毛倩倩，卜　賓，唐青海，闞云超，姚倫廣，唐存多，焦鑄錦，楊建偉（南陽師范學(xué)院南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實驗室，河南南陽473061）

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犬細(xì)小病毒NY株VP2蛋白的原核表達(dá)及反應(yīng)原性鑒定

毛倩倩，卜賓，唐青海＊，闞云超，姚倫廣，唐存多，焦鑄錦，楊建偉＊
（南陽師范學(xué)院南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實驗室，河南南陽473061）

摘 要：犬細(xì)小病毒（CPV）編碼的VP2基因容易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒嗜性和致病性的改變。為制備一株高致病性的CPV毒株（NY株，基因型為2a型）重組VP2蛋白，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a-CPVVP2，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）表達(dá)菌株，通過不同溫度、不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時間等條件的優(yōu)化進行表達(dá)蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot進行蛋白鑒定。結(jié)果表明，重組CPV-NY毒株VP2蛋白（rVP2）的分子質(zhì)量約為72ku，在不同溫度條件下均以包涵體形式存在，在37℃條件下以終濃度為0.2 mmoL/L IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)量達(dá)到最高。rVP2不僅與His標(biāo)簽mAb反應(yīng)，也能與CPV特異性陽性血清反應(yīng)，說明rVP2具有良好的反應(yīng)原性，為CPV抗體檢測試劑盒和基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒NY株；VP2；原核表達(dá)；鑒定

犬細(xì)小病毒病以出血性腸炎、劇烈嘔吐、白細(xì)胞減少及心肌炎為主要特征［1］，該病發(fā)病率高，傳染性強，病死率高，成為危害犬和貓健康的重要傳染病之一［2-3］。該病的病原是犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV），該病毒屬于細(xì)小病毒科（Pavoviridae），細(xì)小病毒屬（Pavovirus）。該病毒基因組為單股、負(fù)鏈、線形DNA，全長5 323bp，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，其中，VP2基因全長1 755bp，編碼584aa［4-5］。作為CPV衣殼的主要亞單位組分，VP2蛋白已被證明有良好的免疫原性，是制備CPV基因工程疫苗的侯選保護性抗原［6］。CPV毒株間的差異主要是由VP2蛋白氨基酸序列中某些位點的改變造成的［7］。在免疫壓力和自然因素的綜合影響下，該病毒由原始的基因1型進化為基因2型，繼而又分化成2a和2b型將其取代，近年來又出現(xiàn)了2c型，每次變異都引起病毒在致病性和宿主嗜性方面的變化［8-9］。2010年，我國檢測到CPV-2c型毒株［10］，目前我國還是以2a和2b型為主要流行毒株［］。

本實驗室從南陽地區(qū)分離到一株高致病性的CPV毒株（命名為CPV NY株），通過基因分析，該毒株屬于2a型。本試驗對CPV NY毒株編碼的VP2蛋白進行原核表達(dá)，通過各項條件優(yōu)化得到一株高效表達(dá)菌株，表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為進一步研究相應(yīng)的抗體檢測試劑盒和基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

載體pET28a為Novagen公司產(chǎn)品；大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購于北京天根生化科技有限公司；IPTG、內(nèi)切酶（BamHⅠ、HindⅢ）購自TaKaRa公司、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；BugBuster購自美國Novagen公司；Anti-His單抗和HRP-Goat amti-Mouse酶標(biāo)二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；犬五聯(lián)多抗購自西諾潔普公司；CPV高免血清購自原解放軍獸醫(yī)大學(xué)獸藥生物制品研究中心；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1VP2基因的擴增及重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以CPV DNA為模板，以CPV-VP2-ORF-F和CPV-VP2-ORF-R為引物進行PCR擴增，上游引物CPV-VP2-ORF-F的序列為ACTGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC（下劃線序列為BamHⅠ酶切位點）下游引物CPV-VP2-ORF-R的序列為ACTAAGCTTTTAGTATAATTTTCT-AGGTGCTAGTTGA（下劃線序列為HindHⅢ酶切位點）PCR反應(yīng)體系為：模板CPV VP2質(zhì)粒4μL；CPV-VP2-PRF-F 1μL；CPV-VP2-PRF-R 1μL；5×prime STAR GXL buffer 10μL；dNTP Mixture 4μL；Prime STAR GXLDMA poly merase 1μL；ddH2O 29μL。反應(yīng)程序為：95℃4min；98 ℃10s，56℃30s，68℃2min，循環(huán)35次；最后68℃延伸7min，4℃保存。用膠回收試劑盒（Axygen生物技術(shù)有限公司）純化PCR產(chǎn)物，回收的目的片段載體pET28a連接，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定并測序。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)和VP2基因的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定分別吸取pET28a-CPV-VP2和pET28a空載的轉(zhuǎn)化菌液BL21（DE3）5μL于4mL含有Kan+的LB培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日，按照1∶100的接種比例分別將40μL菌液接種于4mL含有Kan+的LB培養(yǎng)基中放入37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1h～2h，當(dāng)菌液OD 600nm=0.6 ～0.8時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，37℃、200r/min誘導(dǎo)4h，收集菌體。分別用100μL的BugBuster懸起，離心20min，包涵體用100μL PBS懸起，進行SDS-PAGE電泳。Western blot鑒定：分別是一抗為Anti-His單抗（1∶3 000稀釋），二抗為HRP-Goat.anti-Mouse（1∶2 000稀釋）；一抗為CPV多克隆抗體（1∶200稀釋），二抗為HRP-SPA （1∶2 000稀釋）；一抗為五聯(lián)多抗CPV（1∶200稀釋），二抗為HRP-SPA（1∶2 000稀釋）。

1.2.3VP2表達(dá)條件的優(yōu)化 最佳誘導(dǎo)溫度試驗：細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，當(dāng)菌液OD600nm=0.6～0.8時，每管加入終濃度為0.2mmoL/L IPTG，分別置于25℃、28℃、37℃，200r/min誘導(dǎo)4h后，收集菌體，方法同上，進行SDS-PAGE電泳。

最佳誘導(dǎo)劑濃度試驗：當(dāng)菌液OD600nm=0.6 ～0.8時，選擇最佳誘導(dǎo)溫度，不同IPTG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmoL/L），200r/min誘導(dǎo)4h，方法同上進行SDS-PAGE電泳。

最佳誘導(dǎo)時間試驗：當(dāng)菌液OD600nm=0.6～0.8時，選擇最佳誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)劑濃度分別誘導(dǎo)不同時間（1、2、4、8h），方法同上進行SDS-PAGE電泳。

2　結(jié)果

2.1CPV VP2基因的擴增與pET28a-CPV-VP2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1CPVVP2基因的擴增 用上游引物CPVVP2-ORF-F和下游引物CPV-VP2-ORF-R以 CPV-VP2基因為模板進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳，得到一段1 755bp的核酸片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1　CPV VP2基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of CPV VP2gene

2.1.2pET28a-CPV-VP2重組表達(dá)載體的鑒定重組子pET28a-CPV-VP2經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，12g/L瓊脂糖凝膠電泳，分別得到片段為1 755bp的目的條帶和5 369bp的載體片段，表明目的基因已經(jīng)成功克隆到pET28a載體中（圖2）。

圖2　重組表達(dá)載體pET28a-CPV-VP2的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmidpET28a-CPV-VP2by enzyme digestion

2.2CPV VP2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

2.2.1CPV VP2的誘導(dǎo)表達(dá) 在誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG濃度為1.0mmoL/L，誘導(dǎo)4h，目的蛋白在pET28a-CPV-VP2包涵體中表達(dá)（圖3），上清中不存在目的蛋白，目的蛋白條帶約為72ku。

2.2.2重組蛋白rVP2的Western blot鑒定 將與2.2.1中的SDS-PAGED試驗中一樣的蛋白膠經(jīng)轉(zhuǎn)膜后采用Anti-His單抗，進行Western blot檢測，pET28a-CPV-VP2包涵體中得到一條72ku的目的條帶（圖4），說明rVP2能與His單抗反應(yīng)。采用一抗為CPV高免血清抗體（1∶200稀釋）或者是采用商品化的犬五聯(lián)多克隆抗體，二抗為HRP-SPA（1∶2 000稀釋），進行檢測，結(jié)果顯示，pET28a-CPV-VP2包涵體蛋白在72ku處有一個目的條帶（圖5和圖6），說明包涵體形式的重組蛋白能與陽性血清反應(yīng)。

圖3　重組蛋白rVP2的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of recombinant protein rVP2

圖4　重組蛋白rVP2的Western blot鑒定（His單克隆抗體）Fig.4 Identification of recombinant protein rVP2by Western blot（His mAb）

2.3誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3.1最佳誘導(dǎo)溫度 IPTG濃度為0.2mmol/ L，誘導(dǎo)溫度分別為25℃、28℃、37℃，誘導(dǎo)4h（圖7），25℃時的蛋白表達(dá)量明顯低于28℃和37℃，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃和37℃時，蛋白表達(dá)量無差別，且只存在于包涵體，在上清中不存在。

2.3.2最佳IPTG誘導(dǎo)濃度 誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmoL/L，誘導(dǎo)4 h（圖8），結(jié)果表明IPTG濃度為0.2mmoL/L時，CPV-VP2蛋白表達(dá)量最高，僅在包涵體中表達(dá)。

圖5　重組蛋白rVP2的Western blot鑒定（CPV多克隆抗體）Fig.5 Identification of recombinant protein rVP2by Western blot（CPV pAb）

圖6　重組蛋白rVP2的Western blot鑒定（犬五聯(lián)多克隆抗體）Fig.6 Identification of recombinant protein rVP2by Western blot （canine five united pAb）

2.3.3最佳誘導(dǎo)時間 誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG濃度為0.2mmoL/L，誘導(dǎo)時間分別為1、2、4、8h，結(jié)果顯示，通過改變誘導(dǎo)時間發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)4h和8h時蛋白的表達(dá)量最高，且只存在于包涵體中（圖9）。

3　討論

由于CPV VP2基因容易發(fā)生變異，目前CPV已經(jīng)出現(xiàn)了多個基因型，不同基因型的病毒嗜性和致病性均不盡一樣。本試驗室從南陽地區(qū)分離到一株高致病性的CPV毒株（命名為NY株），為了研究該病毒抗體檢測試劑盒和基因工程亞單位疫苗，本試驗通過擴增CPV NY毒株VP2基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體，進行表達(dá)條件的優(yōu)化，并對重組蛋白rVP2的反應(yīng)原性進行鑒定。結(jié)果表明，CPV NY毒株VP2基因全長1 755bp，編碼585aa，就VP2核酸序列進化分析顯示，該毒株屬于CPV2a型（該毒株基因組全長數(shù)據(jù)待發(fā)表）。原核表達(dá)時，25℃誘導(dǎo)時的蛋白表達(dá)量明顯低于28℃和37℃，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃和37℃時，蛋白表達(dá)量無太大差別，溫度的改變并不能改變rVP2的表達(dá)形式，即便把溫度降低至25℃目的蛋白還是以包涵體形式存在；當(dāng)IPTG終濃度為0.2mmoL/L時，rVP2表達(dá)量最高，增加IPTG濃度無助于rVP2表達(dá)量的提高；在誘導(dǎo)4h時rVP2的表達(dá)量最高，如果再把誘導(dǎo)時間延長為8h蛋白量無明顯增加。Western blot結(jié)果表明，rVP2包涵體形式與His-mAb和CPV陽性血清均呈現(xiàn)良好的反應(yīng)活性。

圖7　誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of induction temperature on the expression of protein

圖8　不同IPT G濃度對蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of different IPTG concentrations on the expression of protein

圖9　誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量的影響Fig.9 Effects of induction time on the expression level of protein

原核表達(dá)系統(tǒng)中，CPV VP2蛋白的表達(dá)以包涵體和可溶性兩種形式存在。李慕瑤等［12］將CPV VP2基因全長克隆到pET30a載體中，蛋白以包涵體形式存在；張坤和趙丹等［13-14］用同樣的方法得到了以包涵體形式存在的VP2蛋白；陳勝男等［15］對VP2全長進行擴增，用pGEX-4T-2作為表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中進行表達(dá)，通過Glutathione Sepharose 4B親和層析柱法純化目的蛋白，得到可溶性GST-VP2蛋白；王凈等［16］對CPV VP2蛋白進行截短表達(dá)，得到可溶性融合蛋白GSTVP2；易立等［17］克隆去除5′和3′端的稀有密碼子的VP2基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-VP2和pET32a-VP2，轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中進行表達(dá)，但作者沒有提及目的蛋白是可溶性還是包涵體形式。本試驗克隆了VP2基因全長，構(gòu)建原核表達(dá)載體，分別在VP2蛋白的N端和C端融合His標(biāo)簽，重組蛋白rVP以包涵體形式存在，無可溶性表達(dá)。通過對比分析，VP2蛋白是否為可溶性表達(dá)與該基因長度、稀有密碼子含量、所用的表達(dá)載體和表達(dá)菌株等因素等有關(guān)。

原核表達(dá)系統(tǒng)制備的CPV VP2蛋白的兩種形式（包涵體和可溶性）具有不同的免疫原性。Zeng［18］等將CPV VP2基因進行密碼子優(yōu)化后，克隆至pMAL-c2x載體中，誘導(dǎo)后得到可溶性目的蛋白，接種家兔后，產(chǎn)生很高的具有病毒中和活性的抗體（免疫后5周，中和效價為350倍），比CPV滅活疫苗免疫組中和抗體效價（同期效價為650倍）要低。李慕瑤等［12］對VP2蛋白的包涵體經(jīng)過變性、復(fù)性處理純化后能與CPV陽性血清反應(yīng)；易立等［17］得到可溶性蛋白后用于建立ELISA方法，結(jié)果表明其具有很好反應(yīng)原性。王凈等［16］對CPV VP2蛋白進行截短表達(dá)（306-397aa和363-483 aa），得到可溶性蛋白與His單克隆抗體和CPV陽性血清反應(yīng)良好，說明該蛋白具有很好的反應(yīng)原性；陳勝男等［15］對得到的可溶性VP2蛋白進行Western blot分析發(fā)現(xiàn)其具有很好的免疫原性。本試驗所得到的rVP2包涵體蛋白與His單抗和CPV陽性血清均反應(yīng)良好，與文獻(xiàn)報道相符。而且，將rVP2包涵體蛋白免疫家兔，能刺激機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體（數(shù)據(jù)待發(fā)）。因此，VP2蛋白的可溶性或包涵體形式都具有很好的反應(yīng)原性，在基因工程亞單位疫苗的開發(fā)中具有重要價值。

本試驗成功構(gòu)建了一株高效表達(dá)CPV NY毒株VP2基因全長的菌株，重組蛋白rVP2以包涵體形式存在，具有很好的反應(yīng)原性。rVP2表達(dá)量大，純化方便，為后續(xù)基因工程亞單位疫苗和診斷試劑研究奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Reactogenicity Identification of Canine Parvovirus NY Strain VP2 Protein

MAO Qian-qian，BU Bin，TANG Qing-hai，KAN Yun-chao，YAO Lun-guang，TANG Cun-duo，JIAO Zhu-jin，YANG Jian-wei
（Center for Nanyang Veterinary Biological Engineering Technology，Henan Provincial Engineering Laboratory of Insect Bio-reactor；Henan Provincial Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Moutain；Nanyang Normal University，Nanyang，Henan，473061，China）

Abstract：Canine parvovirus（CPV）encoded VP2gene shows frequent genetic variation，which contributes to the tropism and pathogenicity changes of CPV.This study aimed to prepare the recombinant VP2protein（rVP2）encoded by a highly pathogenic CPV strain（NY strain）by prokaryotic expression system.A recombinant plasmid pET28a-CPV-VP2was constructed and transfected into E.coli BL21（DE3），rVP2 was expressed at different temperatures，or with different IPTG concentrations and with different induction time，SDS-PAGE and Western blot were used to analyze expression and antigenicity of rVP2.The results showed that the molecular weight of the rVP2was about 72ku，the protein existed in the form of inclusion body under different conditions.The expression levels showed the highest with 0.2mmoL/L final concentration of IPTG，induced for 4hat 37℃.rVP2can not only react with His-tag monoclonal antibody but also can react with specific positive serum of CPV，rVP2showed good reactogenicity.This study laid the foundation for the development of CPV antibody detection kits and genetic vaccine.

Key words：CPV-NY strain；VP2；prokaryotic expression；identification

作者簡介：毛倩倩（1988-），女，河南人，碩士研究生，主要從事生物制藥與疫苗工程研究。＊通訊作者

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31101837）；河南省重點科技攻關(guān)項目（142102110101）；南陽師范學(xué)院引進人才專項項目（70640）；2015年度研究生創(chuàng)新項目（2015CX003）

收稿日期：2014-12-02

中圖分類號：S852.655

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0024-06