王光鋒，李 舫，王洪利

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV ）引起的禽類的一種傳染病［1］，部分亞型禽流感病毒也可以感染人，自1871年首次在意大利報道以來，世界各地都有特定毒株引起的AI的暴發(fā)和流行，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。AIV亞型眾多，遺傳變異極為頻繁，抗原性變異主要是指流感病毒表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）這兩種蛋白的改變，它們的變異決定著病毒的宿主親嗜性（感染人或禽）、致病性（高致病性或低致病性）、免疫性和暴發(fā)流行等［2］。我國自1994年首次報道從雞群分離到H9N2亞型AIV以來［3］，目前絕大部分省市都有H9亞型AIV的流行，并且宿主譜擴(kuò)散至山雞、鵪鶉等禽類品種，且檢出陽性率不斷增高［4］。

近幾年來，對我國部分省、市、區(qū)活禽市場禽群及發(fā)生呼吸道感染的蛋雞、肉雞開展H9N2亞型AI的病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)H9亞型AIV的陽性率高達(dá)60%以上，說明H9亞型AI在我國廣泛存在［5-7］。山東是養(yǎng)禽大省，H9亞型AI同樣普遍流行［8］。H9亞型AIV感染家禽可導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、免疫抑制，與其他病原共感染或繼發(fā)感染時導(dǎo)致高病死率，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，H9亞型AIV可以感染人、豬等哺乳動物，在公共衛(wèi)生上具有重要意義［9］。

AIV基因組為8節(jié)段的負(fù)鏈RNA，很容易發(fā)生基因突變和重排現(xiàn)象，因此有必要對H9亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進(jìn)化分析。本課題組于2013年從山東省濰坊、淄博、青島、臨沂、濟(jì)南、濱州和煙臺等地區(qū)疑似禽流感發(fā)病雞群中分離到14株病毒，經(jīng)鑒定為H9N2亞型AIV，并對其HA、NA基因保守區(qū)片段進(jìn)行了擴(kuò)增和序列比對分析，以期了解山東地區(qū)近年來H9N2亞型AIV的遺傳變異情況，為H9亞型禽流感的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和雞胚 病料采自2013年山東不同地區(qū)疑似禽流感病死雞的肝、脾、肺和腦等組織。10日齡SPF雞胚購自山東農(nóng)科院家禽所。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清 禽流感H9亞型滅活疫苗（A／chicken／Shandong／6／96株）、禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清、新城疫病毒（NDV）陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol reagent、DEPC購于Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒購自北京天恩澤基因有限公司；無水乙醇、異丙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上公布的H9N2亞型AIV全基因組序列，應(yīng)用Primer 5軟件分別設(shè)計了2對擴(kuò)增引物，各引物的序列、用途及擴(kuò)增長度見表1。所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用滅菌1×TE緩沖液稀釋至20μmol／L，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR所用引物Table 1 The primers of PCR

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離培養(yǎng)

1.2.1.1 病料處理 將采集的疑似禽流感病雞的肝、脾、肺和腦等組織病料剪碎研磨后，按1∶5比例加入pH7.2的PBS（內(nèi)含1 000單位／mL青霉素、1 000μg／mL的鏈霉素），制成勻漿。在-20℃反復(fù)凍融3次，8 000r／min離心15min，取上清并以0.22μm的濾膜過濾除菌。

觀察比較兩種檢查方式半月板損傷診斷結(jié)果與手術(shù)后診斷結(jié)果比較。半月板損傷程度分級[2]：0度：半月板正常無損傷；I度：輕度退行性變，出現(xiàn)團(tuán)片狀信號；Ⅱ度：較重度退行性變，出現(xiàn)線狀信號，未至關(guān)節(jié)面；Ⅲ度：半月板撕裂傷，線性信號至關(guān)節(jié)面。

1.2.1.2 雞胚接種 將上述濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL。棄去24h內(nèi)死亡雞胚，記錄接種死亡時間，收獲24h之后死亡雞胚的尿囊液。

1.2.1.3 雞胚的半數(shù)致死量（ELD50） 將分離毒株的第二代尿囊液做104、105、106、107、108、109、1010倍稀釋，分別接種10日齡SPF雞胚，0.1mL／枚，每一稀釋度接種6枚，記錄雞胚死亡情況，據(jù)Karber法計算其ELD50。

1.2.2 血凝與血凝抑制試驗 根據(jù) GB／T 18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》［10］進(jìn)行病毒的血凝與血凝抑制試驗。根據(jù)病毒的血凝效價，配制4個血凝單位的抗原，分別與AIV（H5、H7、H9）及NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗。

1.2.3 RT-PCR檢測

1.2.3.1 病毒 RNA 的提取 參照 Trizol reagent說明書進(jìn)行。所用試劑均為RNase-free，器皿均用DEPC水處理并經(jīng)過高壓滅菌。取250μL病毒尿囊液，加入750μL Trizol reagent試劑，混勻后室溫孵育5min；加入200μL氯仿，劇烈振搖15s，室溫孵育2min～3min，4℃、12 000r／min離心15min，取上清液500μL；加入500μL異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃、12 000r／min離心10min，棄上清液；加入1 000μL 750mL／L乙醇（DEPC處理水配制），4℃、12 000r／min離心5min，棄上清；沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

1.2.3.2 RT-PCR擴(kuò)增 RT-PCR反應(yīng)根據(jù)北京天恩澤公司兩管式RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系，在PCR反應(yīng)管中分別加入3μL已制備的RNA，加入1μL隨機(jī)引物（0.2 μg／μL），補(bǔ)水到12μL，70℃保溫5min變性模板后立即冰浴，按順序加入4μL RT-buffer（含dNTP）和2μL反轉(zhuǎn)錄酶，瞬時離心混勻。反應(yīng)程序：42℃60min，70℃保溫10min以終止反應(yīng)，然后放置冰上待用。

取5μL～10μL擴(kuò)增產(chǎn)物通過12g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3.3 HA、NA基因的遺傳進(jìn)化分析 HA基因、NA基因保守片段PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定大小正確后，利用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序，測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對，并用DNAstar 5.0與GenBank中下載的H9N2亞型禽流感病毒典型代表株和地方流行株的HA和NA基因序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，用 MEGA 4.0軟件繪制基因進(jìn)化樹（表2）。

表2 分離毒株和參考毒株信息Table 2 The information about isolates and reference strains

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離鑒定

雞胚接種分離到14株病毒（濰坊3株、淄博2株、青島2株、臨沂2株、濟(jì)南2株、濱州2株、煙臺1株），分離株病毒的雞胚平均死亡時間差異不大，在90.0h～120.5h之間。其中 CK／SD／WF3毒株的雞胚平均死亡時間最短為90.0h，而其他病毒的雞胚平均死亡時間都在90h以上，說明它們的致病力較弱。分離毒株對雞胚的ELD50為10-6.33／0.1mL～10-8.17／0.1mL，其中 CK／SD／WF3毒株的 ELD50為10-8.17／0.1mL，表現(xiàn)出較其他13株病毒強(qiáng)的致病力。血凝試驗表明，所有毒株尿囊液均可凝集10mL／L雞紅細(xì)胞，其血凝價為26～211。血凝抑制試驗結(jié)果表明，分離病毒只被禽流感病毒H9亞型陽性血清特異性抑制，血凝抑制效價均為28，不被禽流感病毒H5、H7亞型陽性血清、新城疫病毒陽性血清抑制，初步判定分離毒株是H9亞型禽流感病毒。

2.2 RT-PCR檢測

RT-PCR產(chǎn)物在12g／L的瓊脂糖凝膠電泳分析表明，HA基因片段長度為548bp（圖1A），NA基因片段長度為375bp（圖1B），且分離株與陽性對照株 A／chicken／Shandong／6／96 株擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 HA和NA基因測序與分析

設(shè)計的HA引物預(yù)期能擴(kuò)增出548bp的堿基，測序結(jié)果為548bp；NA引物預(yù)期能擴(kuò)增出375bp，測序結(jié)果為375bp。14株病毒HA基因裂解位點氨基酸序列除分離株CK／SD／WF12為-PSRYSRGL-，CK／SD／JN2為-PARSSR-GL-，其余12株病毒裂解位點均為-PSRSSR／GL-，為2個非連續(xù)的堿性氨基酸R，符合低致病性AIV毒株HA基因裂解位點的序列特點。

圖1 分離毒株RT-PCR鑒定Fig.1 RT-PCR identification of the isolated stiains

將HA和NA基因的序列分別與GenBank中已發(fā)表的國內(nèi)參考毒株HA和NA基因的核苷酸序列進(jìn)行對比分析。分離到的14株H9N2亞型AIV的HA基因，彼此間核苷酸序列同源性為88.5%～100.0%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為87.4%～100.0%；與GenBank已發(fā)表的H9N2亞型AIV國內(nèi)參考毒株的核苷酸序列同源性介于80.5%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為80.1%～100.0%。14株病毒NA基因彼此間核苷酸序列同源性為93.9%～100%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.0%～100.0%，親緣關(guān)系密切；與參考毒株的核苷酸序列同源性介于86.6%～100.0%；推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.5%～100.0%。

2.4 HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用MEGA4軟件分別繪制了14株病毒HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹。14株病毒的HA基因?qū)贇W亞系CK／BJ／94這一大分支，其中13株病毒與代表株 CK／F／98及 CK／BJ／94有一定遺傳距離，與DK／Y280／97同源性最高，核苷酸同源性達(dá)90.3%以上，屬于Y280分支，而CK／SD／JN2獨立于其他13株病毒之外，與代表株CK／F／98遺傳距離最近，核苷酸同源性為96.9%，屬于F／98分支，說明不同地域間H9N2亞型AIV存在一定差異。NA基因同樣均來自CK／BJ／94這一大分支，與DK／Y280／97遺傳距離最近，同源性達(dá)93.6%以上，屬于Y280分支（圖2）。

3 討論

禽流感病毒低致病力毒株HA基因的裂解位點特征為-PARSSR／G-，而高致病性毒株的分子特征為-R-X-R／K-R／G-（X 為非堿性氨基酸）［11］。本研究分離毒株的裂解位點氨基酸序列為P-S-R-S-SR或P-S-R-Y-S-R，從分子水平上證實為低致病力毒株。從核苷酸組成分析，S與R僅有1個堿基的差異，即AGU （AGC）-AGA （AGG），因此，H9亞型AIV在其裂解位點附近的氨基酸有突變成堿性氨基酸即成為高致病力毒株的可能。但不同于參考毒株Y280（P-A-R-S-S-R），分離毒株第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸（A）突變?yōu)闃O性氨基酸（S），是否會影響病毒的部分生物學(xué)特性，需要進(jìn)一步的試驗研究。

目前H9N2亞型AIV的HA和NA基因的進(jìn)化均分為歐亞和北美2大分支，其中歐亞分支進(jìn)一步又分為3個亞分支，代表株分別為A／chicken／Beijing／1／1994（CK／BJ／94 亞 系）、A／Quail／Hong Kong／G1／97（QA／G1／97 亞系）和 A／duck／Hong Kong／Y439／1997（DK／Y439／97 亞 系）［12-13］，而 內(nèi)部基因形成更多分支，組成不同的基因型［14］。

從進(jìn)化樹可以看出，本研究分離的14株病毒，除濟(jì)南分離株CK／SD／JN2外，其余13株病毒的HA和NA基因均屬于歐亞分支CK／BJ／94分支中的Y280亞系，與其他報道一致［15-16］。這13株病毒和山東省2006年分離株CK／SD／LY／06、2010年分離株 CK／SD／BD／10、2013年分離株 CK／RZ／853／13親緣關(guān)系較近，而與1996年分離株CK／SD／6／96、2000年分離株 CK／SD／1／00及代表株 CK／BJ／94（北京分離株）、CK／F／98（上海分離株）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示2006年-2013年分離株和1994年-2000年分離株在遺傳進(jìn)化上有了一定差異。但從發(fā)育樹上可知，所有分離的H9N2亞型AIV都屬于BJ／94分支，提示山東省 H9N2亞型AIV HA基因、NA基因可能處在一個比較穩(wěn)定的遺傳演化過程。

將山東分離株與不同地域分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示，AIV H9N2亞型山東分離毒株與國內(nèi)不同地域分離的H9N2亞型毒株遺傳進(jìn)化并沒有表現(xiàn)出特殊的地域偏好性，與地理位置相距較遠(yuǎn)的廣東、浙江、上海、湖南等地方分離毒株同源性亦較高。病毒是通過候鳥還是運輸發(fā)生傳播是值得研究的一個方面，明確病毒的傳播途徑和方式對山東地區(qū)禽流感的控制和預(yù)防具有重要意義。

20世紀(jì)90年代以來，我國大陸各地相繼發(fā)生了H9N2亞型禽流感疫情，使用疫苗后該病得到了較好的控制，臨床上該病毒的分離率明顯下降。但近幾年來，該病毒在國內(nèi)養(yǎng)殖場廣泛流行。有學(xué)者對當(dāng)前疫苗的免疫效力產(chǎn)生了懷疑，因為現(xiàn)有疫苗株基本上分離自20世紀(jì)90年代，隨著HA蛋白抗原漂移，現(xiàn)有疫苗株已不能有效保護(hù)流行株的感染［17］。從本研究14株病毒的HA基因、NA基因序列的遺傳進(jìn)化分析可以看出，2010年之后分離株的遺傳距離較近，而與目前中國廣泛使用的H9N2亞型禽流感滅活苗的種毒株 CK／SH／F／98 、Ck／SD／6／96雖同位于BJ／94分支，但具有較遠(yuǎn)的遺傳距離（圖2）。因此，疫苗株與流行株之間的抗原差異可能是導(dǎo)致近年來H9亞型禽流感免疫保護(hù)效果不好的重要原因之一。這提示制備疫苗時，要采用流行毒株作為種毒才能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。

圖2 H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of HA and NA genes of H9N2AIV

HA和NA基因相對頻繁的變異，使得低致病力流感病毒基因重組后可能成為毒力較強(qiáng)的毒株，多數(shù)H9亞型AIV的受體結(jié)合位點226位均為L，具有人受體結(jié)合特異性，對公共健康具有潛在的重大威脅［18-19］。所以在今后的工作中，加強(qiáng)對H9N2亞型AI的流行病學(xué)監(jiān)測是非常必要的。

本研究通過對山東省2013年不同地方分離的H9N2亞型AIV的HA和NA基因遺傳進(jìn)化分析，豐富了山東省雞源禽流感流行病學(xué)信息，為了解山東省流行的H9N2亞型AIV的變異情況，指導(dǎo)禽流感疫情防控以及篩選疫苗病毒株提供了依據(jù)。

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