楊　媛，朱艷平，岳　鋒，孫國(guó)鵬，張艷芳，銀　梅，王選年＊（.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，生命科學(xué)與技術(shù)系，河南新鄉(xiāng)453003；.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

豬PD-1胞外區(qū)基因的克隆及原核表達(dá)

楊媛1，2，朱艷平1，岳鋒1，孫國(guó)鵬1，張艷芳1，銀梅2，王選年1＊
（1.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，生命科學(xué)與技術(shù)系，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

摘 要：為研究PD-1/PD-L1通路在豬免疫抑制性疾病中的作用，根據(jù)豬的PD-1的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增其胞外區(qū)的引物，從豬PBMC基因組中通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得豬PD-1胞外區(qū)基因片段，測(cè)序正確后克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+），構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32-PD1，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。挑選可疑菌落鑒定正確后轉(zhuǎn)至Rosetta（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果表明，在37℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)獲得33ku的PD-1胞外區(qū)融合蛋白，能夠被其多抗血清、His標(biāo)簽抗體和人PD-1抗體所識(shí)別。本研究為制備其單克隆抗體和研究PD-1/PD-L1在豬免疫抑制性疾病中的作用提供了材料。

關(guān)鍵詞：豬PD-1；胞外區(qū)；克??；原核表達(dá)

程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）基因編碼一個(gè)分子質(zhì)量50ku～55ku的Ⅰ型跨膜糖基化表面受體蛋白，其細(xì)胞外區(qū)為免疫球蛋白樣V區(qū)，胞質(zhì)區(qū)含免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序，這些結(jié)構(gòu)表明PD-1為抑制性調(diào)節(jié)分子［1］。早期被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡有關(guān)而被命名為PD-1［2］。PD-1主要在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)。PD-1的配體（PD-L）有兩種類(lèi)型，分別為PD-L1和PD-L2［1］。PD-1/PD-L1通路在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

PD-1與其配體PD-L1結(jié)合，并不引起T細(xì)胞凋亡，而是使大多數(shù)細(xì)胞被阻滯在細(xì)胞增殖周期G0時(shí)相，限制了進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)［3］，降低了T細(xì)胞受體介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒作用［4-5］，同時(shí)也影響很多細(xì)胞因子分泌，如下調(diào)IL-2和IFN-γ的分泌［6］，在一定程度上下調(diào)了機(jī)體的免疫應(yīng)答。在阻斷PD-1/PD-L通路后，效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量增加、功能加強(qiáng)［7-10］。基于上述理論研制PD-1單抗為許多疾?。ㄈ缒[瘤、自身免疫疾?。┑闹委熗貙捔送緩?。

本研究旨在獲得豬PD-1胞外區(qū)基因片段，將其克隆入原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，為制備其單克隆抗體和探討其在豬免疫抑制性疾病中的作用積累資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和載體 E.coli DH5α、Rosetta（DE3）菌株和原核載體pET-32a（+）均由新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T simple vector，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.2試劑 淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；ExTaq酶、dNTP、T4-DNA連接酶、EcoRⅠ和XhoⅠ，TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，TIANGEN公司產(chǎn)品；Amp，IPTG，Solarbio公司產(chǎn)品；瓊脂糖、酵母提取物和蛋白胨，OXOID公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、鼠Anti His Tag單克隆抗體及AEC顯色試劑盒，北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；ProteinPure-Ni-NTA Resin，北京全式金公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的豬PD-1基因序列（NM-001204379.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增其胞外區(qū)的366bp的特異性引物：PD-L1F：5′-CGGAATTC CTGCTAGATGCTCCGAGC-3′（含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），PD-L1R：5′-CCCTCGAG TAAGTAGCTTTCGGGCCT-3′（含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2豬淋巴細(xì)胞總RNA的提取 豬耳緣靜脈采血，按照淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)分離淋巴細(xì)胞，然后按Trizol法提取總RNA。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄 總RNA 10μL，隨機(jī)引物1μL，dNTP 1μL，混勻，75℃5min，然后加入RNA酶抑制劑1μL，反轉(zhuǎn)錄酶1μL，buffer 4μL，DEPC水2μL，混勻，25℃10min，42℃1h，70℃10min，4℃保存。1.2.4 目的基因片段擴(kuò)增與純化 以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因片段，PCR反應(yīng)體系：dNTP（2.5 mmol/L）2μL，ExTaq buffer 2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ExTaq 酶0.2μL，cDNA 0.5μL，ddH2O 18.8μL，混勻；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，29個(gè)循環(huán)；72℃，10min后4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA回收試劑盒回收目的片段。

1.2.5PD-L1胞外區(qū)基因片段的鑒定 將回收純化的產(chǎn)物連接pMD18-T-simple載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選出陽(yáng)性可疑菌落，菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的的質(zhì)粒命名為pMD-PD1。

1.2.6表達(dá)PD-L1胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)質(zhì)粒pMD-PD1及原核表達(dá)載體pET32a（+）進(jìn)行雙酶切，T4-DNA連接酶連接純化回收的酶切產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定篩選出陽(yáng)性可疑菌落，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的的質(zhì)粒命名為pET32-PD1。

1.2.7pET32-PD1在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-PD1轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rosetta中，挑取陽(yáng)性克隆接種于含100mmol/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)至OD 600nm為0.4～0.6后，加入終濃度分別為0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6h后收集菌體，用100μL PBS重懸，再加入100μL 2×SDS Loading buffer，混勻，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.8表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，12 000r/min離心1min，沉淀用200μL PBS重懸，超聲波破碎后，12 000r/min離心1min，保留上清。沉淀再次用100μL PBS重懸，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.9蛋白純化 對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，收獲菌體，棄上清液，包涵體沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，超聲波破碎20 min。于4℃，5 000r/min離心20min，棄上清。用含尿素溶解緩沖液溶解沉淀，于4℃、12 000r/min離心20 min，收集上清，用0.4μm濾膜過(guò)濾上清。依照ProteinPure-Ni-NTA Resin親和柱的操作手冊(cè)，進(jìn)行蛋白純化

1.2.10Western blot分析 將表達(dá)的目的蛋白純化后免疫接種小鼠，50μg/只，免疫4次后制備其多抗血清。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上。用50g/L脫脂奶粉封閉過(guò)夜，TBST洗3次，每次5min，加入一抗（抗豬PD-1血清、His標(biāo)簽單抗或抗人PD-1抗體），37℃孵育2h，同上洗滌，加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 37℃孵育1h，同上洗滌，加AEC顯色劑顯色，用水終止反應(yīng)，觀察。

2　結(jié)果

2.1pET32-PD-1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用PD-1胞外區(qū)擴(kuò)增引物以豬PBMC cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在366bp處有特異性DNA條帶，大小與預(yù)期相符，測(cè)序證明為PD-1胞外區(qū)基因序列（圖1），連接載體后，挑取單菌落經(jīng)菌液PCR檢測(cè)、雙酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32-PD1（圖2），酶切出現(xiàn)的中間一條帶是由于質(zhì)粒提取過(guò)程中螺旋結(jié)構(gòu)部分遭到破壞所致。

2.2pET32-PD1誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PD1轉(zhuǎn)化至Rosetta表達(dá)宿主菌，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量為33ku，與預(yù)期的大小一致，經(jīng)超聲裂解處理的樣品，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示沉淀中含有大量的目的蛋白（圖3），說(shuō)明目的蛋白的表達(dá)形式是包涵體。對(duì)pET-PD1重組目的蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ProteinPure-Ni-NTA Resin柱層析純化后得到純化蛋白（圖4）。

圖1　豬PD-1胞外區(qū)PCR產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 Analysis of PCR products of porcine PD-1

圖2　重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PD1的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant expression plasmid pET-PD1by EcoRⅠand XhoⅠdigestion

2.3Western blot檢測(cè)

Western blot結(jié)果見(jiàn)圖5，結(jié)果表明表達(dá)的目的蛋白分別與抗豬PD-1血清、His標(biāo)簽單抗和抗人PD-1抗體在約33ku處出現(xiàn)了特異的條帶。證明成功誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

3　討論

根據(jù)GenBank中豬PD-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR方法克隆了PD-1胞外區(qū)的基因序列，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-PD1，重組蛋白能夠被抗豬PD-1抗體、His標(biāo)簽抗體和抗人PD-1抗體識(shí)別，且多抗不與載體蛋白反應(yīng)，說(shuō)明目的蛋白得到很好的表達(dá)且有良好的反應(yīng)原性。Western blot結(jié)果中A和B圖第2條泳道是未誘導(dǎo)的蛋白，但也有少量的蛋白，所以也有顯色反應(yīng)。本研究選用的大腸埃希菌表達(dá)載體pET-32a（+），pET32-PD1是一個(gè)融合表達(dá)載體質(zhì)粒，所表達(dá)蛋白帶有His標(biāo)簽，所以PD-1蛋白能與標(biāo)簽抗體結(jié)合；另外豬的PD-1與人的PD-1氨基酸同源性是63%，而且分子結(jié)構(gòu)也相似，在胞外區(qū)都含有IgV樣結(jié)構(gòu)域，在胞質(zhì)尾部都有兩個(gè)免疫調(diào)控基序，所以獲得的PD1融合蛋白能與抗人PD-1抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖3　pET32-PD1表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of pET32-PD1products by SDS-PAGE

圖4　重組目的蛋白PD-1的純化Fig.4 Analysis of purificated recombinant PD-1protein by SDS-PAGE

圖5　pET32-PD1表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析Fig.5 Analysis of the expression of recombinant plasmid pET32-PD1by Western blot

PD-1及配體的研究在人和鼠方面的研究比較多，如PD-1缺乏的小鼠可導(dǎo)致小鼠自主免疫的擴(kuò)大性心肌病［11-12］；人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染可選擇性下調(diào)被感染細(xì)胞的PD-1的表達(dá)［13］；PD-1/PDL1信號(hào)途徑與自身免疫性腦脊髓炎和肥胖型糖尿病小鼠的胰島素分泌密切相關(guān)［14-15］等。但是一些病原引起豬的持續(xù)性感染和免疫抑制［16-19］是否與PD-1/PD-L1密切相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道還很少。本實(shí)驗(yàn)室建立了mRNA水平檢測(cè)PD-1及配體的熒光定量PCR方法，并檢測(cè)到在豬瘟病毒感染不同階段PD-1及其配體表達(dá)量的變化，在豬瘟病毒感染后第7天PD-1及其配體表達(dá)量顯著升高，隨著病毒量的減少PD-1及其配體的表達(dá)量會(huì)緩慢下降并維持在正常水平（本實(shí)驗(yàn)室尚未發(fā)表），說(shuō)明豬PD-1及其配體與病毒感染有一定的關(guān)系，這些數(shù)據(jù)對(duì)本試驗(yàn)的開(kāi)展提供了前提依據(jù)。

PD-1/PD-L1通路對(duì)獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度起負(fù)調(diào)節(jié)作用，這種作用對(duì)機(jī)體而言可以降低免疫反應(yīng)對(duì)組織的損害，是一種自我保護(hù)作用，但是一些病原微生物利用此通路來(lái)逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答，使機(jī)體處于長(zhǎng)期的持續(xù)性感染狀態(tài)，因此，阻斷PD-1/ PD-L1信號(hào)通路有望成為治療自身免疫性疾病、病毒性疾病和腫瘤等的新策略［20-22］。本試驗(yàn)成功表達(dá)出PD-1胞外區(qū)蛋白，為以后制備PD-1單克隆抗體和研究PD-1在豬的免疫抑制性疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Porcine PD-1 Extracellular Region Gene

YANG Yuan1，2，ZHU Yan-ping1，YUE Feng1，SUN Guo-peng1，ZHANG Yan-fang1，YIN Mei2，WANG Xuan-nian1
（1.Biotechnology Research Center，Department of Life Science and Technology，Xinxiang University，Xinxiang，Henan，453003，China；2.College of Animal Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan，453003，China）

Abstract：In order to study the role of porcine PD-1/PD-L1pathways in immunosuppressive disease，the primers were designed according to the extracellular region of porcine PD-1sequence in GenBank，and the porcine PD-1extracellular region gene was cloned from porcine PBMC.The PCR products were determined by cloning and sequencing，and then directionally cloned into pET32a（+）.The recombinant plasmid in E.coli Rosetta（DE3）was induced with IPTG，and the expression products were detected by SDS-PAGE and Western blot.SDS-PAGE analysis showed that we obtained the recombinant proteins at 37℃，0.5mmol/L IPTG，and its molecular weight is 33 ku.Western blot revealed that the expressed products were reacted by anti-porcine PD-1antibody，His-tag antibody and anti-human PD-1monoclonal antibody.These results indicated that the recombinant prokaryotic expression protein of porcine PD-1was properly expressed.The protein has a good antigenecity and reactogenicity.It is useful to prepared the monoclonal antibodies and study the PD-1/PD-L1function in immunosuppressive diseases in pigs.

Key words：porcine PD-1；extracellular region；cloning；prokaryotic expression

作者簡(jiǎn)介：楊 媛（1988-），女，河南林州人，碩士研究生，主要從事分子免疫學(xué)與動(dòng)物病理學(xué)研究。＊

通訊作者

基金項(xiàng)目：河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究（122300410150）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272539，31201877）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A230837）

收稿日期：2014-03-25

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786；S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）09-0055-05