梁云浩，曹琛福，葉奕優(yōu)，花群義，張彩虹，曾少靈，陶　虹，廖立珊，劉建利，唐　勇，呂建強(qiáng)＊（.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳58045；.暨南大學(xué)廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州5063）

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非洲豬瘟病毒p72蛋白的真核表達(dá)及反應(yīng)原性鑒定

梁云浩1，2，曹琛福1，葉奕優(yōu)1，花群義1，張彩虹1，曾少靈1，陶虹1，廖立珊1，劉建利1，唐勇2，呂建強(qiáng)1＊
（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045；2.暨南大學(xué)廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）

摘 要：將p72基因克隆到載體pFast Bac/NT-TOPO上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。將獲得的重組載體pFastBac/NT-TOPO-p72，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10Bac，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒bacmid-p72。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)，將bacmid-p72轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。用重組桿狀病毒感染正常生長(zhǎng)的sf9細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞，超聲破碎后取上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果顯示，重組蛋白大小約78ku，且重組蛋白可以與非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)。說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白為可溶性的，并具有良好的反應(yīng)原性。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；p72蛋白；脂質(zhì)體介導(dǎo)；重組桿狀病毒

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種豬的急性傳染病，因豬感染非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起。非洲豬瘟的主要臨床癥狀有高熱、皮下有紅斑、精神萎靡、進(jìn)食減少，眼角結(jié)膜出現(xiàn)炎癥，排泄物中有血絲等［1］。健康豬感染強(qiáng)毒株后3d～7d，出現(xiàn)臨床癥狀，4d～10d后感染豬死亡，病死率接近100%。弱毒株感染后，患豬能夠依賴(lài)自身免疫系統(tǒng)逐漸康復(fù)，但將終生攜帶非洲豬瘟病毒，成為非洲豬瘟的傳染源。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染?。?］。

1921年，在非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病例，隨后疫情在整個(gè)撒哈拉以南的非洲地區(qū)蔓延。20世紀(jì)60年代，非洲豬瘟傳入歐洲大陸。西班牙、葡萄牙、法國(guó)、比利時(shí)、荷蘭、意大利及撒丁島成為非洲豬瘟的重災(zāi)區(qū)。20世紀(jì)70年代，非洲豬瘟傳入南美洲的巴西及加勒比海地區(qū)，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。歐洲各國(guó)在花費(fèi)了大量人力物力后，非洲豬瘟疫情得到了控制。但在意大利撒丁島疫情時(shí)有發(fā)生，無(wú)法完全撲滅。2008年，非洲豬瘟在俄羅斯高加索地區(qū)暴發(fā)，并開(kāi)始向?yàn)蹩颂m和哈薩克斯坦蔓延。我國(guó)西部與中亞各國(guó)接壤，并且有著極其相似的氣候環(huán)境，存在非洲豬瘟跨境傳播風(fēng)險(xiǎn)［3-5］。

非洲豬瘟病毒（ASFV）為虹彩病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員［6］。該病毒抗極端環(huán)境能力強(qiáng)，在56℃加熱70min或60℃下加熱20min病毒才能被殺死。在pH4～10的條件下，病毒仍可保持活性。將豬肉自然風(fēng)干制成的臘腸，或者32℃～49℃下煙熏12h，然后自然風(fēng)干25d～30d制成火腿，豬肉中攜帶的非洲豬瘟病毒也無(wú)法被全部殺死，仍然具有感染活性。健康個(gè)體接觸攜帶病毒的豬肉制品后，極易發(fā)生感染，造成疫情暴發(fā)［7］。

非洲豬瘟病毒（ASFV）為正20面體，直徑約175nm～215nm。由外包膜、病毒衣殼、內(nèi)包膜、核殼、病毒核酸5個(gè)部分組成［8］。病毒核酸為雙鏈DNA，長(zhǎng)度為170kb～190kb。病毒基因可編碼200多種蛋白質(zhì)，其中結(jié)構(gòu)蛋白有54種［9］。p72是非洲豬瘟的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒衣殼的主要組成部分，也是含量最多的病毒蛋白，占病毒蛋白總量的32%。p72基因序列保守，不同毒株之間都有相同的保守序列。p72蛋白同樣也是主要的抗原蛋白，能夠誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，但抗體不具有中和病毒的能力［10］。

p72蛋白是非洲豬瘟病毒的主要檢測(cè)抗原之一，大小約75ku。穩(wěn)定性好，變異小。以p72蛋白為抗原，已經(jīng)研發(fā)出了一系列檢測(cè)產(chǎn)品［11-12］。我國(guó)為非洲豬瘟的非疫區(qū)，但隨著疫情在中亞的蔓延，非洲豬瘟跨境傳播的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大［13］。對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒的研制，我國(guó)尚處于空白階段，商業(yè)化檢測(cè)試劑盒技術(shù)專(zhuān)利被國(guó)外公司長(zhǎng)期壟斷。本研究利用Bac-to-Bac真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)了非洲豬瘟病毒的p72蛋白。經(jīng)Western blot鑒定，可以和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性，為檢測(cè)方法的建立和檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供了良好的材料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 pFastBac/NT-TOPO Expression kit，為Invitrogen公司產(chǎn)品。大腸埃希菌（E.coli）DH5α、DH10Bac為試劑盒內(nèi)自帶。質(zhì)粒pMD18T-p72（含ASFV p72全長(zhǎng)基因，大小1941bp）和昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9均為深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2血清和試劑 非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自O(shè)IE非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室（Pirbright Laboratary）。高保真PCR擴(kuò)增酶AccuPrime Pfx DNA Polymerase或Platinum Pfx DNA Polymerase、小質(zhì)粒提取試劑盒PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit、大質(zhì)粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit、Cellfectin○RⅡReagent轉(zhuǎn)染試劑盒、SDS-PAGE預(yù)制膠、羊抗豬IgG-HRP、Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)基、氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素和X-Gal均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3引物合成 根據(jù)GenBank中的p72的序列（GenBank序列號(hào)：KJ195685.1）設(shè)計(jì)出第1組引物P1：5′-ATGGC ATCAG GAGGA GCTTT-3′，P2：5′-TTAGG TACTG TAACG CAGCA CA-3′，用于擴(kuò)增p72目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 941bp。第2組引物P3：5′-AAATG ATAAC CATCT CGC-3′，P4：5′-GGTAT GGCTG ATTAT GATC-3′，用于鑒定目的基因與載體是否連接，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2 446bp；交叉引物P1、P4用于鑒定目的基因與載體連接方向是否正確，若正向連接可得到大小為2 141bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，反向連接則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。第3組引物：P5：5′-CCCAG TCACG ACGTT GTAAA ACG-3′，P6：5′-AGCGG ATAAC AATTT CACAC AGG-3′，用于鑒定重組桿狀病毒質(zhì)粒，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為4 371bp。

1.2方法

1.2.1真核重組載體的構(gòu)建 用含有p72基因的質(zhì)粒pMD18T-p72作為模板，用第一組引物進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用15g/L瓊脂糖凝膠電泳，分析目的條帶。在紫外燈下快速切割所需的目的條帶，經(jīng)過(guò)膠回收，得到p72基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。取4 μL目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL pFastBac/NT-TOPO載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的篩選平板，挑取單克隆菌落，用PureLink HiPure Mini Plasmid Purifica-tion Kit提取質(zhì)粒。用P1、P2鑒定重組載體上是否連接目的基因，用P3、P4鑒定目的基因是否連接到載體的正確位置，用P1、P2鑒定目的基因與載體的連接方向是否正確。同時(shí)經(jīng)過(guò)測(cè)序分析后，將得到的重組質(zhì)粒命名為pFastBac/NT-TOPO-p72。

1.2.2重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)表達(dá)試劑盒操作說(shuō)明，將10μL pFastBac/NT-TOPO-p72轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH10Bac中，接入LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。取出適量LB菌液，涂布含有氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素和X-Gal的篩選平板。通過(guò)兩次篩選，將確定為白斑的菌落用PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit提取重組桿狀病毒質(zhì)粒。用第3組引物鑒定后，并經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，將重組桿狀病毒質(zhì)粒命名為bacmid-p72。

1.2.3重組桿狀病毒的獲得 按照Cellfectin?ⅡReagent轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說(shuō)明，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)將bacmid-72轉(zhuǎn)染在225mL培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的sf9細(xì)胞，將細(xì)胞置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約72 h。同時(shí)將用Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的正常sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照。觀察到約80%的細(xì)胞發(fā)生病變后，收集培養(yǎng)上清。將收集的培養(yǎng)上清按1∶10的體積比加入到細(xì)胞Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)細(xì)胞。約72h后再次收集培養(yǎng)上清，即獲得重組桿狀病毒AcNPV-p72。

1.2.4重組蛋白的SDS-PAGE分析 重組病毒感染sf9細(xì)胞72h后，棄去培養(yǎng)上清，將細(xì)胞用20mL無(wú)菌PBS緩沖液從培養(yǎng)瓶壁上輕輕吹下來(lái)，把細(xì)胞懸液收集至50mL無(wú)菌離心管中。用同樣的方法處理正常生長(zhǎng)的sf9細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。將細(xì)胞懸液超聲破碎10 min，在4℃下，14 000r/min的離心速度下30min，收集離心后的上清。從離心管中各取10μL上清，與Loading buffer根據(jù)比例混合，95℃水浴10min后制備上樣樣品。各取10μL上樣樣品，用預(yù)制膠進(jìn)行SDSPAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5重組蛋白的Western blot分析 各取10 μL上清制備成上樣樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用含50g/L脫脂奶粉的TBST溶液浸沒(méi)硝酸纖維素膜，37℃下封閉1h。用TBST溶液洗3次，10min/次。將非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用PBS稀釋500倍后，孵育硝酸纖維素膜，37℃下孵育1h。TBST溶液洗3次后，將羊抗豬IgG-HRP用PBS稀釋2 500倍，37℃下孵育硝酸纖維素膜1h。TBST溶液洗3次后，避光條件下進(jìn)行顯色，顯色3 min后立即用清水稀釋顯色液，終止顯色反應(yīng)。

2　結(jié)果

2.1真核重組載體的構(gòu)建

以pMD18T-p72為模板，用P1、P2作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖電泳分析后，擴(kuò)增得到大小1 941bp的擴(kuò)增片段（圖1），即為含有p72全長(zhǎng)基因的目的基因片段（圖1）。

圖1　p72基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication of p72gene

將含有目的基因的凝膠進(jìn)行回收后，獲得目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。將p72目的基因與載體pFastBac/ NT-TOPO進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。涂布篩選平板后挑取單克隆菌，擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒，用引物P1、P2進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增得到大小1 941 bp的片段，表明載體上已連有目的基因；用P3、P4引物擴(kuò)增，得到大小2 446bp（1 941+505）的片段，表明目的基因已經(jīng)連到載體的正確位置；用P1、P4引物擴(kuò)增，得到大小2 140bp（1 941+200）的片段，表明目的基因與載體的連接方向正確（圖2）。不同引物對(duì)鑒定結(jié)果表明，p72目的基因與載體pFast-Bac/NT-TOPO正確連接。經(jīng)測(cè)序分析后，結(jié)果與擴(kuò)增鑒定結(jié)果完全一致，將構(gòu)建的重組載體命名為pFast Bac/NT-TOPO-p72。

2.2重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10 Bac。通過(guò)兩次藍(lán)白斑篩選后，將挑取到的白斑單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。用P1、P2引物進(jìn)行鑒定，得到大小1 941bp的片段，表明重組桿狀病毒質(zhì)粒上連有p72目的基因；用P5、P6引物進(jìn)行鑒定，得到大小4 371bp（1 941+2 430）大小的片段，表明目的基因已經(jīng)連接到重組桿狀病毒質(zhì)粒的正確位置（圖3）。經(jīng)測(cè)序分析后，與PCR鑒定結(jié)果一致，將得到的重組桿狀病毒質(zhì)粒命名為bacmidp72。

圖2　重組載體的鑒定Fig.2 The identification of recombinant vector

圖3　重組桿狀病毒質(zhì)粒的鑒定Fig.3 The identification of recombinant bacmid

2.3重組蛋白的SDS-PAGE分析

將超聲破碎后的細(xì)胞懸液離心，取離心后的上清制備上樣樣品。取10μL制備好的上樣樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，在78ku處出現(xiàn)特異性條帶，作為空白對(duì)照的正常sf9細(xì)胞則沒(méi)有此條帶，結(jié)果表明p72蛋白已經(jīng)在sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且為可溶性表達(dá)。

2.4重組蛋白的Western blot分析

將制備好的上樣樣品進(jìn)行SDS PAGE分析后，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。與非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行孵育后，再孵育酶標(biāo)羊抗豬IgG HRP，加入顯色液后進(jìn)行顯色。重組病毒感染后細(xì)胞超聲破碎上清在80ku附近出現(xiàn)特異性條帶（圖4）。作為對(duì)照的正常細(xì)胞超聲破碎上清未出現(xiàn)相同大小的條帶。Western blot結(jié)果表明重組表達(dá)的非洲豬瘟病毒蛋白p72可以和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清中的抗體結(jié)合，有很好的反應(yīng)原性。

圖4　重組蛋白的蛋白印跡鑒定Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein

3　討論

非洲豬瘟作為一種在世界許多國(guó)家蔓延的動(dòng)物疫病，在中國(guó)目前沒(méi)有病例上報(bào)。非洲豬瘟暴發(fā)速度快，致死率接近100%，尚無(wú)有效的預(yù)防疫苗和治療措施，撲殺患病個(gè)體是唯一有效控制疫情蔓延的措施。建立快速、靈敏、特異的診斷方法是實(shí)施疫情防控措施的重要條件［14］。p72蛋白是非洲豬瘟病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒蛋白中含量最高。蛋白序列保守、穩(wěn)定，極少發(fā)生變異，同時(shí)是病毒的主要抗原蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。p72蛋白常被用作檢測(cè)抗原，用于建立免疫學(xué)檢測(cè)方法［15-16］。受限于嚴(yán)格的生物安全政策，作為非疫區(qū)的國(guó)家和地區(qū)很難獲得非洲豬瘟活病毒。

與原核細(xì)胞蛋白表達(dá)相比，真核細(xì)胞蛋白表達(dá)需經(jīng)過(guò)表達(dá)后修飾，如：折疊、糖基化、?；⒘姿峄?。修飾后的蛋白與天然蛋白結(jié)構(gòu)比較接近，最大限度地保留了天然蛋白的抗原表位，有很好的反應(yīng)原性。其次，原核細(xì)胞表達(dá)會(huì)形成不可溶的包涵體。包涵體蛋白的變性、復(fù)性過(guò)程操作較為繁瑣，且對(duì)蛋白的構(gòu)象有一定的破壞作用。但真核細(xì)胞表達(dá)蛋白的表達(dá)量較低，在純化過(guò)程中存在較大難度。本研究采用Bac-to-Bac真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出了非洲豬瘟病毒蛋白p72蛋白，且為可溶性表達(dá)。經(jīng)過(guò)Western blot分析，重組蛋白可以和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，有很好的反應(yīng)原性。與分子生物學(xué)檢測(cè)方法比，免疫學(xué)檢測(cè)方法，如間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫層析等，操作簡(jiǎn)便，對(duì)試驗(yàn)條件要求較低，可以快速、大規(guī)模檢測(cè)血清樣品，能夠在基層檢疫機(jī)構(gòu)和小型養(yǎng)殖場(chǎng)推廣。本研究重組表達(dá)的p72蛋白，有很好的反應(yīng)原性，為免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立、單克隆抗體的制備和篩選提供了材料，為免疫檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Eucarytotic Expression and Reactogenicity Identification of African Swine Fever Protein p72

LIANG Yun-hao1，2，CAO Chen-fu1，YE Yi-you1，HUA Qun-yi1，ZHANG Cai-hong1，
ZENG Shao-ling1，TAO Hong1，LIAO Li-shan1，LIU Jian-li1，TANG Yong2，LV Jian-qiang1
（1.Inspection &Quarantine Center for Animals and Plants，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong，518045，China；2.Guangdong Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong，510632，China）

Abstract：In order to express African swine fever virus protein p72，the p72gene was cloned into pFastBac/ NT-TOPO vector，and then transformed into E.coil DH5αto obtain recombinant vector pFastBac/NTTOPO-p72.Next，the pFastBac/NT-TOPO-p72was transformed into E.coil DH10Bac to get recombinant bacmid-p72.The recombianant baculovirus was generated by lipsome mediation.The sf9cells were infected by recombinant baculovirus，the cells were collected after 72h.The supernant was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot after ultrasonic breaking.The result showed that the recombinant protein was about 78ku，and could react with African swine fever standard positive serum.The results above demonstrated that，the expressed recombinant protein was soluble，and has good reactogenicity.

Key words：AFSV；protein p72；lipsome mediation；recombinant baculovirus

作者簡(jiǎn)介：梁云浩（1987-），男，湖南婁底人，主要從事動(dòng)物新型疫苗與診斷方法研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA101301）；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)（200903037）

收稿日期：2014-07-30

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.651

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）06-0029-05