王 雨，吉藝寬，程 藝，張寶石，向柯宇，琚春梅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的傳染病，豬為其儲(chǔ)存宿主，并可引起豬的潛伏感染。本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。我國(guó)從20世紀(jì)90年代開始在規(guī)?；i場(chǎng)廣泛使用PRV基因缺失疫苗，很好地控制了該病造成的危害，但自2011年以來，該病又有暴發(fā)流行趨勢(shì)，因此加強(qiáng)該病的防控對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

PRV基因組為線狀雙鏈DNA，大小約為180 kb，G＋C含量高達(dá)74%，可以編碼70種蛋白，其中糖蛋白有g(shù)B、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN 11種［3］。gB作為病毒的一個(gè)重要囊膜組分和中和抗原，對(duì)于病毒的感染起到重要作用，并參與病毒特異性體液免疫和細(xì)胞免疫［4］。gB基因?qū)儆诎捳畈《局斜Ｊ氐奶堑鞍谆?，編碼913個(gè)氨基酸，gB蛋白分別在59-126aa、214-289aa、507-734aa處存在優(yōu)勢(shì)抗原表位，其中59-126aa之間有3個(gè)連續(xù)的抗原表位，在214-279aa之間有一個(gè)連續(xù)的抗原表位，在540-734aa區(qū)間有8個(gè)潛在的非連續(xù)抗原表位［4］。根據(jù)gB基因的以上特點(diǎn)，本研究針對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)抗原表位，應(yīng)用PCR擴(kuò)增gB基因的主要抗原表位區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，利用表達(dá)蛋白作為抗原建立gB768-ELISA診斷方法，為偽狂犬病疫苗免疫效果的評(píng)估提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及菌株 偽狂犬病病毒，大腸埃希菌TOP10及BL21（DE3），表達(dá)載體pET-32a（＋）均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。

1.1.2 工具酶和試劑 LATaq酶、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、HindⅢ）、T4DNA 連接酶、DNA Marker、IPTG、瓊脂糖均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；HisTrapFF crude預(yù)裝柱為GE公司產(chǎn)品；羊抗豬IgG-HRP為廣州健陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；偽狂犬病毒陽性血清、陰性血清及口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、日本腦炎病毒（JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存；128份臨床血清樣本為豬場(chǎng)送檢；PRV gB抗體檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 gB768的PCR擴(kuò)增 參考GenBank登錄的偽狂犬病毒gB序列（序列號(hào)A 68929），設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增gB基因主要抗原表位區(qū)。引物如下：gB-F：5′-CGCGGATCCGCGCTGCTGCTGCTGGC-3′（下劃 線 部 分 為BamH Ⅰ 酶 切 位 點(diǎn) ），gB-R：5′-CCCAAGCTTGGCGAAGGAGTCGTAGGGGTA-3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)），利用PCR擴(kuò)增包含59-289aa優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)基因序列，大小為768bp，命名為gB768。

PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；95 ℃35s，53℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。該P(yáng)CR反應(yīng)以抽提的豬偽狂犬病毒的DNA作為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，連接經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-32a（＋），轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒并對(duì)其應(yīng)用酶切和PCR兩種方法鑒定，對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-gB768。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)、純化及 Western blot鑒定陽性重組質(zhì)粒pET-gB768轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3）。最佳誘導(dǎo)條件下表達(dá)目的蛋白，經(jīng) His-TrapFF crude預(yù)裝柱純化后，采用SDS-PAGE電泳和 Western blot進(jìn)行檢測(cè)［5］。

1.2.4 間接gB-ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.4.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 方陣滴定法確定重組蛋白gB的最佳包被濃度及血清的最佳稀釋度，并對(duì)封閉液的選擇及其作用時(shí)間，二抗稀釋度及其作用時(shí)間，TMB顯色時(shí)間分別進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.2 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 取30份PRV陰性豬血清樣本，用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)，以30份血清的平均OD 450nm值＋3×SD作為判定陰陽性的臨界值。

1.2.4.3 特異性試驗(yàn) 用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)PRRSV、CSFV、JEV、PCV-2、FMDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。同時(shí)設(shè)豬偽狂犬病毒陽性血清、陰性血清對(duì)照，判定血清交叉反應(yīng)情況。

1.2.4.4 敏感性試驗(yàn) 將PRV陽性血清作平行倍比稀釋，用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)血清中抗體的含量并判定其抗體檢出效價(jià)。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取5份抗體水平不同的血清，用8塊不同批次包被的酶標(biāo)板按優(yōu)化的ELISA操作程序進(jìn)行試驗(yàn)，通過OD 450nm值計(jì)算變異系數(shù)確定方法的批間重復(fù)性。另取5份抗體水平不同的血清，在包被的同一批次酶標(biāo)板中按優(yōu)化ELISA操作程序進(jìn)行試驗(yàn)，樣品每份重復(fù)8個(gè)孔，通過OD 450nm值計(jì)算變異系數(shù)確定方法的批內(nèi)重復(fù)性。

1.2.4.6 臨床樣品檢測(cè) 使用間接gB768-ELISA方法對(duì)不同豬場(chǎng)送檢的128份豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小約為768bp的目的條帶（圖1）。重組質(zhì)粒pET-gB768經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后，可得到約768bp和約5 800bp兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2），基因序列測(cè)定結(jié)果與參考的序列一致。

圖1 PRV gB768PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of gB768of PRV by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pET-gB768的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-gB768 by enzyme digestion

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳及 Western blot分析

重組質(zhì)粒pET-gB768轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，表達(dá)蛋白大小約為47ku。通過HisTrapFF crude預(yù)裝柱親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，Western blot結(jié)果表明目的蛋白可與PRV陽性血清反應(yīng)（圖3和圖4），具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Identification of the recombinant protein by SDS-PAGE

2.3 間接gB768-ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)過方陣滴定確定重組抗原最佳包被濃度為2 μg／mL，陰、陽性血清的最佳稀釋度為1∶320，作用時(shí)間為37℃50min；最佳封閉液為10mL／L的BSA，封閉時(shí)間為37℃2h；二抗的最佳稀釋度為1∶5 000，作用時(shí)間為37℃1h；底物最佳顯色時(shí)間為室溫15min。

2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

用建立的間接gB768-ELISA檢測(cè)30份陰性血清，計(jì)算出平均OD450nm＝0.111，標(biāo)準(zhǔn)差SD＝0.034，從而計(jì)算出陰陽臨界值為0.213，因此，若樣本OD450nm 值≥0.213，判定為陽性；若樣本OD450nm值＜0.213，判定為陰性。

圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Identification of the recombinant protein by Western blot

2.5 特異性試驗(yàn)

用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)PRV、FMDV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV-2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)果顯示除豬偽狂犬病病毒陽性血清為陽性外，其余血清的OD450nm均低于0.213，判定為陰性，表明本試驗(yàn)建立的gB768-ELISA方法對(duì)PRV有良好的特異性（表1）。

2.6 敏感性試驗(yàn)

用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，血清稀釋1∶6 400時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽性（OD 450nm＝0.307）（表2），表明建立的方法敏感性良好。

表1 間接gB768-ELISA方法特異性試驗(yàn)Table 1 The specificity test of indirect gB768-ELISA

表2 間接gB768-ELISA方法敏感性試驗(yàn)Table 2 The sensitivity test of indirect gB768-ELISA

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的間接gB768-ELISA方法對(duì)5份血清進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示變異系數(shù)小于10%，用8塊不同批次的酶標(biāo)板對(duì)5份血清進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果（表4）顯示變異系數(shù)小于10%，表明所建立的gB768-ELISA檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。

表3 間接gB768-ELISA方法批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 The intra repeatability test of indirect gB768-ELISA

表4 間接gB768-ELISA檢測(cè)方法批間重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 The inter repeatability test of indirect gB768-ELISA

2.8 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的間接gB768-ELISA方法檢測(cè)不同豬場(chǎng)送檢的128份豬血清樣本，并與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較（表5）。從表5中可以看出，用IDEXX ELISA試劑盒檢測(cè)為陽性的114份血清中，間接gB768-ELISA檢出106份陽性，陽性符合率為93.0%（106／114）；IDEXX ELISA 試劑盒檢測(cè)為陰性的14份血清中，間接gB768-ELISA檢14份陰性，陰性符合率為100%；間接gB768-ELISA檢測(cè)方法與IDEXX ELISA試劑盒的總符合率為93.8%（（106＋14）／128）。

表5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 The detection result of clinical samples by gB768-ELISA and IDEXX ELISA Kit

3 討論

20世紀(jì)90年代起，PRV基因缺失疫苗在全國(guó)得到推廣使用，使偽狂犬病總體上得到了控制［6-7］，但自2011年以來我國(guó)多省報(bào)道新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡的現(xiàn)象，經(jīng)PCR檢測(cè)均為偽狂犬病病毒野毒的感染［8-9］。對(duì)分離病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明新分離毒株與以前分離株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)并且毒力更強(qiáng)，現(xiàn)階段使用的Bartha-K61弱毒疫苗免疫豬后產(chǎn)生的中和抗體對(duì)新分離毒株的中和能力較差［9-12］，表明新分離株可能存在一定抗原變異。

gB糖蛋白是PRV的主要囊膜糖蛋白，在PRV病毒的感染中必不可少，同時(shí)它還在膜融合中起重要作用，介導(dǎo)病毒穿入過程中囊膜與細(xì)胞膜的融合，以及介導(dǎo)感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞之間細(xì)胞膜的融合［13-14］。此外在PRV感染中，gB也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要糖蛋白之一，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體依賴性和補(bǔ)體非依賴性中和抗體，也可以刺激淋巴細(xì)胞增殖及參與LAK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Xuan x等［15］研究表明，經(jīng)gB蛋白免疫的小鼠能夠抵抗PRV的致死性攻擊。

PRV gB蛋白的主要抗原表位存在于59-129aa、214-289aa、507-734aa處。包新奇等［16］通過對(duì)三段抗原表位區(qū)分段表達(dá)并與PRV陽性血清反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在214-289aa、507-734aa處有較好的抗原性。本試驗(yàn)應(yīng)用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了gB基因主要抗原表位區(qū)59-289aa及507-734aa，通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)59-289aa抗原表位區(qū)與PRV陽性血清的反應(yīng)原性比507-734aa更好。因此本試驗(yàn)選擇59-289aa抗原表位區(qū)作為診斷抗原建立間接ELISA診斷方法。

本研究建立的gB768-ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性及可重復(fù)性，且與IDEXX gBELISA試劑盒符合率可達(dá)到93.8%，應(yīng)用前景良好。通過gB768-ELISA方法可以對(duì)偽狂犬病疫苗的免疫效果進(jìn)行評(píng)估，以便豬場(chǎng)制定正確的免疫程序，增加對(duì)新一輪偽狂犬病暴發(fā)的抵抗力。目前，在PRV凈化時(shí)豬場(chǎng)普遍采用gE-ELISA試劑盒區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬，但gE抗體陰性豬可能為疫苗免疫合格豬，也可能為免疫失敗豬，必須同時(shí)檢測(cè)PRV gB抗體才能進(jìn)一步判定疫苗免疫是否合格。因此，通過PRV gE與gB抗體檢測(cè)試劑盒聯(lián)合使用更有利于豬場(chǎng)PRV的凈化。

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