張柱霞，孫明英，楊　潔，姜樹(shù)原，劉　友，閆少春，邵　國(guó)（包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭014010）

5-Aza-CdR和低氧對(duì)小鼠海馬中蛋白磷酸酶-1γ表達(dá)及對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響

張柱霞△，孫明英△，楊潔，姜樹(shù)原，劉友，閆少春，邵國(guó)＊
（包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭014010）

摘 要：通過(guò)使用去甲基化試劑5-氮-2'脫氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-Aza-CdR）和低氧處理小鼠，從而揭示低氧和5-Aza-CdR對(duì)蛋白磷酸酶1γ（protein serine/threonine phosphatase-1γ，PP1γ）表達(dá)的影響以及對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。水迷宮篩選小鼠，正常小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組2組，分別給小鼠大腦立體定位注射10g/L BSA和10μmol/L 5-Aza-CdR至右側(cè)腦室，休息1周，水迷宮測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力情況，然后依次處死低氧后3、2、1、0d的小鼠。最后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)蛋白磷酸酶1的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。5-Aza-CdR和低氧分別處理小鼠都會(huì)提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制PP1γmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但是聯(lián)合處理對(duì)小鼠的PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平卻沒(méi)有影響。說(shuō)明5-Aza-CdR和低氧抑制PP1γ的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)小鼠海馬區(qū)突觸可塑性的形成。

關(guān)鍵詞：蛋白磷酸酶1；5-Aza-CdR；低氧；小鼠；學(xué)習(xí)記憶

低氧/缺血（I/H）是目前臨床上最常見(jiàn)的病癥，也是各種疾病致死的原因，糖尿病［1］、腦梗死［2］、高血壓［3］、腦中風(fēng)［4-6］等老年人病都是由于I/H造成死亡的相關(guān)疾病。I/H 不僅嚴(yán)重威脅著老年人的身體

健康，現(xiàn)在也對(duì)嬰幼兒［7-9］的健康造成了一定的威脅。高原反應(yīng)也是一種常見(jiàn)的低氧反應(yīng)［10-11］。腦是I/H最容易受傷的部位，因此我們研究對(duì)象選擇了小鼠海馬。

蛋白磷酸酶1（protein serine/threonine phosphatase-1，PP1）是一種可以催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的酶分子［12］，與蛋白激酶相互依存，共同構(gòu)成了去磷酸化和磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性開(kāi)關(guān)調(diào)控系統(tǒng)。作為一種重要的高度保守的蛋白磷酸酶之一［13］，PP1由PP1α，PP1β/δ和PP1γ 3種相關(guān)基因編碼，相關(guān)研究表明80%以上蛋白質(zhì)的去磷酸化反應(yīng)是由PP1α和PP1γ操縱的［14］。PP1γ在新陳代謝中發(fā)揮著重要的作用［15］，與PKA等共同構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)糖原代謝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在功能上表現(xiàn)出與PKA相互拮抗的生理效應(yīng)，即抑制糖原的分解代謝、加速糖原的合成。我們前期的研究表明PP1γ啟動(dòng)子區(qū)含有豐富的GC，影響PP1γ啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的表達(dá)［15］。海馬組織是大腦對(duì)I/H最為敏感的部位，本研究利用小鼠模型，研究成年小鼠海馬組織中PP1γ的變化，并探討小鼠突觸可塑性的形成是否與PP1γ啟動(dòng)子區(qū)甲基化的表達(dá)有關(guān)。

核苷酸類(lèi)似物5-Aza-CdR作為去甲基化試劑［16］，可以抑制PP1γ啟動(dòng)區(qū)甲基化，因此研究PP1γ在神經(jīng)發(fā)育和分化、突觸可塑性，學(xué)習(xí)記憶以及維持神經(jīng)元的生存等相關(guān)基因的表達(dá)方面具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠 18g～22g雄性昆明小鼠60只（6周～8周），購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2試劑和設(shè)備 大腦立體定位儀，瑞沃德生命科學(xué)技術(shù)（深圳中國(guó)）有限公司；水迷宮，包頭醫(yī)學(xué)院解剖實(shí)驗(yàn)室提供；Real-time PCR儀，7900HT，ABI公司產(chǎn)品；5-Aza-CdR，Sigma公司產(chǎn)品；Trizol，TaKaRa公司產(chǎn)品；Superscript III，Invitrogen公司產(chǎn)品；2× Real-time PCR Mix，南京凱基公司產(chǎn)品；其余試劑為國(guó)產(chǎn)試劑。手術(shù)器材和麻醉劑等其他均由解剖實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1小鼠大腦立體定位注射5-Aza-CdR 10g/L戊巴比妥納麻醉小鼠，固定于大腦立體定位注射儀器上，頭頂部去毛，消毒皮膚，在頭頂部正中切口，暴露前囟，依據(jù)小鼠立位圖譜，于前囟后0.5mm，中線(xiàn)右側(cè)1mm，微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針2.5mm，試驗(yàn)組向右側(cè)腦室緩慢注入5μL10μmol/L的5-Aza-CdR，每次注射時(shí)間為5min，留針2min，緩慢退針。皮膚切口處用青霉素抗菌，縫合傷口。對(duì)照組注射等體積的10g/L的BSA。

1.2.2Morris水迷宮小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定 水迷宮為直徑130cm、高50cm的圓形水池，水深30 cm，用加熱器使水溫保持在22℃～26℃，池壁上有4根支柱，它們把水池等分為四個(gè)象限，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，在第Ⅰ象限正中間放置一個(gè)圓形透明的平臺(tái)，保證平臺(tái)頂部低于水面1cm（圖1）。測(cè)定小鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間。4次訓(xùn)練小鼠分別從4個(gè)不同的象限入水點(diǎn)入水，如果小鼠在2min之內(nèi)找到平臺(tái)的記錄到達(dá)的時(shí)間，并讓其在平臺(tái)上記憶20s，2 min內(nèi)未找到平臺(tái)的，需將其引導(dǎo)到平臺(tái)，也讓其學(xué)習(xí)記憶20s，這時(shí)潛伏期記為120s。

試驗(yàn)歷時(shí)8d，第1天進(jìn)行小鼠的篩選試驗(yàn)，選擇出那些普通的小鼠（既不是很聰明也不笨的小鼠）。大腦立體定位注射完成之后連續(xù)學(xué)習(xí)5d，隔天再進(jìn)行最后的測(cè)試。

圖1　小鼠水迷宮裝置Fig.1 Water maze device in mice

1.2.3定量PCR 使用Trizol提取總RNA，Nondrop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量。SuperscriptⅢ試劑盒（Invitrogen公司）逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20℃保存。引物由Invitrogen公司合成，引物序列如表1。使用ABI公司的96孔板，依次加入cDNA 1μL，1μL的引物，無(wú)菌水8μL，Mix 10μL，在ABI7900HT Real-time PCR反應(yīng)儀上反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)空。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃3min；92℃30s，59℃30s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min停止反應(yīng)。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)結(jié)果以-x±SD表示，用SPSS10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA和Tukey對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以P＜0.05為顯著差別的界限。

2　結(jié)果

2.1重復(fù)低氧可以增加小鼠在低氧條件下的耐受時(shí)間

小鼠低氧耐受時(shí)間隨著低氧次數(shù)的增加而成倍的增長(zhǎng)，即低氧預(yù)適應(yīng)可以提高小鼠的耐受時(shí)間（圖2）。

圖2　小鼠不同低氧次數(shù)的耐受時(shí)間記錄Fig.2 Tolerance time records of hypoxia in mice

2.2小鼠大腦立體定位注射5-Aza-CdR 2d后水迷宮測(cè)試結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)注射亞甲基藍(lán)結(jié)果證明操作能夠成功準(zhǔn)確的注射藥物到達(dá)小鼠側(cè)腦室（圖3），使后期的試驗(yàn)可以順利開(kāi)展。與對(duì)照組相比，注射5-Aza-CdR組的小鼠能夠在更短的時(shí)間內(nèi)找到隱藏的平臺(tái)逃生。而且隨著學(xué)習(xí)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)到達(dá)平臺(tái)（圖4）。

圖3　小鼠側(cè)腦室注射亞甲基藍(lán)溶液Fig.3 Methylene blue was injected into tricorn of mouse

圖4　不同處理的小鼠找到平臺(tái)時(shí)間記錄Fig.4 Find platform time records in different treatments of mice

2.3低氧對(duì)小鼠海馬中PP1mRNA表達(dá)的影響

PP1γmRNA相對(duì)豐度以delta-delta CT值表示，低氧使小鼠PP1γ轉(zhuǎn)錄水平降低，而且隨著低氧后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)PP1γ轉(zhuǎn)錄水平降低（圖5）。

圖5　低氧對(duì)小鼠海馬PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 PP1γmRNA expression levels of hippocampus in hypoxia mice

2.4低氧對(duì)5-Aza-CdR處理過(guò)的小鼠海馬PP1γ轉(zhuǎn)錄水平的影響

注射5-Aza-CdR的小鼠海馬PP1γ表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P≤0.05）。單純的低氧使小鼠海馬PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，但是側(cè)腦室注射了5-Aza-CdR后再低氧PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平基本沒(méi)變化（圖6）。

圖6　低氧和5-Aza-CdR對(duì)小鼠海馬PP1轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 PP1γtranscriptional levels in mice treated by hypoxia and 5-Aza-CdR

3　討論

Janssen最早對(duì)高海拔引起認(rèn)知功能下降有報(bào)道，在攀登Mont-Blanc過(guò)程中出現(xiàn)了對(duì)呼吸深度調(diào)節(jié)，手指運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性等認(rèn)知能力下降的情況。后期大量高山探險(xiǎn)活動(dòng)中出現(xiàn)的有關(guān)高海拔對(duì)情緒、認(rèn)知和知覺(jué)的改變相繼被報(bào)道。而且低氧環(huán)境對(duì)機(jī)體作業(yè)能力及認(rèn)知能力的影響引起了醫(yī)學(xué)研究的關(guān)注。低氧很容易引起情緒躁動(dòng)不安和活動(dòng)量增大［17］，從而使體內(nèi)的氧迅速被消耗，小鼠達(dá)到死亡點(diǎn)的時(shí)間縮短。劇烈運(yùn)動(dòng)和焦躁的情緒會(huì)使體內(nèi)代謝加快，耗氧量增加，重復(fù)低氧使小鼠產(chǎn)生記憶，停止劇烈的運(yùn)動(dòng)，減少能量的消耗，為其維持基本生命活動(dòng)所必須的糖和氧。而低氧預(yù)適應(yīng)則會(huì)提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶和空間識(shí)別能力［18］。圖3的結(jié)果證明了這一結(jié)論。也說(shuō)明了小鼠也有一定的學(xué)習(xí)記憶的能力，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)的低氧，小鼠大腦內(nèi)對(duì)其存在了記憶，均勻的呼吸，安靜的呆著，從而減少氧的消耗，延長(zhǎng)了存活時(shí)間。

有研究報(bào)道，DNA甲基化在神經(jīng)發(fā)育和分化，突觸可塑性，學(xué)習(xí)記憶以及維持神經(jīng)元的存在等相關(guān)基因的表達(dá)方面具有重要作用［19-20］，催化DNA甲基化的酶為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。DNA復(fù)制過(guò)程中核苷酸類(lèi)似物5-Aza-CdR可以與DNMTs共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物從而抑制其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。先前的研究表明，PP1γ啟動(dòng)子區(qū)符合CpG島特征。因此本試驗(yàn)通過(guò)使用PP1γ啟動(dòng)子區(qū)甲基化抑制劑，研究PP1γ與突觸可塑性的形成是否與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)。水迷宮多被用于從事動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)研究。隱藏平臺(tái)獲得試驗(yàn)中，逃避潛伏期反映小鼠學(xué)習(xí)能力的變化。圖4的結(jié)果證明了上述的猜想，5-Aza-CdR注射到小鼠側(cè)腦室，抑制了PP1γ啟動(dòng)子區(qū)的甲基化的發(fā)生，使其啟動(dòng)子區(qū)甲基化表達(dá)降低，同時(shí)5-Aza-CdR注射組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間低于正常小鼠，因此PP1γ參與學(xué)習(xí)記憶極有可能是其啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控的。糖和氧的持續(xù)供應(yīng)是維持細(xì)胞新陳代謝和正常功能所必須的，低氧引起ATP產(chǎn)生不足而使細(xì)胞受到損傷。因此，I/ H環(huán)境下細(xì)胞存活的關(guān)鍵是避免ATP的快速下降，而神經(jīng)細(xì)胞可以通過(guò)改變基因表達(dá)而改變其代謝策略使細(xì)胞在特殊環(huán)境下而生存。PP1γ在神經(jīng)細(xì)胞能量代謝中有重要的作用，PP1γ轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游有一段300bp的GC含量高達(dá)79%的區(qū)域，控制著PP1的轉(zhuǎn)錄。我們前期的研究顯示低氧預(yù)適應(yīng)過(guò)程中PP1γ磷酸酶的活力可能降低［21］。PP1靶蛋白之一的環(huán)腺苷酸應(yīng)答原件結(jié)合蛋白（CREB）在神經(jīng)細(xì)胞功能中有重要的作用，CREB的功能的變化是通過(guò)其絲氨酸（Ser-133）磷酸化變化實(shí)現(xiàn)的，而其絲氨酸的去磷酸化作用是由PP1調(diào)節(jié)的，一些與新陳代謝相關(guān)基因，如Bcl-2等通過(guò)CREB參與到低氧或氧化抑制條件下的神經(jīng)保護(hù)，利用急性低氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型發(fā)現(xiàn)小鼠海馬CREB的磷酸化水平升高［22］。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與其相對(duì)應(yīng)，低氧會(huì)降低PP1γ轉(zhuǎn)錄水平（圖6）。

低氧和5-Aza-CdR都對(duì)PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用，而且都會(huì)促進(jìn)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但是聯(lián)合5-Aza-CdR和低氧處理小鼠，其PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化。

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Effects of Hypoxia and 5-Aza-CdR on Protein Phosphatase1γExpressed in Hippocampus and Learning and Memory in Mice

ZHANG Zhu-xia，SUN Ming-ying，YANG Jie，JIANG Shu-yuan，LIU You，YAN Shao-chun，SHAO Guo
（Biomedicine Research Center of Baotou Medical College，Baotou，Inner Mongolia，014010 China）

Abstract：The aim of this study was to detect the effect of 5-aza-2'deoxycytidine（5-Aza-CdR）and hypoxia tolerance on protein phosphatase1γ，and then explore the relationship between the memory and learning in mice.The mice were screened by water maze，the ordinary mice were randomly divided into groups：control mice injected with 10g/L BSA and experimental mice injected with 10μmol/L 5μL 5-Aza-CdR，and then they were tested in water maze，and treated by hypoxia，and last they were euthanasia after one/two/there day hypoxia.The hippocampis were taken，and the mRNA levels of protein phosphatase-1γwere measured. The results showed that 5-Aza-CdR and hypoxia can up-regulated the ability of learning and memory，down-regulated the PP1γmRNA level，but unchanged if 5-Aza-CdR and hypoxia acted on mice if them were treated at the same time.PP1γmRNA levels were inhibited by 5-Aza-CdR and hypoxia，the formation of synaptic plasticity was promoted.

Key words：protein phosphatase1γ；5-Aza-CdR；hypoxia；mouse；learning and memory

作者簡(jiǎn)介：張柱霞（1988-），女，山東莘縣人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究。孫明英（1990-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究。△同等貢獻(xiàn)作者。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81060212，81160244，81360316，81460283）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010BS1104；2014MS0810）；中國(guó)博士后基金項(xiàng)目（20080430851）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（NJZY12221，NJZY12225）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計(jì)劃資助（NJYT-13-A10）；研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（S201410127（Y02））；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金（46批）

收稿日期：2015-05-11

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.23

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）09-0059-05