王玉東，劉俊輝，鄭增忍，王君瑋，王永玲，王曉燕，王樹雙，牛鐘相

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032；2.中國農(nóng)業(yè)大學國際合作與交流處，北京100083；3.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018）

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）粒子主要包括3種主要結(jié)構蛋白，分別為纖突蛋白（S）、膜糖蛋白（M）、內(nèi)部核衣殼蛋白（N），此外還有少量的第4種蛋白（小膜蛋白，E）［1－2］。病毒的纖突蛋白S蛋白由S1和S2兩種糖蛋白組成，血凝抑制抗體和大部分病毒的中和抗體都是由S1誘導產(chǎn)生，具有免疫保護作用；據(jù)謝景偉等［3］報道，S1基因變異最大，是該病毒主要的抗原基因。因此本研究設計了一對S1和S2引物，對S蛋白基因核苷酸進行克隆及序列分析。1998 年王玉東等［4］首次報道了中國發(fā)生了腺胃型IB，并將青島分離株命名為QXIBV。潘杰彥等［5］報道中國青島腺胃型IBV 株（QXIBV 株又稱SD／97／02株）的S1基因全序列及推導出的氨基酸序列被病毒基因庫（Gen－Bank）所收錄，收錄號為AF193423。張小榮等［6］分離的2株河北分離IBV 株屬于QXIBV 基因型。

Geerligs H J等［7］研制了 一 種QX 樣IBV 活 疫苗，其病毒毒株與QXIBV 的同源性高達98.1%。近年來亞洲、歐洲和非洲都有大量IBV－QX 樣病毒感染和發(fā)病的報道。Toffan A 等［8］報道非洲發(fā)生QX 樣IBV。Abro S H 等［9］對IBV－QX 病毒 血清型按全基因序列分型，除了中國QXIBV 血清型外，歐洲多個國家分離到IBV－QX 樣血清型，包括法國、德國、意大利、荷蘭、波蘭、俄羅斯、西班牙、瑞典和英國等都有相關報道，其分離毒株的S1 基因序列都與QXIBV 接近。Sigrist B 等［10］報道在瑞士發(fā)現(xiàn)了冠狀病毒IBV－QX 型感染的病例。Ganapathy K 等［11］報道英國從商品肉雞腺胃炎病例中分離到QX 樣IBV。Zhang X R 等［12］報 道 了 來 源 于SPF 雞IBV纖突蛋白在重組馬立克病病毒的表達；Amin O G M等［13］報道了QX 樣IBV 毒株在中東的傳播，并對許多國家的病毒分離株進行了基因進化分析。Mork A K 等［14］報道了冠狀 病毒IBV－QX 株和B1648病毒纖突蛋白特性的比較。QX 樣IBV 感染病例呈現(xiàn)世界范圍蔓延的趨勢。

為研究腺胃型IBV 山東分離株QX 和DY 及FC的病毒S蛋白的核苷酸特征，確認其與腎型IBV和呼吸型IBV 的同源性。采用分子生物學技術（RT－PCR 試驗方法），對多株IBV 毒株進行了纖突蛋白S基因的擴增，并對QX 和DY 株的S基因擴增產(chǎn)物核苷酸序列進行分析，表明腺胃型IBV 是不同于呼吸型IBV 和腎型IBV 的一種具有明顯腺胃嗜性的IBV 變異株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株 山東省腺胃型IBV 典型分離株青 島 株（QXIBV）、東 營 株（DYIBV）、肥 城 株（FCIBV）、腎型IB分離株（HD），均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心分離鑒定、保存。IBV H52標準株、H120株、M41標準株、腎型IBV－T 株，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要儀器及試劑 臺式高速（12 000r／min）離心機為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DNA 擴增儀為美國MJ Research 公司產(chǎn)品；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽和凝膠成像分析系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品；振蕩器購自江蘇常州國華公司；恒溫水浴鍋為天津泰斯特儀器公司產(chǎn)品；冰箱為青島海爾公司產(chǎn)品。

NaCl，MgCl2，NaH2PO4，Na2HPO4，KH2PO4，K2HPO4，KCl，NaOH，HCl，三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris），EDTA，異丙醇，無水乙醇，氯仿，總RNA 抽提劑（Trizol），瓊脂糖，溴化乙錠，硼酸，分別為山東賽恩斯科技公司和青島愛普科生物工程公司產(chǎn)品。

Taq DNA 聚合酶為上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品；M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、脫氧核苷三磷酸（dNTP）、DEPC（焦碳酸二乙酯）為Promega公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 引物 參照GenBank注冊的IBV S通用基因序列，自行設計了一對跨幅約0.9kb的引物，該區(qū)段包含了S1基因C 末端的400bp和S2基因N末端的500bp。該基因片段具有良好的保守性和遺傳特異性，是IBV S基因研究者選擇較多的合成引物。引物預期擴增片段大小為750bp～950bp，引物的使用濃度為10pmol／μL。

引物序列如下：S1：5′CAAGGTTTTATTACTAATGT 3′；S2：5′AGCAAACCATTATATTCACGA 3′。以上引物由上海博亞生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取 分別取典型腺胃型IBV 分離株（QX 株、DY 株、FC 株）的 病 毒 尿 囊 液 各100 μL，放入1.5mL的離心管中，加500μL Trizol，上下顛倒5次，混勻，室溫放置15 min。加入100μL氯仿，渦旋混勻，室溫放置8 min，期間混勻2 次。12 000r／min離心15min，取上清200μL加200μL異丙醇混勻，在－20℃放置過夜。12 000r／min離心15min，緩慢倒掉上清，沿管壁緩慢加750mL／L乙醇0.5mL進行洗滌一次，緩慢倒掉750mL／L乙醇，倒扣于吸水紙上，置超凈工作臺晾干，加入20 μL DEPC處理的無菌雙蒸水溶解核酸，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄（RT） 在干凈的1.5mL 的離心管中依次加入以下試劑：5×M－MLV RT buffer 4μL，40 U RNA 酶 抑 制 劑1 μL，2.5 mmol／L dNTP 3μL，10pmol／μL 混合引物（S1＋S2）1μL，RNA 提取樣品5μL，200 U M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，雙蒸水5μL，總體積為20μL。混勻后置42℃30min，37℃30min，95℃3min，冷卻至4℃。

1.2.3 目的基因的PCR 擴增 在0.2mL 的反應管中依次加入以下試劑：10×PCR buffer 3μL，25 mmol／L MgCl22μL，2.5 mmol／L dNTP 3μL，10 pmol／μL的混合引物（S1＋S2）1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，5UTaq DNA 聚合酶0.5μL，雙蒸水15.5 μL，總體積30μL。PCR 反應條件為：94℃5min；35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃1 min，55℃1 min，72℃2min；最后72℃延伸10min。

1.2.4 PCR 產(chǎn) 物 檢 測 獲 得 的PCR 產(chǎn) 物 于10 g／L瓊脂糖凝膠（已含有0.5μg／mL 的溴化乙錠），在電壓100 V～120 V 條件下，電泳30 min～60 min。當電泳結(jié)束后，取出凝膠反應板，放置于凝膠成像分析系統(tǒng)中進行觀察，并照相記錄。

1.2.5 S基因序列測定及分析 將PCR 產(chǎn)物純化后，用引物S1 進行測序。使用DNAstar序列分析軟件，對克隆的S基因核苷酸同源性進行比較。為探討不同分析方法的優(yōu)勢和特點，消除因不同方法產(chǎn)生的誤差，保證分析結(jié)果的準確性和科學性，選擇國際通用的Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method三種方法，分別對2株腺胃型QX 株、DY 株、1株 腎 型IB HD 株 和 標 準M41株 的S基因核苷酸序列進行比對，對其同源性進行分析。由上海博亞生物技術有限公司協(xié)助完成。

1.2.6 S基因序列進化關系分析 使用DNAStar對腺胃型IBV（QX 株、DY 株）與標準株（M41株）和腎型IBV（HD 株）同源性進行進化關系分析。由上海博亞生物技術有限公司協(xié)助完成。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR 擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果

用自行設計的一對S基因引物，通過RT－PCR擴增產(chǎn)物進行檢測（圖1、圖2）。山東分離腺胃型QX 株、DY 株、腎型HD 株均與標準株（H52、H120、M41）產(chǎn)物的電泳條帶相似，大小約為900bp（在789bp～857bp之間，標準株M41株為857bp），表明設計引物對IBV 具有良好的特異性。其中QX 株和DY 株與標準呼吸型IB M41、H52、H120、腎型HD 株出現(xiàn)的條帶明顯；FC 株產(chǎn)物有較大差異（僅為500bp），未對其第2次基因擴增，也未分析比對；腎型IB－T 株未形成明顯的產(chǎn)物條帶。對M41標準株、QX 株、DY 株、腎 型IB 分 離 株HD 株 四 株 病 毒進行第2次RT－PCR，其擴增產(chǎn)物的電泳條帶與第一次的結(jié)果相同（約為900pb）。

2.2 S基因序列測定結(jié)果

將M41株、HD 株、QX 株、DY 株4 株IBV 病毒的PCR 擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果見圖3～圖6。4株病毒S 基因均為IBV 的部分S 基因，其中M41株病毒S基因產(chǎn)物為857bp，S基因序列為多數(shù)基因序列；腺胃型QX 株為837bp，DY 株為852 bp，腎型HD 株為789bp。各病毒被擴增出的基因片段均含有編碼部分S蛋白的閱讀框架（ORF）。

2.3 S基因核苷酸同源性分析

2.3.1 Clustal V method、Jotun Hein method 和Clustal W method三種方法分析圖 對2株腺胃型分 離株（QX 株、DY 株），1株 腎 型IB HD 株 和 標 準株M41株的S基因核苷酸序列進行比對，對其同源性進行了分析（圖7～圖9）。對QX 株、DY 株、HD株和M41標準株進行S基因核苷酸序列分析及其同源性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種方法之間略有差異，核苷酸分析同源性數(shù)值Jotun Hein 法較高，Clustal W法次之，Clustal V 法最低。

圖1 9種IBV 的S基因擴增產(chǎn)物條帶Fig.1 The amplification products of S genes of 9IBV strains

圖2 4種IBV 的S基因擴增產(chǎn)物條帶Fig.2 The amplification products of S genes of 4IBV strains

圖3 病毒標準株（M41株）的S基因測序結(jié)果Fig.3 S gene sequencing of reference IBV M41strain

圖4 腎型IB分離株（HD 株）的S基因測序結(jié)果Fig.4 S gene sequencing of nephric type IBV HD strain

圖5 腺胃型IB病毒青島株（QX 株）的S基因測序結(jié)果Fig.5 S gene sequencing of proventriculus type IBV Qingdao QX strain

圖6 腺胃型IBV 東營株（DY 株）的S基因測序結(jié)果Fig.6 S gene sequencing of proventriculus type IBV DY strain

圖7 用Clustal V 方法分析結(jié)果Fig.7 Analysis result by clustal V method

圖8 用Jotun Hein 方法分析結(jié)果Fig.8 Analysis result by Jotun Hein method

圖9 用Clustal W 方法分析結(jié)果Fig.9 Analysis result by Clustal W method

2.3.2 S基因核酸的同源性分析 按Clustal V 法QX 株和標準M41株的同源性達到64.6%；DY 株與標準M41株的同源性為73.8%；腎型IB HD 株與M41株的同源性為70.9%；QX 株與HD 株的同源性為65.7%；DY 株與HD 株的同源性為70.4%；QX 株與DY 株的同源性為79.7%。QX 株與DY株的差異性為4.3%。QX 株和DY 株與M41株的差異性分別為24.7%和22.4%。QX 株和DY 株與HD 株的差異性為22.7%和23.4%。HD 株與M41株的差異性為19.8%。

按Jotun Hein法 同源性比較的數(shù)值均略高于Clustal V 法。QX 株和標準M41株的同源性為79.3%；DY 株與標準M41株的同源性為79.2%；HD 株與M41株的同源性為80.8%；QX 株與HD株的同源性為78.4%；DY 株與HD 株的同源性為78.9%；QX 株 與DY 株 之 間 的 同 源 性 為95.8%，QX株與DY 株的差異性為3.8%；QX 株和DY 株與M41株的差異性分別為24.5%和24.6%；QX 株和DY 株與HD 株的差異性分別為25.8%和25.2%；HD 株與M41株的差異性為22.3%。QX株和DY 株同源性極高，為95.8%。

按Clustal W method 法 QX 株和標準M41株的同源性為75.7%；DY 株與標準M41株的同源性為77.2%；HD 株與M41株的同源性為79.6%；QX 株與HD 株的 同源性為74.8%；DY 株與HD株的同源性為76.5%；QX 株與DY 株的同源性為90.5%，QX 株與DY 株的差異性為4.2%；QX 株和DY 株與M41 株的差異性分別為24.5%和22.3%。QX 株和DY 株與HD 株的差異性均為22.7%，HD 株與M41株的差異性為20.5%。

歸納三種分析方法結(jié)果，QX 株和DY 株的S基因的核苷酸同源性最高達到95.8%，最小差異性為3.8%（張小榮［4］分離的QXIBV 基因型2分離株的同源性僅為77.7%）。QX 株和DY 株病毒與標準病毒M41株的同源性最高達79.3%和79.2%，最小差異性為24.5%和22.3%。QX 株和DY 株與HD 株的同源性最高達78.4%和78.9%，最小差異性均為22.7%。腎型HD 株與M41株的同源性最高達到80.8%。腺胃型QX 株和DY 株分別與呼吸型M41株及腎型HD 株的同源性差異不明顯。結(jié)果表明，腺胃型IBV 與呼吸型IBV 和腎型IBV 是不同組織嗜性的傳染性支氣管炎病毒變異株，與呼吸型和腎型IBV 具有同等重要地位的進化階段。

2.4 S基因系列進化關系分析

對腺胃型QX 株、DY 株和腎型HD 株與標準株M41株進化關系分析見圖10。QX和DY 株、M41和腎型HD株各為一個分支；4株病毒分成2個群，Ⅰ群包含M41 株和腎型HD 株兩株病毒，遺傳距離為19.8%～22.3%，同源性在70.9%～80.8%之間。Ⅱ群包含了QX 株和DY 株，遺傳距離在3.8%～4.3%之間，同源性在79.7%以上，QX 株和DY 株之間同源性最高達95.8%。腺胃型QX 和DY 株的遺傳距離很小，按Jotun Hein 法分析僅為3.8%。通過進化分析說明，腺胃型IBV 與腎型IBV 和呼吸型IBV 是不同的IBV 病毒的變異株。

圖10 4株病毒S基因系列進化關系分析圖Fig.10 The phylogenetic analysis of S genes of 4viral strains

3 討論

3.1 引物設計和基因序列分析

由于IBV 變異性強，引物的設計必須在基因的高度保守區(qū)內(nèi)進行，以便能獲得一對能廣泛應用于所有IBV 的通用引物。但為了能對分離的病毒進行分類，又必須選擇能代表病毒基因變異的區(qū)域進行研究，S纖突蛋白基因被當作IBV 分型的主要研究對象。

在S纖突蛋白中S2蛋白相對保守，但同樣含有兩個抗原決定簇。S1 基因的3／4 處屬于多變區(qū)［15］。參考基因庫IBV S基因序列，自行設計了一對引物，對9株IBV 進行了RT－PCR，其中7株均形成了特異的目的基因片段，獲得了理想的擴增產(chǎn)物。QX 株、DY 株、腎 型HD 株 及M41 株 四 株 病 毒 的RT－PCR 擴增產(chǎn)物大小范圍為787bp～857bp，對其進行基因序列測定及同源性分析，表明腺胃型IBV 分離株QX 株和DY 株是一種不同于呼吸型和腎型IBV 的組織嗜性的新的病毒變異株。QX 和DY 株兩株病毒的同源性高達95.8%。QX 和DY株與M41標準株及腎型HD 株的同源性較低。因FC株的PCR 擴增產(chǎn)物與標準株有較大差異，未進行DNA 序列分析和同源性比較。

3.2 腺胃型IBV 分子流行病學分析

從臨床上表現(xiàn)典型癥狀的病雞分離到2株病毒QX 株和DY 株均有嗜腺胃特性，說明我國流行的IBV 與疫苗毒株和國際上許多IBV 毒株發(fā)生了明顯的變異。按進化關系分析QX 株和DY 株為一群，這兩株腺胃型IBV S 基因序列有高度的同源性。

腺胃型IBV 分離株QX 株和DY 株都與國內(nèi)流行的腎型IB HD 株和標準毒株M41株具有較遠的親緣關系。近年來嗜腺胃型IBV 的研究也不斷有所發(fā)展。王玉東等［16］報道，腺胃型IBV 是與呼吸型和腎型IBV 不同血清型的變異株。王玉東等［17］進行的山東分離株（QX 株、DY 株、FC株）SPF雞致病回歸試驗獲得了成功，外源病毒的檢測均為陰性。對山東3個分離株進行了病毒病理學和超微結(jié)構的研究，表明本病的病原為冠狀病毒屬的嗜腺胃型IBV 病毒［18］。

Beato M S等［19］報道了IBV 中國分離株QXIBV 在意大利傳播流行的證據(jù)。Pohuang T 等［20］報道中將泰國分離的IBV 進行S1基因的序列分析。近年來該病呈世界性流行，Abro S H 等［9］的報道表明歐洲發(fā)病病例最多。

3.3 對引起腺胃炎病變的腺胃型IBV 病原學研究和防疫的思考

1995年－1996年發(fā)生于江蘇省和山東省的腺胃型IB，國外最初未見此類疾病的報道，是一種新的IBV 變異株。Saif Y M 主編的禽病學第11版和第12版均引用了王玉東的報道［1－2］。10余年來，中國各地呈現(xiàn)蔓延趨勢，使用中國青島分離株（QXIBV 株）和山東分離株病毒制備的油乳劑滅活苗，在中國大面積范圍內(nèi)使用表明，免疫效果好，保護率高［4，16］。國外近年來也陸續(xù)有疫苗研制的報道，Terregino C 等［21］報 道，意 大 利 分 離 株IBV－QX 株對SPF雞和商品肉雞的致病性，在蛋雞和肉雞場1日齡和14日齡時免疫Ma5和4／91變異株疫苗，對降低發(fā)生IBV－QX 感染時引起的經(jīng)濟損失具有幫助作用。Geerligs H J等［7］報道的一種與QXIBV 基因同源性高達98.1%的IB－QX 類病毒疫苗，主要用于雞腎型IB的免疫，目前未進行大面積推廣，免疫效果如何，尚未可知。

近年來國內(nèi)對本病的病原學研究一直爭論不休，包括傳染性支氣管炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒、新城疫病毒、細小病毒、呼腸病毒等病原在有關腺胃炎的研究中都有分離到。我們認為該病的病原為一種IBV 變異株－即腺胃型IBV 變異株。IBV的多變異特性對IBV 引起的傳染病的診斷和防疫帶來了嚴重的困難，所以如何快速、及時地對所分離的IBV 進行分析和研究，對IBV 的防控十分重要。對該病病原的分子流行病學分析研究，仍然是未來一段時間研究的重要內(nèi)容。

［1］ Saif Y M.禽病學［M］.11版.蘇敬良，高 福，索 勛，主譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：108－130.

［2］ Saif Y M.禽病學［M］.12版.蘇敬良，高 福，索 勛，主譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：129－151.

［3］ 謝景偉，陳 峰，謝青梅，等.雞傳染性支氣管炎病毒分子流行病學研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2008，29（8）：75－78.

［4］ 王玉東，王永玲，張子春，等.雞腺胃型傳染性支氣管病毒（QXIBV）的分離和鑒定［J］.中國動物檢疫，1998，15（1）：1－3.

［5］ 潘杰彥，陳德勝，戴亞斌，等.IBV 青島腺胃分離株（SD／97／02）S1蛋白基因的序列測定和分析［J］.中國病毒學，2001，16（4）：377－381.

［6］ 張小榮，程靖華，陳啟穩(wěn)，等.雞腺胃分離的傳染性支氣管炎病毒基因型與致病性研究［J］.揚州大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2012，33（4）：6－9.

［7］ Geerligs H J，Boelm G J，Meinders C A，et al.Efficacy and safety of an attenuated live QX－like infectious bronchitis virus strain as a vaccine for chickens［J］.Avian Pathol，2011，40（1）：93－102.

［8］ Toffan A，Monne I，Terregino C，et al.QX－like infectious bronchitis virus in Africa［J］.Vet Rec，2011，169（22）：589.

［9］ Abro S H，Rrenstrom L H，Ullman K，et al.Characterization and analysis of the full－length genome of a strain of the european qx－like genotype of infectious bronchitis virus［J］.Arch Virol，2012，157（6）：1211－1215.

［10］ Sigrist B，Tobler K，Schybli M，et al.Detection of avian coronavirus infectious bronchitis virus type qx infection in switzerland［J］.J Vet Diagn Invest，2012，24（6）：1180－1183.

［11］ Ganapathy K，Wilkins M，F(xiàn)orrester A，et al.QX－like infectious bronchitis virus isolated from proventriculitis in commercial broilers in England［J］.Vet Rec，2012，doi：10.1136／vr.101005：1－2.

［12］ Zhang X R，Wu Y T，Huang Y Z，et al.Protection conferred by a recombinant Marek＇s disease virus that expresses the spike protein from infectious bronchitis virus in specific pathogen－free chicken［J］.Virol J，2012，9：85.

［13］ Amin O G M，Valastro V，Salviato A，et al.Circulation of QX－like infectious bronchitis virus in the Middle East［J］.Vet Rec，2012，171：530.

［14］ Mork A K，Hesse M.Differences in the tissue tropism to chicken oviduct epithelial cells between avian coronavirus IBV strains QX and B1648are not related to the sialic acid binding properties of their spike proteins［J］.Vet Res，2014，45（1）：67.

［15］ 于圣青，譯.與傳染性支氣管炎病毒血清型有關的S1亞基氨基酸差異的定位［J］.中國家禽，1994（4）：30－31.

［16］ 王玉東，王永玲，范根成，等.雞腺胃型傳染性支氣管炎（綜述）［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2001，32（1）：64－72.

［17］ 王玉東，王永玲，張國中，等.三株腺胃型傳染性支氣管炎病毒分離毒株對雞的致病性試驗［J］.中國獸醫(yī)科學，2015，45（2）：195－201.

［18］ 王玉東，王永玲，王君瑋，等.山東分離株雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒病理組織學和電鏡觀察［J］.中國獸醫(yī)雜志，2015年，待發(fā)表.

［19］ Beato M S，De Battisti C，Terregino C，et al.Evidence of circulation of a Chinese strain of infectious bronchitis virus（QXIBV）in Italy［J］.Vet Rec：J Bri Vet Asso，2005，156（22）：720.

［20］ Pohuang T，Chansiripornchai N，Tawatsin A，et al.Sequence analysis of S1genes of infectious bronchitis virus isolated in Thailand during 2008－2009：identification of natural recombination in the field isolates［J］.Virus Genes，2011，43（2）：254－260.

［21］ Terregino C，Toffan A.Pathogenicity of a QX strain of infectious bronchitis virus in specific pathogen free and commercial broiler chickens，and evaluation of protection induced by a vaccination programme based on the Ma5and 4／91serotypes［J］.Avian Pathol，2008，37（5）：487－493.