任　方，易　忠，米曉云，魏　婕，馬文戈，郭會玲，苗書魁，汪麗群，王　延，薛　英，黃　炯，魏玉榮＊（.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊830063；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005）

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泰勒蟲重組抗原Tams1-spag 基因原核表達(dá)與純化

任方1，3，易忠1，米曉云1，魏婕1，馬文戈1，郭會玲1，苗書魁1，汪麗群2，王延1，薛英1，黃炯1，魏玉榮1＊
（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊830063；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

摘 要：為了在低成本的情況下，得到高濃度、高純度的環(huán)形泰勒蟲表面重組抗原的融合蛋白，設(shè)定表達(dá)過程中不同的OD600nm、IPTG濃度與誘導(dǎo)時間，探索最佳表達(dá)條件。通過KCl染色法切膠后分別經(jīng)透析袋電洗脫法與快速離心法回收目的蛋白。對上述試驗(yàn)的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測。結(jié)果表明，在OD600nm=1時加入濃度為1mmol/L IPTG，過夜誘導(dǎo)時，重組蛋白的表達(dá)量最大。在KCl染色法切膠回收目的條帶的基礎(chǔ)上，電洗脫法與快速離心法均能得到同等濃度的高純度目的蛋白，經(jīng)Western blot檢測重組蛋白的生物活性沒有改變，仍具有良好的反應(yīng)原性。

關(guān)鍵詞：環(huán)形泰勒蟲；重組蛋白；原核表達(dá)；蛋白純化

環(huán)形泰勒蟲病是由寄生于動物紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）引發(fā)的一種蜱傳急性、熱性血液原蟲病。此病呈地方流行性，表現(xiàn)為急性經(jīng)過。不僅發(fā)病率與病死率較高，當(dāng)病畜耐過此病或治愈后，體內(nèi)仍存在低水平的蟲體，導(dǎo)致抵抗力下降，或其他疾病暴發(fā)時再次誘發(fā)此?。?］。環(huán)形泰勒蟲病對畜牧業(yè)危害很大，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動物疾病，被我國列為二類疫?。?］。裂殖子表面抗原（merozoite surface antigen，Tams1）與子孢子表面抗原（sporozoite antigen，SPAG1）已被確認(rèn)具有較好的免疫原性，可作為診斷與預(yù)防環(huán)形泰勒蟲病的理想候選疫苗［3-5］，但由于環(huán)形泰勒蟲存在表面抗原的多態(tài)性，使得單一的表面抗原不能完全免疫預(yù)防此?。?］，研究串聯(lián)表面優(yōu)勢抗原蛋白為篩選理想的候選抗原提供一條新的思路。

鑒于在原核表達(dá)中，誘導(dǎo)時菌液OD600nm值、誘導(dǎo)劑異丙基代β-D-半乳糖苷（IPTG）的濃度以及誘導(dǎo)時間等因素均會影響外源基因的高效表達(dá)［7］，而原核表達(dá)中包涵體不可避免的產(chǎn)生影響蛋白的純化。探索合適的誘導(dǎo)條件與包涵體純化回收的方法可以降低生產(chǎn)成本，提高試驗(yàn)效率。

本文對環(huán)形泰勒蟲表面優(yōu)勢抗原蛋白串聯(lián)后，在大腸埃希菌中經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過探索誘導(dǎo)表達(dá)時的最優(yōu)條件，獲得大量的目的蛋白。并運(yùn)用KCl染色法切膠回收含有目的蛋白的膠條，對回收膠條分別使用透析袋電洗脫法與快速離心法回收目的蛋白。對此兩種純化后回收蛋白的方法進(jìn)行比較，以期得到高濃度與純度的重組融合蛋白，為今后進(jìn)一步研究蛋白其他特性奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞 pMD-Tams1-TaSPSPAG1、PET-28a質(zhì)粒與BL21（DE3）表達(dá)宿主菌由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所傳染病研究室保存。

1.1.2主要試劑 凝膠配制試劑盒、4×SDS雙色加樣緩沖液為武漢博士德生物公司產(chǎn)品；透析袋為華美生物工程公司產(chǎn)品；Amicon Ultra-15超濾管為MILLIPORE公司產(chǎn)品；PEG8000為WOLSEN公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基（kan+）中，37℃220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（kan+）中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.8，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h。同時以誘導(dǎo)前的菌液與誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化的PET-28a空載體作為對照。將培養(yǎng)好的菌液5 000r/min離心5min收集菌體，洗滌后加入滅菌的PBS緩沖液（pH7.4），懸浮菌體后充分的超聲破碎菌體，待菌體澄清透明后加入上樣緩沖液煮沸10 min，取10μL進(jìn)行120 mL/L的SDSPAGE電泳檢測分析，確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白。

1.2.2不同條件時重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.2.1不同OD600nm的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基（kan+）中37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的體積將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（kan+）中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm分別0.3、0.5、0.7、1時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h。取樣品處理后進(jìn)行120mL/L的SDS-PAGE電泳檢測分析。

1.2.2.2不同IPTG濃度的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基（kan+）中37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1 ∶100的體積將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（kan+）中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm=1時分別加入IPTG，使其至終濃度為0.5、0.7、1、1.3、1.5、1.7、2 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h。取樣品處理后進(jìn)行120 mL/L的SDS-PAGE電泳檢測分析。

1.2.2.3不同時間的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基（kan+）中37℃220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的體積將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（kan+）中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm=1時加入IPTG至終濃度為1.3mmol/L，分別誘導(dǎo)表達(dá)2、3、4、5、6、7h并且進(jìn)行過夜誘導(dǎo)，取樣品處理后進(jìn)行120mL/L的SDSPAGE電泳檢測分析。

1.2.3重組蛋白的純化與回收

1.2.3.1重組蛋白的純化 將750μL超聲破碎后的包涵體提取液處理后不插樣品梳直接上樣，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用250mmol/L KCl染色10min，將染成銀白色含目的蛋白的膠切割回收，用無菌PBS（pH 7.2）漂洗3次至膠條白色消失。

1.2.3.2電洗脫法回收重組蛋白 將含有目的蛋白的膠條放入處理好的透析袋中，封口后放入含Tris-甘氨酸緩沖液的水平電泳槽中70V2h進(jìn)行電洗脫回收蛋白，之后將取出膠條的透析袋放入PBS（pH7.2）緩沖液中4℃放置12h～24h。用聚乙二醇8000（PEG8000）對含有目的蛋白的透析袋進(jìn)行濃縮，將濃縮后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析后BCA濃度測定。

1.2.3.3快速離心法回收目的蛋白 將多次切割收集的含有目的蛋白的膠條研碎后收集到離心管中，加入PBS（pH7.2）緩沖液放于-20℃反復(fù)凍融3次，8 000r/min離心5min，取上清液后再加入PBS （pH7.2）緩沖液放于4℃過夜透析，8 000r/min離心5min取上清液，之后再放于4℃過夜透析，經(jīng)過兩次重復(fù)4℃過夜透析離心回收后，將此4次收集的上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析。將收集的全部上清液在Amicon Ultra-15超濾管中6 000 r/min離心30min進(jìn)行濃縮。將濃縮后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析后BCA濃度測定。

1.2.4回收后重組蛋白Western blot的檢測 純化后的重組蛋白轉(zhuǎn)至NC膜后，用含50g/L脫脂牛奶的PBST封閉4℃過夜，以環(huán)形泰勒蟲陽性血清（1∶100）為一抗，孵育2h，PBST緩沖液洗膜后，以HPR標(biāo)記的兔抗牛IgG為二抗，孵育1h，用PBST緩沖液洗滌后進(jìn)行DAB顯色后拍照保存。

2　結(jié)果

2.1表達(dá)產(chǎn)物不同條件的SDS-PAGE電泳

取不同條件重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的樣品進(jìn)行SDSPAGE，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色觀察。結(jié)果表明，25ku ～35ku處存在一條特異性的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，而對照組未出現(xiàn)此表達(dá)條帶。發(fā)現(xiàn)當(dāng)OD600 nm=1時加入IPTG至終濃度為1mmol/L，過夜誘導(dǎo)時，蛋白表達(dá)量最高（圖1～圖4）。

圖1　重組蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins

圖2　不同OD600nm對重組蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 The effect of different OD600nm on expression levels of recombinant proteins

圖3　不同濃度IPTG對重組蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 The effect of defferent IPTG concentrations on expression levels of recombinant proteins

2.2重組蛋白純化與回收的SDS-PAGE電泳

2.2.1快速離心法回收目的蛋白的SDS-PAGE電泳 取反復(fù)凍融后的膠條，快速離心回收的樣品、回收后經(jīng)Amicon ultra-15超濾管濃縮的樣品與3次過夜后離心收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)（圖5）。表明反復(fù)凍融后快速離心吸取上清液并不能完全回收蛋白，經(jīng)過4℃透析仍能析出少部分蛋白，在重復(fù)至第3次時析出的蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)已經(jīng)鑒定不出，可以忽略不計(jì)。

2.2.2電洗脫法與快速離心法回收重組蛋白的SDS-PAGE電泳 取透析袋電洗脫法與快速離心法濃縮后回收的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色觀察試驗(yàn)結(jié)果，并對兩種方法回收的蛋白濃度進(jìn)行BCA濃度測定（圖6）。結(jié)果表明，在運(yùn)用KCl染色法切膠回收目的條帶的基礎(chǔ)上，使用電洗脫法與快速離心法均可回收得到高純度的目的蛋白，且兩種方法回收的蛋白濃度不相上下，電洗脫法與快速離心濃縮法得到目的蛋白濃度分別為2.06 mg/mL和2.01mg/mL。

2.3回收后重組蛋白Western blot的檢測

用牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，與SDS-PAGE電泳膠相對應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性雜交條帶，而對照組的表達(dá)產(chǎn)物則無此條帶（圖7），可以初步確定純化回收后的重組蛋白的生物活性沒有改變，仍具有良好的反應(yīng)原性。

圖4　不同誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 The effect of time on expression levels of recombinant proteins

圖5　重組表達(dá)蛋白的純化Fig.5 The purification of recombinant proteins

圖6　不同方法純化的重組蛋白Fig.6 The purified recombinant proteins by different methods

圖7　純化的重組蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig.7 Western blot analysis of purified recombinant proteins

3　討論

裂殖子表面抗原（Tams1）是環(huán)形泰勒蟲感染紅細(xì)胞時表面分泌的一種膜內(nèi)蛋白，子孢子表面抗原（sporozoite antigen，SPAG1）是蟲體發(fā)育至子孢子階段時分泌的一種膜內(nèi)蛋白，這兩種表面抗原均具有良好的免疫原性且已被驗(yàn)證并在實(shí)際診斷中應(yīng)用。但目前，以單一抗原為基礎(chǔ)的診斷方法還存在著一些問題，例如抗原多態(tài)性的存在，各分離株間變異性的出現(xiàn)，不完全保護(hù)的產(chǎn)生等。而對環(huán)形泰勒蟲不同發(fā)育階段的串聯(lián)表面優(yōu)勢抗原的研究則解決了這些問題，為篩選理想的候選抗原提供了一條新的思路。魏玉榮等［8-9］將環(huán)形泰勒蟲表面抗原Tams1、Spag1、Tasp的高免疫原性區(qū)片段串聯(lián)后用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，并以此為基礎(chǔ)，成功建立了以環(huán)形泰勒蟲重組蛋白Tasp-Tams1-Spag為包被抗原的間接ELISA檢測方法，驗(yàn)證了串聯(lián)抗原重組蛋白的可行性。但串聯(lián)蛋白低成本、高效率的制備仍需要進(jìn)一步的探索。

在原核表達(dá)中，蛋白的表達(dá)量與純化回收率對生產(chǎn)研究具有一定的影響，外源基因的高效表達(dá)會受到誘導(dǎo)時菌液OD600nm值、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度以及誘導(dǎo)時間等因素的影響。探索合適的誘導(dǎo)條件可以降低生產(chǎn)成本，提高試驗(yàn)效率。在外源基因高效表達(dá)的基礎(chǔ)上，對目的蛋白的純化回收也大大影響到所需蛋白的生產(chǎn)效率。眾所周知，外源基因在大腸埃希菌中高效表達(dá)，由于其表達(dá)部位的低電勢與外源蛋白質(zhì)分子的特殊結(jié)構(gòu)，常常形成高密度、無活性的非折疊狀的包涵體沉淀。目前，包涵體的提取方法大多是基于變性-復(fù)性過程的基礎(chǔ)上，而影響包涵體復(fù)性的因素有許多，如蛋白的濃度與自身的理化性質(zhì)，復(fù)性體系的離子強(qiáng)度、pH、溫度等。不僅蛋白復(fù)性的條件難以把握，而且很多蛋白質(zhì)在復(fù)性的過程中會難以控制的產(chǎn)生蛋白沉淀。一般蛋白質(zhì)的復(fù)性效率只在20%左右。除此之外，變性-復(fù)性后目的蛋白的純化也存在著雜蛋白干擾［10］。這些都嚴(yán)重影響目的蛋白的生產(chǎn)效率。為了解決包涵體蛋白的純化問題，目前國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用切膠回收目的條帶的方法純化蛋白［11-12］，學(xué)者們通過研究摒棄了會影響蛋白活性的考馬斯亮藍(lán)R-250染色切膠回收的方法，用KCl染色等負(fù)染法切膠回收含有目的蛋白的膠條［13］。對純化后的蛋白一般采用電洗脫法、過夜透析高速離心法或反復(fù)凍融高速離心法回收目的蛋白［14-16］。

本文參照分子克隆與相關(guān)文章，探索在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中最合適的OD600nm、IPTG濃度與誘導(dǎo)時間。得知隨著OD600nm的增大，誘導(dǎo)表達(dá)量明顯增多，在OD600nm=1時加入IPTG，重組蛋白的表達(dá)量最大。在相同的誘導(dǎo)時間，當(dāng)IPTG的濃度為1mmol/L后隨著IPTG濃度的增加重組蛋白的表達(dá)量并不會增大，即1mmol/L的IPTG可以表達(dá)出大量蛋白。在保證其他誘導(dǎo)條件一定的情況下，發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)量會隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加，當(dāng)過夜誘導(dǎo)時蛋白的表達(dá)量最高。對誘導(dǎo)表達(dá)出的大量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后KCl染色切膠回收，可以完全去除雜蛋白的影響獲得高純度的目的蛋白。在回收過程中，電洗脫法與快速離心法回收的蛋白濃度不相上下，均可高效的回收蛋白。電洗脫法雖然可以將膠條中的蛋白完全析出，但濃縮時的效率不如離心法Amicon ultra-15超濾管。在快速離心法回收蛋白時，相同數(shù)量切膠回收的膠條分多次少量比大量凍融離心的回收率高，在第一次反復(fù)凍融提取含蛋白的上清后，經(jīng)過兩次過夜透析才可最大量的析出目的蛋白。實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)不同的情況而選用任意一種方法進(jìn)行蛋白的回收。本試驗(yàn)為更快捷經(jīng)濟(jì)得到高濃度與純度的環(huán)形泰勒蟲重組融合蛋白提供了技術(shù)支持。

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Prokaryotic Expression and Purification of Theileria annulata Recombinant Antigen Tams1-spag Genes

REN Fang1，3，YI Zhong1，MI Xiao-yun1，WEI Jie1，MA Wen-ge1，GUO Hui-ling1，
MIAO Shu-kui1，WANG Li-qun2，WANG Yan1，XUE Ying1，HUANG Jiong1，WEI Yu-rong1
（1.Institute of Veterinary Medicine，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang，830000，China；2.Institute of Animal Health Supervision Station Inspection，Urumqi，Xinjiang，830063，China；
3.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang，830052，China）

Abstract：To study the purification method of the of fusion protein of Theileria annulata surface recombinant antigens and to obtain high purity products at low cost，different parameters were set in order to obtain the optimum of expression.The experimental parameters included OD600nm，IPTG concentration induction time.Firstly，the target proteins were isolated by cutting the gel slices that contained the right bands which were stained by KCl solution.Secondly，the recycle protein were recovered by electrical elution and high centrifugation.Through SDS-PAGE and Western-blot，the experimental results indicated that the maximal quantity of expression of recombinant proteins was confirmed when IPTG concentration was 1mmol/Land OD600nm=1，the induced time was stay overnight.The two methods can obtain the same purified products and high purity.Western-blot assay indicated that the recombinant protein were not denaturated，and had good antigencity.

Key words：Theileria annulata；recombinant protein；prokaryotic expression；protein purification

作者簡介：任 方（1989-），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事動物病毒病研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160505）；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD12B04）

收稿日期：2014-12-02

中圖分類號：S852.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0043-05