCA-CAATGGTGTCCCGA-3′；PCR反應(yīng)條件為：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，60 s，共40個(gè)循環(huán)。采集熒光信號(hào)，制作融解曲線。目的基因的相對(duì)表達(dá)率（RQ）采用△△Ct計(jì)算方法RQ＝2－△△Ct。

1．4．6Western blot檢測(cè)NF-κB的表達(dá) 提取H9C2細(xì)胞核蛋白，BCA法分析定量蛋白含量，采用12.5%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉，一抗（NF-κB，1∶1 000）孵育，4℃過(guò)夜，TBST洗滌后用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）再孵育2 h，ECL法檢測(cè)。用Bio-rad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1．4．7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism5（GraphPad Soft-ware，SanDiego，CA，USA）軟件進(jìn)行分析。其中，白藜蘆醇給藥對(duì)休克小鼠生存率的影響數(shù)據(jù)采用Log rank（Mantel-Cox）test方法分析；其余數(shù)據(jù)以±s表示，3組及以上的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩獨(dú)立樣本之間的兩兩比較則采用Student′s t-test。

2　結(jié)果

2．1適當(dāng)劑量白藜蘆醇腹腔注射后能明顯改善敗血癥休克小鼠的存活率 Fig 1結(jié)果顯示，與腹腔注射生理鹽水的對(duì)照休克小鼠相比，腹腔分別注射1 與5 mg·kg－1·d－1白藜蘆醇后，休克小鼠的存活率明顯提高，且高劑量（5 mg·kg－1·d－1）白藜蘆醇提高休克小鼠存活率的作用強(qiáng)于低劑量（1 mg· kg－1·d－1）處理組。表明白藜蘆醇對(duì)敗血癥小鼠具有保護(hù)作用，且呈量效關(guān)系。

Fig 1 Hours after CLP surgery with different dosages of RES intraperitoneal injection

2．2白藜蘆醇明顯抑制LPS刺激的H9C2細(xì)胞的TNF-α mRNA表達(dá) TNF-α作為炎癥反應(yīng)因子，其升高揭示了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，也表明LPS處理成功激活了炎癥反應(yīng)通路。我們采用RT-PCR方法檢測(cè)TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)水平，如Fig 2所示，2 g ·L－1白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞24 h后，與1 mg·L－1LPS共孵育3 h，與LPS單獨(dú)處理3 h的對(duì)照細(xì)胞相比較，TNF-α的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。而10 g·L－1白藜蘆醇預(yù)處理24 h的H9c2細(xì)胞，與1 mg ·L－1LPS共孵育3 h后，與LPS單獨(dú)處理組相比較，明顯抑制LPS刺激所增強(qiáng)的TNF-α的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，10 g·L－1白藜蘆醇明顯抑制LPS所誘導(dǎo)的炎癥因子生成。

Fig 2 Effects of resveratrol on the expression of TNF-α mRNA

2．3白藜蘆醇明顯誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的mRNA表達(dá) 為了探討白藜蘆醇對(duì)小鼠敗血癥休克的保護(hù)機(jī)制，我們采用Real-time PCR檢測(cè)H9C2細(xì)胞中SIRT1、SIRT2、SIRT6、SIRT7的基因表達(dá)。如Fig 3所示，與無(wú)任何刺激的對(duì)照細(xì)胞相比較，單純白藜蘆醇（10 g·L－1）刺激H9c2細(xì)胞24 h后，SIRT1的mRNA水平表現(xiàn)出明顯增加，與夏洪娟等［9］文獻(xiàn)報(bào)道一致。單純LPS（1 mg·L－1）刺激0.5、3和6 h后，細(xì)胞的SIRT1 mRNA水平均明顯高于空白對(duì)照細(xì)胞，但LPS作用6 h時(shí)出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。與單純LPS 1 mg·L－1刺激的對(duì)照H9c2細(xì)胞相比較，白藜蘆醇（10 g·L－1）與LPS共孵育0.5、3和6 h后均明顯增加SIRT1的mRNA表達(dá)。Fig 4表明：與無(wú)任何刺激的對(duì)照細(xì)胞相比較，單純白藜蘆醇（10 g·L－1）刺激H9c2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞SIRT2的mRNA水平明顯增加。單純LPS（1 mg·L－1）刺激0.5和3 h后，細(xì)胞的SIRT2 mRNA水平均明顯高于空白對(duì)照細(xì)胞。與單純LPS 1 mg·L－1刺激的對(duì)照H9c2細(xì)胞相比較，白藜蘆醇（10 g·L－1）與LPS共孵育0.5、3

和6 h后均明顯增加SIRT2的mRNA表達(dá)。如Fig 5所示，與無(wú)任何刺激的對(duì)照細(xì)胞相比較，單純白藜蘆醇（10 g·L－1）刺激H9c2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞SIRT6的mRNA水平明顯增加。單純LPS（1 mg· L－1）刺激0.5 h后，細(xì)胞的SIRT6 mRNA水平均明顯高于空白對(duì)照細(xì)胞。與單純LPS 1 mg·L－1刺激的對(duì)照H9c2細(xì)胞相比較，白藜蘆醇（10 g·L－1）與LPS共孵育6 h后明顯增加SIRT6的mRNA表達(dá)。Fig 6表明：與無(wú)任何刺激的對(duì)照細(xì)胞相比較，單純白藜蘆醇（10 g·L－1）刺激H9c2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞SIRT7的mRNA水平明顯增加。與單純LPS 1 mg· L－1刺激的對(duì)照H9c2細(xì)胞相比較，白藜蘆醇（10 g· L－1）與LPS共孵育6 h后明顯增加SIRT7的mRNA表達(dá)。

Fig 3 Res promotes the expression of SIRT1 increased

Fig 5 Res promotes the expression of SIRT6 increased

Fig 6 Res promotes the expression of SIRT7 increased

2．4白藜蘆醇抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位

由于通常條件下NF-κB蛋白含有p65亞基，故p65的蛋白水平反映了NF-κB的蛋白水平。用Western blot檢測(cè)NF-κB的p65亞基的蛋白水平，結(jié)果如Fig 7所示，1 mg·L－1LPS刺激H9c2細(xì)胞0.5 h后，與無(wú)任何刺激的對(duì)照細(xì)胞相比較，細(xì)胞核內(nèi)的p65蛋白水平明顯增加。而10 g·L－1白藜蘆醇預(yù)處理24 h后，再與LPS共孵育0．5 h后，細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的水平明顯低于單純LPS刺激的細(xì)胞。結(jié)果提示白藜蘆醇預(yù)處理及與LPS共孵育明顯抑制LPS活化的NF-κB的核轉(zhuǎn)位。而細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平的下降，則進(jìn)一步抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，進(jìn)而導(dǎo)致其調(diào)控的一些下游的炎癥反應(yīng)因子表達(dá)水平的下降。

Fig 7 Res inhibits LPS－induced nuclear translocation of NF-κB**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs LPS

3　討論

CLP和LPS誘導(dǎo)動(dòng)物休克模型被廣泛應(yīng)用于研究敗血癥過(guò)程中心血管和肺功能的病理生理學(xué)變化［10－12］。敗血癥疾病時(shí)，多器官、組織和細(xì)胞中的NF-κB活性增強(qiáng)，在該疾病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要的作用。既往研究認(rèn)為，各種刺激因素主要通過(guò)調(diào)節(jié)IκB的降解來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB活性。但是越來(lái)越多的研究表明，NF-κB的活性調(diào)節(jié)還可以通過(guò)NF-κB蛋白的磷酸化和乙酰化等直接修飾作用實(shí)現(xiàn)。Chen等［13］認(rèn)為NF-κB與HATs和HDACs之間存在相互作用，通過(guò)乙?；{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。目前尚不清楚NF-κB與HATs和HDACs的具體作用方式，亦未闡明HATs或HDACs激動(dòng)劑或抑制劑對(duì)感染性休克的藥理學(xué)治療效應(yīng)。

Sirtuin是酵母NAD＋依賴性的組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶Sir2基因的真核生物類似物，該家族成員具有高度保守的催化結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)對(duì)多種底物進(jìn)行去乙?；饔?，從而在機(jī)體內(nèi)參與一系列的生物學(xué)活動(dòng)。這類酶主要位于細(xì)胞的核仁內(nèi)，酶活性特別高，可被煙酰胺（nicotinamide）、sirtinol、splitomi-cin等所抑制，因此歸為Ⅲ類HDAC。Sir2參與酵母的交配型基因、端粒和rDNA重復(fù)序列的沉默及調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命，而Sirtuin維持細(xì)胞抗脅迫能力、基因組穩(wěn)定性及參與能量代謝。Yeung等［14］觀察到Sirt1可直接與NF-κB的主要亞基RelA／p65相作用，通過(guò)RelA／p65的310位賴氨酸的去乙?；种破浣閷?dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，而Sirtuin激動(dòng)劑Res亦促進(jìn)染色質(zhì)關(guān)聯(lián)的Sirt1蛋白與cIAP-2啟動(dòng)子區(qū)域相互作用，減弱NF-κB信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用。最近，Kawahara等［15］觀察到SIRT6與NF-κB 的RelA／p65亞單位相互作用，并在NF-κB靶基因啟動(dòng)子區(qū)域誘導(dǎo)組蛋白3的第9個(gè)賴氨酸位點(diǎn)去乙?；?，從而抑制NF-κB對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。目前尚不清楚Sirtuin家族與NF-κB之間的相互作用調(diào)節(jié)Res的抗感染性休克的作用及具體的機(jī)制。

本研究觀察到白藜蘆醇明顯保護(hù)CLP誘導(dǎo)的敗血癥休克小鼠，提高其生存率。在LPS刺激的離體H9c2心肌細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有效激活Sirtuin 等III型HDAC的表達(dá)，同時(shí)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的核轉(zhuǎn)位活動(dòng)，并有效抑制LPS上調(diào)的炎癥因子TNF-α等的表達(dá)，這與Shakibaei等［16－18］的報(bào)道一致。本研究結(jié)果提示白藜蘆醇對(duì)敗血癥休克疾病潛在的藥理學(xué)保護(hù)作用可能與活化Sirtuin、抑制NF-κB有關(guān)。為了闡明其具體的信號(hào)通路，Sirtuin和NF-κB之間的相互作用還值得我們進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，白藜蘆醇對(duì)敗血癥休克及其心臟的損傷具有較強(qiáng)的治療保護(hù)作用，提示多種Sirtuin家族成員如SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的特異性激動(dòng)劑可能對(duì)敗血癥休克及膿毒血癥具有良好的治療保護(hù)作用，但具體的分子藥理學(xué)作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

（致謝：本研究課題主要在四川大學(xué)華西醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)中心研究室與科研基地公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心平臺(tái)完成，感謝研究室與中心老師和同學(xué)的幫助與支持，尤其感謝蔣維老師的細(xì)心指導(dǎo)與大力支持，冀雅靜同學(xué)的全力協(xié)助與參與?。?/p>

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Protective effects of resveratrol on sepsis and its involved mechanisms

CHEN Hong-ying1，2，JI Ya-jing2，WU Dan2，WU Yao2，JIANG Wei2
（1.Core Facility；2．Research Center for Molecular Medicine，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol （Res）on septic mice and LPS-insulted H9c2 cells，as well as its involved mechanisms．Methods By use of a mouse cecal ligation and puncture-induced septic model（CLP），the survival of septic mice was evalua-ted after resveratrol treatments．H9c2 cells were insul-ted by LPS and then treated with resveratrol，the mR-NA expressions of TNF-α，SIRT1 and other class III HDAC members were detected using RT-PCR and real-time PCR，F(xiàn)inally，the protein levels of nuclear p65，an important subunit of NF-κB，were measured in H9c2 cells using Western blot assay，to reveal the effect of resveratrol on LPS-induced nuclear transloca- tion of NF-κB．Results Compared with the control septic animals，intraperitoneal injection of resveratrol （1 or 5 mg·kg－1·d－1）significantly increased the survival of septic mice．Furthermore，resveratrol signif-icantly increased mRNA expressions of SIRT1，SIRT2，SIRT6 and SIRT7 in LPS-insulted H9c2 cells．Res-veratrol also remarkably inhibited LPS-induced nuclear translocation of NF-κB．Conclusion An appropriate dose of resveratrol protects septic mouse hearts from the injury induced by LPS through the activation of SIRT family members and the inhibition of NF-κB pathway．

Key words：sepsis；LPS；resveratrol；SIRTs；NF-κB；TNF-α

作者簡(jiǎn)介：陳紅英（1978－），女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：chy30＠126．com；蔣 維（1972－），男，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，Tel：028-85164103，E-mail：wcumsjw ＠scu．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No 31071001，31271226）

收稿日期：2015－04－29，修回日期：2015－06－02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1216－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．008