張小苗，張　恒，楊玉艾，張　志，孫　健，陶曉珊，李曉成，范根成＊，孫永科＊（.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明6500；.青島易邦生物工程有限公司山東省動(dòng)物疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島664；.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島660）

表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗在兔體上的免疫原性分析

張小苗1，2△，張恒2△，楊玉艾1，張志3，孫健2，陶曉珊2，李曉成3，范根成2＊，孫永科1＊
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.青島易邦生物工程有限公司
山東省動(dòng)物疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266114；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

摘 要：研究表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體上的免疫原性，并確定其最小免疫保護(hù)劑量。將rAd-E0-E2按10倍梯度稀釋為107.0IFU、106.0IFU、105.0IFU，分別免疫接種家兔，14 d后，用豬瘟脾淋苗對(duì)各組兔子進(jìn)行攻毒。結(jié)果107.0IFU組和豬瘟脾淋苗組均未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)（0/4），脾重/體重指數(shù)比值分別為0.055%、0.05%，脾組織切片均未見(jiàn)充血、淤血，用RT-PCR和IFA方法均未檢測(cè)到脾臟內(nèi)有豬瘟脾淋苗病毒；106.0IFU組3/4出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，脾重/體重指數(shù)比值為0.074%，脾組織切片3/4可見(jiàn)充血、淤血，用RT-PCR和IFA方法可檢測(cè)到3/4脾臟有豬瘟脾淋苗病毒；105.0IFU組和對(duì)照組全部出現(xiàn)定型熱反應(yīng)（4/4），脾重/體重指數(shù)比值分別為0.099%和0.102%，脾組織切片充血、淤血嚴(yán)重，用RT-PCR和IFA方法均可檢測(cè)到兔子脾臟內(nèi)有豬瘟脾淋苗病毒。結(jié)果表明與對(duì)照組均不保護(hù)和豬瘟脾淋苗組全部保護(hù)相比，rAd-E0-E2在兔體的最小免疫保護(hù)劑量為107.0IFU，本研究成功完成了rAd-E0-E2在兔體上的免疫原性分析。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；E0-E2基因；重組腺病毒疫苗；兔；免疫原性

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，病死率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)面對(duì)這樣的烈性傳染病采用疫苗接種來(lái)預(yù)防其發(fā)生，降低發(fā)病率和死亡率。豬瘟疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了早期的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前廣泛使用的是弱毒疫苗，我國(guó)批準(zhǔn)使用的弱毒疫苗是由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的豬瘟兔化弱毒疫苗［1］。長(zhǎng)期以來(lái)，豬瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原發(fā)生了變異，出現(xiàn)了慢性感染、隱性感染等非典型流行形式，很難區(qū)分豬群中的疫苗免疫豬和野毒感染豬，致使疫情難以控制，或造成免疫失敗，這不但影響豬群中豬瘟的凈化，而且給豬肉出口造成障礙［2-3］。為此，研制更安全、更高效可以進(jìn)行鑒別診斷的新型基因工程標(biāo)記疫苗是全世界養(yǎng)豬業(yè)的迫切要求。本實(shí)驗(yàn)室從pMD18-T-E0質(zhì)粒、pMD18-T-E2質(zhì)粒中擴(kuò)增編碼E0、E2基因，構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通過(guò)PET32a載體將E0和E2基因串聯(lián)，形成PET-E0-E2，然后再將E0-E2克隆到腺病毒穿梭載體上得到重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd Track-E0-E2，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組腺病毒骨架載體pAd Easy-E0-E2，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（HEK 293），獲得了含有目的基因的重組腺病毒（rAd-E0-E2）［4-7］。通過(guò)對(duì)家兔接種10倍梯度稀釋的rAd-E0-E2，14d后用豬瘟脾淋苗攻毒，每隔6h測(cè)兔體溫，通過(guò)體溫的變化、脾重/體重指數(shù)比（%）、脾臟組織病理學(xué)變化、RT-PCR和IFA方法對(duì)豬瘟脾淋毒攻毒兔進(jìn)行檢測(cè)和分離鑒定等技術(shù)共同判斷說(shuō)明rAd-E0-E2在兔體的免疫保護(hù)效力以及最小免疫保護(hù)劑量。分析表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體的免疫原性，確定出最小免疫保護(hù)劑量［8］。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用病毒、疫苗、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬瘟重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2），≥2×107.0IFU/mL［9］，

其毒價(jià)測(cè)定采用IFA方法［10-11］得到，由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心（山東省動(dòng)物疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）凍干保存，作為試驗(yàn)樣品稀釋接種家兔；豬瘟活疫苗（兔源）簡(jiǎn)稱豬瘟脾淋苗，批號(hào)201401，20頭份/mL，由青島易邦生物工程有限公司凍干苗車間生產(chǎn)，用于作為本試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照；ST細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室液氮罐保存；1.5kg～3kg健康易感SPF家兔購(gòu)自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 雙抗、1×PBS、80%冷丙酮、500 mL/L甘油，柱式動(dòng)物RNAout提取試劑盒，北京天恩澤公司產(chǎn)品；兩步法RT-PCR試劑盒、Taq PCR Master Mix，TaRaKa公司產(chǎn)品；體溫計(jì)，上海鹿得醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；玻璃研磨均漿器，涿州市琦瑞玻璃制品廠產(chǎn)品；電子天平（JA1103型），上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀（YYD-8C型），北京六一儀器廠產(chǎn)品；PCR儀（Applied Biosystems），愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱（RCO3000T-5-VBC），REVCO產(chǎn)品；熒光顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1免疫前后體溫測(cè)定 購(gòu)回兔子的第3天開(kāi)始上下午各測(cè)體溫1次，連續(xù)測(cè)3d，從28只兔子中挑選體溫波動(dòng)不大（±0.5℃）的20只，隨機(jī)分成5組，每組4只，1、2、3組按照107.0、106.0、105.0IFU/只劑量肌肉注射rAd-E0-E2疫苗；4組肌肉注射每頭份150倍稀釋的豬瘟脾淋苗；5組為生理鹽水對(duì)照。同時(shí)上、下午各測(cè)體溫1次，連續(xù)測(cè)3d。

1.2.2攻毒前后體溫測(cè)定 免疫后第14d攻毒，用無(wú)菌生理鹽水將每頭份豬瘟脾淋苗稀釋150倍，通過(guò)耳靜脈注射給每組家兔，攻毒劑量為1mL/只，攻毒前2d和攻毒當(dāng)天上、下午各測(cè)體溫1次，攻毒24h后，每隔6h測(cè)體溫1次，連續(xù)測(cè)3d至體溫恢復(fù)正常。

1.2.3攻毒后脾重/體重指數(shù) 將攻毒后體溫恢復(fù)正常的家兔稱重、解剖取脾臟稱重，計(jì)算脾重/體重指數(shù)比（%），通過(guò)圖表說(shuō)明rAd-E0-E2受保護(hù)組與未受保護(hù)組的差異情況，同時(shí)做脾臟切片，觀察脾臟的病理變化。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)脾臟中豬瘟脾淋毒 取各組家兔脾臟用勻漿器充分研磨，按柱式動(dòng)物RNAout提取試劑盒提取RNA，以豬瘟脾淋苗特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)脾臟中的豬瘟脾淋疫苗毒，進(jìn)一步證明rAd-E0-E2的保護(hù)效力［12-14］。

1.2.5IFA分離鑒定脾臟中豬瘟脾淋毒 取各組家兔脾臟加PBS（含雙抗）低溫下充分研磨，組織懸液離心后經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾。同時(shí)，將豬睪丸細(xì)胞系（ST細(xì)胞）鋪平于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%單層時(shí)，接種過(guò)濾的懸液，盲傳3代。將ST細(xì)胞用冷丙酮2℃～8℃固定30min，1×PBS洗滌3次，將1∶300稀釋的豬瘟病毒特異性抗體加到固定好的ST細(xì)胞上，37℃孵育1h，1×PBS洗滌3次，再加1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG，37℃孵育1h，1×PBS洗滌3次，6孔板中每個(gè)孔加適量500 mL/L甘油，在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果［15］。

2　結(jié)果

2.1免疫前、免疫后實(shí)際測(cè)溫結(jié)果

按照1.1的方法進(jìn)行實(shí)際測(cè)溫，將結(jié)果繪制時(shí)間-體溫曲線（圖1），從圖1中可以看出，免疫前各組家兔體溫波動(dòng)不大；用rAd-E0-E2（107.0、106.0、105.0IFU）免疫組家兔體溫在正常范圍內(nèi)，用豬瘟脾淋苗免疫組家兔出現(xiàn)兔體反應(yīng)熱（≥40.5℃）與常規(guī)豬瘟脾淋苗檢測(cè)結(jié)果一致［16］。

圖1　免疫前后實(shí)際測(cè)溫Fig.1 Actual temperature detected before and after immunization

2.2rAd-E0-E2對(duì)免疫兔的保護(hù)作用

免疫14d后，各組兔子用豬瘟脾淋苗攻毒，將實(shí)際測(cè)溫情況繪制時(shí)間-體溫曲線（圖2），從圖2中可以看出，攻毒前2d各組免疫兔體溫在正常波動(dòng)范圍內(nèi)（＜40.5℃），攻毒后107.0IFU組（0/4）和豬瘟脾淋苗組（0/4）均未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，106.0IFU組（3/4）出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，105.0IFU（4/4）出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，對(duì)照組（4/4）出現(xiàn)定型熱反應(yīng)［17-18］。

圖2　用豬瘟脾淋毒攻毒后免疫兔產(chǎn)生的定型熱反應(yīng)Fig.2 Fever reactions of the immunized rabbits following challenge with CSF spleen virus

2.3攻毒后脾重/體重指數(shù)

經(jīng)脾重/體重指數(shù)比分析發(fā)現(xiàn)（圖3），107.0IFU組與105.0IFU組、107.0IFU組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；豬瘟脾淋苗組與105.0IFU組、豬瘟脾淋苗組與對(duì)照組異顯著（P＜0.05）；然而，107.0IFU組與106.0IFU組、107.0IFU組與豬瘟脾淋苗組、106.0IFU組與105.0IFU組、106.0IFU組與豬瘟脾淋苗組、106.0IFU組與對(duì)照組、105.0IFU組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3　脾重/體重指數(shù)比Fig.3 Percentage of spleen weight/body weight

2.4脾臟病理組織學(xué)觀察

將攻毒后體溫趨于正常的兔子剖檢，取脾臟做石蠟切片，顯微鏡下觀看脾臟病理組織變化（圖4）。107.0IFU組（圖4A）攻毒后脾組織切片未見(jiàn)充血、淤血；106.0IFU組（圖4B）攻毒后脾組織切片未見(jiàn)充血、淤血，而106.0IFU組（圖4C）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴(yán)重；105.0IFU組（圖4D）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴(yán)重；豬瘟脾淋苗組（圖4E）攻毒后脾組織切片未見(jiàn)充血、淤血；對(duì)照組（圖4F）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴(yán)重。

2.5RT-PCR檢測(cè)攻毒后免疫兔脾臟內(nèi)豬瘟脾淋毒病毒

以豬瘟脾淋苗特異性引物為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，107.0IFU組（0/4）和豬瘟脾淋苗組（0/4）攻毒后均未檢測(cè)到豬瘟脾淋苗病毒，對(duì)照組（4/4）均檢測(cè)到豬瘟脾淋苗病毒；106.0IFU組（3/4）能檢測(cè)到豬瘟脾淋苗病毒、105.0IFU組（4/4）均檢測(cè)到豬瘟脾淋苗病毒（表1）。

圖4　不同組脾臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果（HE，200×）Fig.4 Histopathological observation results of spleen in different groups（HE，200×）

表1　RT-PCR檢測(cè)豬瘟脾淋毒病毒Table 1 RT-PCR detection of CSF spleen virus

2.6IFA分離鑒定脾臟中豬瘟脾淋毒

間接免疫熒光（IFA）結(jié)果顯示，107.0IFU組（圖5A）和豬瘟脾淋苗組（圖5E）均未出現(xiàn)特異性綠色熒光（0/4）；而對(duì)照組（圖5F）均出現(xiàn)特異性綠色熒光（4/4）；106.0IFU組（圖5B）能起保護(hù)作用的兔子IFA檢測(cè)未出現(xiàn)特異性綠色熒光（1/4），而106.0IFU組（圖5C）沒(méi)有能起保護(hù)作用的兔子IFA檢測(cè)出現(xiàn)特異性綠色熒光（3/4）；105.0IFU組（圖5D）IFA檢測(cè)出現(xiàn)特異性綠色熒光（4/4）。

3　討論

本研究是在前期已經(jīng)構(gòu)建的表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）的基礎(chǔ)上，以SPF家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)測(cè)兔體定型熱反應(yīng)、脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學(xué)變化等免疫學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)共同評(píng)價(jià)了rAd-E0-E2在兔上的免疫保護(hù)效力。

圖5　不同組脾臟IFA特異性鑒定（200×）Fig.5 Specificity identification of spleens in different groups by indirect IFA（200×）

通過(guò)以上方法比較分析發(fā)現(xiàn)，107.0IFU組和豬瘟脾淋苗組均未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)（0/4）；脾組織切片未見(jiàn)充血、淤血；用RT-PCR和IFA方法均未檢測(cè)到兔子脾臟內(nèi)豬瘟脾淋苗病毒，說(shuō)明rAd-E0-E2 （107.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中起到保護(hù)作用（4/4）。106.0IFU組出現(xiàn)定型熱反應(yīng)（3/4）；相對(duì)應(yīng)的兔脾組織切片可見(jiàn)充血、淤血（3/4）；用RTPCR和IFA方法可檢測(cè)到對(duì)應(yīng)兔子脾臟內(nèi)豬瘟脾淋苗病毒（3/4），說(shuō)明rAd-E0-E2（106.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中起到保護(hù)作用（1/4）。105.0IFU組和對(duì)照組全部出現(xiàn)定型熱反應(yīng)（4/4）；脾組織切片充血、淤血嚴(yán)重（4/4）；用RT-PCR和IFA方法均可檢測(cè)到兔子脾臟內(nèi)豬瘟脾淋苗病毒（4/4），說(shuō)明rAd-E0-E2（105.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中沒(méi)有起到保護(hù)作用（0/4）。以上結(jié)果進(jìn)一步分析表明，rAd-E0-E2可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生豬瘟特異性免疫，此抗體在最小免疫保護(hù)劑量是107.0IFU時(shí)對(duì)豬瘟脾淋苗病毒攻擊具有保護(hù)作用。試驗(yàn)中脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學(xué)變化檢測(cè)結(jié)果與家兔體溫反應(yīng)結(jié)果一致，四種試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果可以有效地對(duì)體溫反應(yīng)可疑或者輕熱的家兔進(jìn)行判定，避免了體溫反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的不確定性。本試驗(yàn)結(jié)果的一致性為四種試驗(yàn)方法用于rAd-E0-E2在家兔上的免疫原性分析提供有力依據(jù)。

根據(jù)中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程（2000版）和中華人民共和國(guó)獸藥典（2010年版）規(guī)定，現(xiàn)行的豬瘟疫苗免疫效力檢驗(yàn)主要依靠家兔或豬進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)［19-20］。因用豬進(jìn)行檢驗(yàn)成本太高、不易操作、耗時(shí)長(zhǎng)，故在生產(chǎn)實(shí)際中多采用兔體定型熱反應(yīng)，但是兔體定型熱反應(yīng)仍然存在試驗(yàn)耗時(shí)、操作繁瑣、重復(fù)性較差、敏感性較低等缺點(diǎn)，且受試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、環(huán)境因素等多方面影響，因此本試驗(yàn)通過(guò)比較rAd-E0-E2家兔體溫反應(yīng)熱與脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織變化檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，給出了脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學(xué)變化等方法用于rAd-E0-E2在家兔上的免疫原性分析的可行性。本研究依然采用家兔進(jìn)行效檢，同時(shí)用以上四種方法進(jìn)行驗(yàn)證，避免了傳統(tǒng)方法因家兔質(zhì)量和環(huán)境等因素對(duì)體溫檢測(cè)結(jié)果的影響，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

本試驗(yàn)通過(guò)表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體上的免疫原性分析，不僅能夠檢驗(yàn)rAd-E0-E2的保護(hù)效力，還確定出最小免疫保護(hù)劑量，有利于rAd-E0-E2效力質(zhì)量檢測(cè)應(yīng)用，更對(duì)后期的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)工藝優(yōu)化具有積極的評(píng)價(jià)指導(dǎo)作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Immunogenicity Analysis of Recombinant Adenoviruses Expressing E0-E2 Genes of Classical Swine Fever Virus Vaccine in Rabbits

ZHANG Xiao-miao1，2，ZHANG Heng2，YANG Yu-ai1，ZHANG Zhi3，
SUN Jian2，TAO Xiao-shan2，LI Xiao-cheng3，F(xiàn)AN Gen-cheng2，SUN Yong-ke1
（1.College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan，650201，China；
2.Key Laboratory for Animal Vaccine of Shandong Province，YEBIO Bioengineering Co.Ltd of Qingdao，
Qingdao，Shandong，266114，China；3.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong，266032，China）

Abstract：Study on the immunogenicity of recombinant adenoviruses expressing E0-E2genes of classical swine fever virus vaccine（rAd-E0-E2）in rabbits and determination of the minimum vaccination dose were conducted.Ten-fold dilution of rAd-E0-E2into 107.0IFU，106.0IFU，105.0IFU was made.Rabbits were vaccinated by each dilution and challenged with CSF spleen vaccine virus 14dpi.In group 107.0IFU and group CSF spleen vaccine，there were no Stereotypia thermal response（0/4），the mean value of spleen weight/ body weight in both groups were respectively 0.055%，0.05%，the histopathologic examination of the spleens turned out without hyperemia or congestion.There was no CSF spleen vaccine virus detected by RT-PCR and IFA methods；In Group 106.0IFU，3/4rabbits showed Stereotypia thermal response，the mean value of spleen weight/body weight was 0.074%，the histopathologic examination of the spleens showed 3/ 4hyperemia or congestion.3/4CSF spleen vaccine virus is detected by RT-PCR and IFA methods；In Group 105.0IFU and the control group，all appeared Stereotypia thermal response（4/4），the mean values of spleen weight/body weight in both were respectively 0.099%，0.102%，the histopathologic examination of the spleens showed serious hyperemia and congestion，CSF spleen vaccine virus was detected by RT-PCR and IFA methods.Compared to the control group，which offers 0% protection and group CSF spleen vaccine，which offers 100% protection，the minimum vaccination dose of rAd-E0-E2to protect the rabbit is 107.0IFU.This study successfully completed the immunogenicity analysis of rAd-E0-E2and detemined the minimum vaccination dose in rabbits.

Key words：Classical swine fever virus；E0-E2gene；recombinant adenovirus vaccine；rabbit；immunogenicity

作者簡(jiǎn)介：張小苗（1989-），女，云南保山人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。張 恒（1987-），男，山東新泰人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)與新型動(dòng)物疫苗研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助（A3007954）

收稿日期：2015-07-09

中圖分類號(hào)：S852.651

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）09-0008-05