竇 偉李亨東楊 銳曾 穎肖 瀟李英倫*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學試驗室，四川雅安 625014；2.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066）

虎耳草水煎液對百草枯中毒小鼠SP-A的影響

竇 偉1李亨東1楊 銳2曾 穎1肖 瀟1李英倫1*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學試驗室，四川雅安 625014；2.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066）

24只昆明小鼠隨機分為對照組（8只，一次性灌胃生理鹽水0.25 ml/只）、染毒組（8只，一次性灌胃百草枯水溶液250 mg/kg）和治療組（8只，染毒小鼠按250 mg/kg劑量給予虎耳草水煎液灌胃治療），給藥2次/d，連續(xù)8 d。各組均于第9 d處死，取左肺制作石蠟切片。HE染色觀察病理表現(xiàn)，免疫組化方法檢測肺中表面活性蛋白A（surfactant-associated protein，SP-A）的含量。HE染色光鏡病理觀察，染毒組較對照組肺組織損傷程度顯著加重，治療組肺組織損傷減輕。染毒組肺泡上皮細胞SP-A表達的積分光密度（IOD）值明顯高于對照組，同時高于治療組。結(jié)果顯示，百草枯中毒所致肺急性損傷在虎耳草水煎液的治療下有所緩解和減輕癥狀。

虎耳草 百草枯 肺表面活性蛋白-A 免疫組化

百草枯（Paraquat，PQ）化學名1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是全世界最常用的除草劑之一，我國是全球最大的生產(chǎn)和使用國；百草枯中毒死亡率在所有農(nóng)藥中居首位，研究百草枯中毒引起肺損傷的機理和治療方法對救治百草枯中毒病例具有重要意義。本試驗通過給服虎耳草水煎液（Saxifrage Decoction，SD）觀察其對小鼠百草枯染毒后的治療情況，探究虎耳草對百草枯中毒的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

雌性昆明小鼠24只（SPF級），購于成都生物制品研究所，體重20±2.2 g。

1.1.2 藥品與試劑

百草枯（體積分數(shù)20%的百草枯水溶液），鄭州錦繡化工科技公司；生物素化山羊抗兔IgG、SP-A一抗、DAB顯色劑、BSA封閉液、SABC均購自武漢博士德生物工程有限公司；虎耳草（Saxifrage），采自四川雅安寶興縣。

1.1.3 儀器

顯微成像系統(tǒng)（Olympus）、OLIMPUS CH20BIMF200型光學顯微鏡、組織切片機（JP-40）。

1.2 方法

1.2.1 染毒與處理

試驗小鼠隨機分成三組，每組8只：對照組，一次性灌胃生理鹽水0.25 ml/只；染毒組，經(jīng)預試驗檢測確定染毒劑量及方案為：無菌生理鹽水將百草枯水溶液稀釋至體積分數(shù)0.2%，一次性灌胃0.25 ml，約合給藥量250 mg/kg；治療組，經(jīng)染毒處理后（方法同染毒組），染毒后第2天開始給予治療，濃縮至1mg/ml的虎耳草水煎液0.25 ml每天2次灌胃，連續(xù)給藥8 d。第9 d處死全部三個組的小鼠，完整分離左肺，將其置于福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟切片。

1.2.2 免疫組化染色

標本4 μm連續(xù)切片，37℃烤片12 h，甲苯脫蠟，梯度酒精水化，體積分數(shù)3%的H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液中微沸10 min修復抗原，5% BSA封閉液，37℃中孵育20 min，甩去多余液體，滴加稀釋后的SP-A抗體（0.6ml SP-A加入10 ml稀釋液中），密封盒中保濕4℃孵育12 h，PBS緩沖液沖洗1 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗1 min，滴加SABC，37℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗1 min，DAB顯色劑，37℃孵育30 min，蒸餾水沖洗2 min，蘇木素復染1 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

對照組：雙肺呈粉紅色，表面光滑，組織結(jié)構(gòu)正常。HE染色切片（見圖 A）肺泡完整，組織正常。染毒組：眼觀可見肺泡內(nèi)水腫、瘀血。HE染色切片（見圖B）中可見肺泡壁顯著增厚，肺泡壁上的毛細血管擴張充血，肺泡上皮腫脹，并伴有炎性細胞浸潤。支氣管黏膜上皮的纖毛脫落消失。治療組：眼觀癥狀與染毒組基本相同，但程度較染毒組輕。HE染色切片（見圖 C）病理變化較染毒組輕，但部分肺泡壁比對照組厚。

2.2 肺組織免疫組化染色

SP-A陽性物質(zhì)位于細支氣管黏膜上皮及肺泡Ⅱ型上皮細胞胞漿內(nèi)，呈深棕黃色或亮黃色。對照組（見圖D）黏膜上皮胞漿內(nèi)均有陽性物質(zhì)，且多染成棕黃色呈強陽性表達，肺泡上皮內(nèi)亦見有較多陽性產(chǎn)物。染毒組（見圖E）細支氣管黏膜上皮和肺泡上皮胞漿內(nèi)的陽性產(chǎn)物著色較對照組淺，且陽性細胞數(shù)量明顯減少。治療組（見圖F）陽性細胞數(shù)量較模型組明顯增多，但較對照組少。

肺組織免疫組化染色的切片光鏡下隨機選取3個視野，做光密度統(tǒng)計，結(jié)果顯示，模型組積分光密度值與治療組差異顯著p≤0.05，健康組積分光密度值與模型組、治療組差異均極顯著p≤0.01，詳見表1。

表1 免疫組化染色切片積分光密度值統(tǒng)計表

竇偉（1984-）男，四川德陽，碩士研究生。

李英倫（1965-）男，教授，博士。