唐 娜，孫翠平，王玉茂，劉吉山，張 倩，賈 銳，謝金文，李書光，苗立中，沈志強(qiáng)，＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

2014年春季，羊小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）在我國呈現(xiàn)暴發(fā)、流行態(tài)勢(shì)［1］，迅速蔓延到全國多個(gè)省、市、自治區(qū)，引起全國廣泛關(guān)注。小反芻獸疫俗稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征，發(fā)病率和病死率均高，與由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）引起的羊梭菌性疾病共同成為2014年影響國內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的兩大主要傳染?。?］。

研究發(fā)現(xiàn)，春季接診病羊臨床診斷中，羊小反芻獸疫與產(chǎn)氣莢膜梭菌性疾病臨床癥狀相似，都可表現(xiàn)腹瀉、死亡，臨床剖檢可見出血性腸炎，胃黏膜出血壞死、腎臟變軟等病變［3-4］。這一方面提示存在小反芻獸疫與產(chǎn)氣莢膜梭菌共同感染或繼發(fā)感染的可能，另一方面也給兩種疫病的鑒別診斷提出了更高的要求。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)2014年流行的小反芻獸疫病毒N蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素編碼的兩段基因序列特點(diǎn)，綜合應(yīng)用RNA／DNA提取技術(shù)和PCR／RT-PCR技術(shù)，建立了鑒別羊小反芻獸疫病毒與產(chǎn)氣莢膜梭菌的雙重PCR檢測(cè)方法，為進(jìn)一步開展羊小反芻獸疫與產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防控研究和診斷試劑開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和菌株 試驗(yàn)所用的PPRV毒株來自天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的小反芻獸疫活疫苗，所用產(chǎn)氣莢膜梭菌株為購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心的CVCC C57-1菌株。肉毒梭菌C 型 （C62-4）、腐敗梭菌（C55-2）、大腸埃希菌（C83-1）、綿羊鏈球菌（C74-10）、羊痘病毒（CV41）均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，由山東綠都生物科技有限公司保存；羊口瘡病毒（SD1201）［5］、牛病毒性腹瀉病毒［6］為本實(shí)驗(yàn)室分離毒株。

1.1.2 樣品 臨床樣本采自2014年1月～6月期間山東、河南、江蘇和河北地區(qū)送診的疑似患羊的肝臟、胃腸組織及血液樣品。

1.1.3 主要試劑 AxyPrep DNA／RNA小量提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaqDNA 聚合酶、DNA 凝膠回收試劑盒、大腸埃希菌DH5α菌株等其他試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 通過GenBank在線序列比對(duì)，應(yīng)用MegAlign軟件分別對(duì)多株代表性產(chǎn)氣莢膜梭菌株的α毒素基因序列和PPRV代表性毒株的N基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定其保守區(qū)及非保守區(qū)序列，采用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 PPRV、產(chǎn)氣莢膜梭菌引物序列Table 1 Primer sequences of PPRV and Clostridium perfringens

1.2.2 樣品中細(xì)菌DNA與病毒RNA的提取 以商品化RNA／DNA提取試劑盒為基礎(chǔ)，對(duì)樣品處理步驟進(jìn)行了改進(jìn)，同步提取細(xì)菌DNA。

在無菌條件下，將新鮮采集的1g組織樣品洗去血污，盡量剪碎，加入少量無菌水，振蕩后靜置5 min，吸取上層液體，12 000r／min離心3min，棄去上清，沉淀加入50μL溶菌酶（20mg／mL）懸浮混勻，37℃孵育20min。將剩余的剪碎組織碾磨勻漿并凍融3次，12 000r／min離心3min，吸取上清150 μL，與上述加入溶菌酶的懸浮液混合，然后按照試劑盒說明書步驟提取DNA／RNA。

從活疫苗和菌落中提取DNA／RNA，先以相應(yīng)稀釋液或無菌水將樣品溶解或懸浮，混合均勻后取150μL樣品液加入50μL溶菌酶，37℃孵育20min后，按照試劑盒說明書步驟提取DNA／RNA。

1.2.3 雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，應(yīng)用引物P2對(duì)提取的DNA／RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。設(shè)立基本反應(yīng)條件和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：premix rTaq10μL，P1-P4共1.5μL，反轉(zhuǎn)錄的 DNA 模板2μL，補(bǔ)足RNase free H2O 6.5μL，反應(yīng)各組分混勻后，放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。基本程序?yàn)椋?4℃4min；94℃30s，53℃ 30s，72℃ 35s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃2min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行15g／L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 將含PPRV N蛋白基因和α毒素基因序列的凝膠切下，按膠純化回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，按常規(guī)方法與pMD18-T載體連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用熱激法轉(zhuǎn)化，涂布Amp＋LB平板，于37℃培養(yǎng)12h～16h，挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)過夜，按高純質(zhì)粒小量制備試劑盒說明書提取質(zhì)粒并PCR鑒定，將提取的陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank登錄的序列比對(duì)分析。

1.2.5 雙重RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 以1.2.3的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對(duì)溶菌酶、反轉(zhuǎn)錄酶作用時(shí)間，以及PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化：比較溶菌酶、反轉(zhuǎn)錄酶分別作用5、10、20、40、60min情況下的擴(kuò)增效果；應(yīng)用梯度PCR儀優(yōu)化退火溫度；分別梯度稀釋引物，優(yōu)化引物濃度（0.01μmol／L～50μmol／L）。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用上述方法提取肉毒梭菌C型（C62-4）、腐敗梭菌（C55-2）、大腸埃希菌（C83-1）、綿羊鏈球菌（C74-10）、羊痘病毒（CV41）、羊口瘡病毒（SD1201）、牛病毒性腹瀉病毒等菌種和毒種的DNA／RNA，并應(yīng)用優(yōu)化的RT-PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶情況。

1.2.7 靈敏度試驗(yàn) 設(shè)置8個(gè)檢測(cè)濃度，進(jìn)行該方法的靈敏度檢測(cè)：測(cè)定PPRV疫苗液的TCID50濃度，根據(jù)濃度分別將疫苗倍比稀釋成終濃度為10-5～102TCID50／mL，將產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1菌液根據(jù)菌落計(jì)數(shù)情況分別將菌液倍比稀釋成終濃度為10-3～104CFU／mL，按照1.2.2、1.2.3、1.2.4方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶情況。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇1.2.7中第3、5、7號(hào)濃度梯度共3個(gè)樣品各做3個(gè)重復(fù)，共9份，按照1.2.2、1.2.3、1.2.4方法進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，分析該方法的批內(nèi)差異。相隔1周后，由3人分別按相同方法步驟檢測(cè)一次，分析該方法的批間差異。

1.2.9 臨床樣品檢測(cè) 收集39份臨床送診的疑似患羊肝臟、胃腸組織及血液樣品，應(yīng)用所建立的鑒別RT-PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立與擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

從PPRV陽性肝臟、胃腸組織、產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性肝臟組織，以及混合樣品中，應(yīng)用所建立的雙重RT-PCR分別擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的PPRV N基因部分序列和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素部分基因序列，克隆測(cè)序分析證實(shí)所擴(kuò)增序列與網(wǎng)上相應(yīng)序列分別具有較高同源性。從電泳圖上可以明顯區(qū)分出PPRV和產(chǎn)氣莢膜梭菌（圖1），擴(kuò)增出的目的片段大小分別為406bp和272bp左右。根據(jù)結(jié)果，確立采用溶菌酶處理-試劑盒提取法作為組織樣品的RNA／DNA提取方法，以兩步法RT-PCR作為基本雙重RT-PCR檢測(cè)方法。

2.2 RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

通過對(duì)溶菌酶作用時(shí)間、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)間、引物濃度等優(yōu)化試驗(yàn)證明，當(dāng)引物濃度分別在1μmol／L～50μmol／L時(shí)（圖2），溶菌酶作用時(shí)間為10min～60min（圖3），RT-PCR均能擴(kuò)增出特異性條帶。退火溫度變化對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響不明顯。最終選擇溶菌酶作用20min，引物濃度為1μmol／L～10μmol／L為最佳反應(yīng)條件。

圖1 雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Duplex RT-PCR results

圖2 不同引物濃度配比時(shí)雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Duplex RT-PCR results with different primer concentrations

圖3 溶菌酶作用不同時(shí)間雙重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Duplex RT-PCR results with different lysozyme reaction time

2.3 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)4種羊病料中常見菌的菌液樣品和3種易感染病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性（圖4），表明該方法具有良好的特異性。

圖4 雙重RT-PCR特異性檢驗(yàn)Fig.4 Specificity test results of duplex RT-PCR

2.4 靈敏度試驗(yàn)

從擴(kuò)增結(jié)果可見（圖5），本方法具有較高的靈敏度。當(dāng)PPRV疫苗株稀釋到0.001TCID50／mL時(shí)，C57-1菌液稀釋到1個(gè)CFU／mL時(shí)，PCR擴(kuò)增仍可為陽性。

圖5 梯度稀釋濃度時(shí)雙重RT-PCR的檢測(cè)靈敏度Fig.5 Sensitivity test results of duplex RT-PCR with different dilutions

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的RT-PCR分別重復(fù)性地檢測(cè)1.2.7中3個(gè)濃度的樣品，其批間差異和批內(nèi)差異分別為4.54%和1.65%，初步分析可能與保存一段時(shí)間后病毒和細(xì)菌的活力下降、以及半數(shù)致病變濃度和菌落計(jì)數(shù)的測(cè)定誤差相關(guān)。

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

用建立的RT-PCR方法檢驗(yàn)來自江蘇、山東、河南、河北的39份疑似樣本，檢測(cè)出PPRV陽性5份（陽性率12.8%），產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性11份（陽性率28.2%），其中2份樣品PPRV與產(chǎn)氣莢膜梭菌均為陽性，提示臨床上可能存在一定程度的共同感染。

3 討論

在動(dòng)物疾病分子診斷技術(shù)的應(yīng)用過程中，現(xiàn)有的商品化細(xì)菌提取方法與病毒提取方法存在較大差別，實(shí)際檢測(cè)時(shí)通常需要分開進(jìn)行。本研究參考國內(nèi)外多篇報(bào)道［7-8］，根據(jù)組織病料的生物化學(xué)特征和梭菌的菌體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合商品化RNA／DNA試劑盒現(xiàn)有技術(shù)，改進(jìn)了組織中病毒與細(xì)菌RNA／DNA提取方法，初步實(shí)現(xiàn)了組織樣品中細(xì)菌與病毒核酸的同步提取。

羊小反芻獸疫在國內(nèi)大面積的暴發(fā)與流行，促使我們更加關(guān)注該病的分子流行病學(xué)和遺傳變異研究。根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，以及基因庫登錄序列比對(duì)分析表明，2014年國內(nèi)流行毒株具有一定的特點(diǎn)。以N蛋白為例，這些毒株之間的N基因序列具有較高的同源性（99.5%～100%）［9］，但與西藏流行毒株同源性相對(duì)低一些，與伊拉克等國家流行的毒株同源性相對(duì)較高［10］。因此，本研究選擇GenBank中與國內(nèi)流行毒株N蛋白基因同源性較高的參考毒株Sungri／96株為模板，以N蛋白基因序列C末端高保守區(qū)域?yàn)榘谢颍?1］，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，Blast分析表明，該引物能夠有效匹配多個(gè)亞群的PPRV N基因，且具有非常好的特異性。RT-PCR試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該對(duì)引物能夠檢測(cè)到0.001TCID50／mL的病毒，與國內(nèi)外報(bào)道的檢測(cè)方法相比，靈敏度較高［12-13］。

目前國內(nèi)診斷羊細(xì)菌病的主要手段仍然以傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鑒定為主［14］，耗時(shí)較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，生物安全風(fēng)險(xiǎn)大。在診斷羊感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥等疫病時(shí)，由于該類疫病有發(fā)病急、死亡快、治療困難等特點(diǎn)，采用傳統(tǒng)診斷方法更是難以及時(shí)有效地做出診斷［15］。近年來，人們陸續(xù)開發(fā)了多種PCR方法用于鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌，并取得了較好的效果［16］。本研究通過前期試驗(yàn)探討了組織中梭菌DNA的提取技術(shù)，并設(shè)計(jì)了產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D、E型通用的α毒素編碼基因擴(kuò)增引物，依托PPRV RT-PCR建立的雙重RT-PCR方法既可以直接從患病羊組織體液樣品中快速檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌（靈敏度達(dá)10CFU／mL），又能夠?qū)崿F(xiàn)PPRV與產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速鑒別診斷。

通過初步臨床應(yīng)用，從組織樣品中檢出多例PPRV和產(chǎn)氣莢膜梭菌，說明本檢測(cè)方法對(duì)于羊小反芻獸疫和產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速鑒別診斷和致病機(jī)理研究具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。不過，由于目前關(guān)于羊小反芻獸疫與羊產(chǎn)氣莢膜梭菌性疾病的致病機(jī)理研究尚不透徹，兩種病混合感染作用機(jī)制、病原的體內(nèi)分布情況等均不明確，本研究所建立的鑒別檢測(cè)方法仍然需要在實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證與優(yōu)化。

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