侯宇華 李 娜 李 丹 井維鑫 王 蘭

(山西大學生命科學學院, 太原030006)

鎘對河南華溪蟹副性腺抗氧化酶活性及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的影響

侯宇華 李 娜 李 丹 井維鑫 王 蘭

(山西大學生命科學學院, 太原030006)

隨著現(xiàn)代工業(yè)化的發(fā)展, 重金屬對水生生物的毒性影響已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注[1,2]。其中, 鎘作為一種廣泛存在的重金屬污染物, 具有一定的生殖毒性。研究發(fā)現(xiàn), 雄性生殖系統(tǒng)是其作用的重要靶器官, 鎘對精巢[3]、精子的運動能力、成活率和受精能力[4]均能產(chǎn)生影響。

副性腺是溪蟹雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分[5]。關(guān)于副性腺的研究主要集中在昆蟲[6,7]和哺乳動物類[8—10]。關(guān)于甲殼動物中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)副性腺的研究結(jié)果表明, 其副性腺蛋白可以有效地消化精莢壁, 提高精子的頂體反應率[11], 其內(nèi)容物可以為精子的運動提供一定的能量和營養(yǎng), 并促進精莢的破裂[12,13]。分析認為, 副性腺分泌物中含有某些蛋白, 可以使精子從精莢中游離出來, 并保持很高的活力, 從而保證了受精過程的順利進行[14,15]。由此可見, 副性腺對于蟹類的精卵結(jié)合, 順利地完成受精具有重要作用。

副性腺的分泌物被認為是射精過程中抗氧化酶的主要來源, 具有維護精子DNA 完整性, 使其免受外界環(huán)境氧化脅迫的重要功能[16,17]。該文在前期研究工作[18,19]基礎上繼續(xù)研究了鎘在河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)副性腺中的富集、對抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)活性、脂質(zhì)過氧化水平(MDA含量)、蛋白質(zhì)羰基化(PCO含量)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)的影響。本研究旨在進一步明確鎘對雄性生殖系統(tǒng)的毒性及其機理, 為淡水環(huán)境的保護和水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

河南華溪蟹(簡稱溪蟹)于2013年10月購自太原市五龍口東安水產(chǎn)批發(fā)市場, 在實驗室水族缸(45 cm×35 cm×30 cm)暫養(yǎng)兩周以上。

1.2 主要試劑

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(分析純), 在實驗前用蒸餾水配成2×104mg/L的母液備用。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量和蛋白含量的測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。硝酸、高氯酸為優(yōu)級純, 標準鎘溶液(100 mg/L)由國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所提供。蛋白酶K、熒光染料Hoechest33258、Tris均購自Sigma公司。鹽酸胍、EDTA、2, 4-二硝基苯肼(DNPH)均為國產(chǎn)分析純。DNPH購自天津Kermal化學試劑開發(fā)中心。

1.3 試驗設計與樣品制備

將隨機選取的體重為(25.0±3.0) g的健康成熟雄蟹,暴露于盛有 2 L已曝氣的自來水(pH=6.8, 溶解氧 8—8.3 mg/L)的容器(40 cm×30 cm×30 cm)中。每個容器中放入8只雄蟹。

實驗根據(jù)鎘對溪蟹攻毒96h的LC50值, 按1/32、1/16、1/8、1/4和1/2比例分別設5個處理組和1個對照組(0 mg/L),處理組Cd2+分別為7.25、14.5、29、58和116 mg/L, 每個濃度組分別設置5個平行, 暴露3d、5d和7d, 分別從各組隨機選取5只, 取副性腺稱重后置于–80℃冰箱保存。染毒期間不喂食, 不換水, 每天檢查華溪蟹的健康狀況。

副性腺組織經(jīng)濃硝酸和高氯酸硝化完全, 定容后用火焰原子吸收分光光度計(VARIAN AA240OFS)測定鎘的含量(μg/g)。

按 1∶1(m∶v)的比例在各組中加入預冷的磷酸緩沖液(PBS, pH=7.4), 用電動勻漿器制備 50%的組織勻漿液, 經(jīng)4℃離心10min (4000 r/min), 取上清, PCO和DPC的測量方法參照文獻 [20], 按照試劑盒說明書測定3種酶活性、MDA含量和蛋白含量。

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件, 實驗結(jié)果用平均值±標準差(Mean±SD)表示, 采用單因素方差分析(One-Way ANOVA), P＜0.05 *為顯著性差異, P＜0.01 **為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 鎘在河南華溪蟹副性腺中的富集

如圖1所示, 與對照組相比, 河南華溪蟹副性腺中鎘的富集量隨染毒濃度的增加和暴露時間的延長而呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。鎘濃度116 mg/L, 染毒的3個時間, 鎘在副性腺中的富集均較對照組差異極顯著(P＜0.01), 其中染毒 7d的富集量最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 鎘對河南華溪蟹副性腺SOD活性的影響

由圖2可見, 隨著濃度的增加和暴露時間的延長, 河南華溪蟹副性腺中SOD活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢。鎘濃度14.5 mg/L, 染毒5d, SOD活性最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。在鎘暴露7d、濃度為14.5、29和58 mg/L時, SOD活性較對照組存在極顯著性差異 (P＜0.01)。

2.3 鎘對河南華溪蟹副性腺CAT 活性的影響

由圖3可見, 河南華溪蟹副性腺中CAT活性隨鎘濃度的升高和暴露時間的延長而呈現(xiàn)先升后降的趨勢。鎘濃度為29 mg/L 染毒5d活性最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。鎘濃度14.5和29 mg/L染毒7d時, 較對照組存在極顯著性差異(P＜0.01)。

圖1 鎘在河南華溪蟹副性腺中的富集Fig. 1 Cd2+bioaccumulation in male accessory gland of S. henanense

圖2 鎘對河南華溪蟹副性腺SOD活性的影響Fig. 2 Effect of Cd2+on SOD activity in male accessory gland of S. henanense

圖3 鎘對河南華溪蟹副性腺CAT活性的影響Fig. 3 Effect of Cd2+on CAT activity in male accessory gland of S. henanense

2.4 鎘對河南華溪蟹副性腺GPX活性的影響

從圖4可知, 在不同的鎘處理組, 河南華溪蟹副性腺中GPX基本高于對照組。同一時間不同濃度, 隨著濃度的升高, GPX活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢。同一濃度不同時間, 隨著時間的延長, GPX活性基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。其中暴露于14.5 mg/L濃度的鎘溶液時, 該酶活性達到最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。鎘濃度7.25、14.5 和29 mg/L, 染毒7d, 較對照組存在極顯著性差異(P＜0.01)。

2.5 鎘對河南華溪蟹副性腺MDA含量的影響

由圖 5可見, 所有鎘處理組, 河南華溪蟹副性腺中MDA含量均高于對照組。表現(xiàn)出MDA含量隨染毒濃度的增加和暴露時間的延長而呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。鎘染毒濃度為58和116 mg/L染毒7d時, MDA含量較對照組存在極顯著性差異(P＜0.01), 其中鎘濃度為116 mg/L時, MDA含量最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。

圖4 鎘對河南華溪蟹副性腺GPX活性的影響Fig. 4 Effect of Cd2+on GPXactivity in male accessory gland of S. henanense

圖5 鎘對河南華溪蟹副性腺MDA含量的影響Fig. 5 Effect of Cd2+on MDA content in male accessory gland of S. henanense

2.6 鎘對河南華溪蟹副性腺DPC的影響

從圖6可見, 在所有鎘處理組中, DPC均高于對照組。表現(xiàn)出DPC隨染毒濃度和暴露時間的延長逐漸升高。其中鎘濃度為116 mg/L, 染毒5d和7d, DPC較對照組差異極顯著(P＜0.01)。染毒7d, DPC達到最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.7 鎘對河南華溪蟹副性腺PCO含量的影響

由圖7可見, 所有的鎘處理組PCO含量均高于對照組。隨著鎘染毒濃度的增加和染毒時間的延長, PCO含量逐漸升高。鎘濃度為116 mg/L, 染毒5d和7d, PCO含量較對照組差異極顯著(P＜0.01)。染毒7d, PCO含量最高, 較對照組差異極顯著(P＜0.01)。

圖6 鎘對河南華溪蟹副性腺DPC的影響Fig. 6 Effect of Cd2+on DPC in male accessory gland of S. henanense

圖7 鎘對河南華溪蟹副性腺PCO含量的影響Fig. 7 Effect of Cd2+on PCO content in male accessory gland of S. henanense

3 討論

3.1 鎘在河南華溪蟹副性腺中的富集

從本次的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 隨著染毒濃度的增加和暴露時間的延長, 鎘在溪蟹副性腺中的富集量逐漸增加, 尤其染毒高濃度組(116 mg/L)在染毒的3個時間, 均較對照組發(fā)生了極顯著升高, 說明鎘在溪蟹副性腺中的富集可以作為水環(huán)境中鎘污染和毒性檢測的有效指標之一。本次的研究結(jié)果顯示, 鎘暴露一定程度上影響了溪蟹副性腺的抗氧化能力。3種抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)對鎘脅迫的應答反應趨勢基本相同, 即先上升后下降。鎘誘導產(chǎn)生自由基

(ROS), 造成氧化損傷, 促使副性腺自身的防御系統(tǒng)產(chǎn)生應答, 抗氧化酶活性升高; 但隨著鎘暴露濃度的升高, 時間延長, 鎘通過耗盡谷胱甘肽(GSH)或干擾抗氧化系統(tǒng)的必需金屬元素等方式, 使抗氧化系統(tǒng)遭到破壞, 使其活性降低。隨著鎘脅迫程度的加深, 副性腺中的生物大分子: 脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷程度不斷加劇, MDA、PCO含量以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率持續(xù)上升。

3.2 鎘對河南華溪蟹副性腺SOD、CAT和GPX活性的影響

SOD是抗氧化系統(tǒng)的重要酶之一, 也是抵抗外界損傷的重要防御系統(tǒng)之一[21], 可清除O–2, 將其轉(zhuǎn)化為H2O2[22]。CAT 和GPX都可以將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2[23], 即二者通過清除 H2O2來減少其對組織的損傷, 也是抵抗鎘脅迫毒性的重要酶。GPX是一種與硒相關(guān)的酶。一般來說, GPX的活性降低或者是因為硒的缺失[24], 或者是因為GSH 濃度的降低[25]。Cd2+與GPX活性部位的結(jié)合, 可以減輕Cd2+對器官的毒性作用, 也可以導致GPX活性部位的改變, 進而使其活性降低[26]。有研究表明, GPX是與雄性生殖具有重要密切關(guān)系的因素之一[27]。副性腺中GPX活性的降低, 預示著高濃度的鎘暴露對溪蟹副性腺乃至雄性生殖造成了損傷。本次的實驗結(jié)果顯示, 在染毒的3個時間段, SOD、CAT 和GPX活性都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。這與“促進-抑制”效應機制吻合, 即低濃度鎘暴露時, 可使生物體內(nèi)的抗氧化酶活性升高, 出現(xiàn)“毒性興奮效應”, 而高濃度時, 則通常會使生物體內(nèi)的抗氧化酶活性受抑制而降低, 生物體內(nèi)活性氧過量積累, 導致生物體損傷。以上三個酶活結(jié)果與Pan和Zhang[28]的研究結(jié)果相近, 該研究認為將海洋蟹—日本(Charybdis japonica)暴露于梯度鎘溶液后, 鰓和肝胰腺三種抗氧化酶活性均先上升后下降?？梢妼τ诓煌逆k染毒濃度和暴露時間, 海洋蟹和淡水蟹的不同組織呈現(xiàn)相似的應答趨勢。

3.3 鎘對河南華溪蟹副性腺MDA、PCO含量和DPC的影響

如果外界的氧化脅迫作用超過生物組織自身的抗氧化能力時, 那么組織的氧化損傷就會顯現(xiàn)出來, 其中, 脂質(zhì)過氧化水平即MDA含量變化被認為是細胞氧化損傷機制的主要標志之一[29], 在抵抗外源性毒物的過程中產(chǎn)生重要的作用[30]。它被認為與組織破壞及伴隨產(chǎn)生的生物膜功能缺失是相關(guān)的[31]。溪蟹副性腺在暴露于Cd2+濃度116 mg/L 時, MDA含量較對照組發(fā)生極顯著性升高, 表明鎘極顯著性的誘導了ROS的產(chǎn)生, 隨著鎘濃度的升高, 膜脂質(zhì)過氧化損傷的程度也在不斷加深, 也就是說抗氧化能力的喪失, 會導致 MDA含量本質(zhì)性的累積, 這可以作為判斷自由基產(chǎn)生的可靠指標。而Jiang等[32]將紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)暴露于梯度鎘溶液中, MDA的含量并沒有顯著的變化。分析兩種結(jié)果的差別與鎘的濃度、暴露時間、物種的差異性及組織的特異性有關(guān)。已有的研究表明, 副性腺可以促進精莢的裂解, 為精子的運動提供能量, 這些功能與其上皮細胞中豐富的線粒體是相關(guān)的, 本次實驗中MDA含量升高, 推測在高濃度 Cd2+暴露的情況下, 線粒體膜受損, 進而使其結(jié)構(gòu)乃至功能受到破壞, 從而可能會影響精子的成活率和運動能力, 而這與馬丹旦等[33]關(guān)于急性鎘脅迫對溪蟹精子質(zhì)量的影響結(jié)果是一致的。

DNA也會被ROS攻擊, 從而嚴重影響其結(jié)構(gòu)和功能[34]。蛋白質(zhì)可以直接通過活性氧機制直接和DNA交聯(lián), 也可以通過與金屬離子結(jié)合后間接與DNA交聯(lián)。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)會擾亂DNA的正常代謝過程[35]。另外, 蛋白質(zhì)羰基化也是鎘誘導氧化損傷的指示物之一[36]。本次的研究結(jié)果顯示, 染毒的最高濃度組(116 mg/L)在染毒的5d和7d, DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率(DPC)和蛋白質(zhì)羰基化(PCO)含量均較對照組發(fā)生極顯著升高。Ma等[19]發(fā)現(xiàn), 將溪蟹暴露于鎘溶液(116 mg/L)7d后, 其精子中PCO含量、DPC顯著高于對照組, 表明高濃度的鎘脅迫對副性腺的損傷程度與精子的基本相同。結(jié)合前期研究分析認為, 鎘對副性腺中蛋白質(zhì)的損傷, 會干擾其功能(如消化精莢壁)的正常實行, 進而影響副性腺的功能, 從而對溪蟹的雄性生殖造成影響。以上結(jié)果提示, 鎘誘導產(chǎn)生OH–等自由基, 攻擊副性腺中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氨基酸和細胞內(nèi)DNA, 進而影響副性腺的功能, 乃至遺傳等生命活動的正常進行。

4 小結(jié)

(1) 隨著鎘濃度的增加和染毒時間的延長, 河南華溪蟹副性腺中鎘的富集量逐漸升高, 提示鎘可能引起了副性腺抗氧化系統(tǒng)和蛋白質(zhì)等生物大分子的損傷。(2)鎘脅迫不但能誘導副性腺氧化應激水平的升高, 而且進一步導致了副性腺中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA生物大分子的損傷。(3)抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化水平、蛋白質(zhì)羰基化含量和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率的變化程度能夠靈敏反映鎘對水生動物生殖系統(tǒng)的脅迫程度和損傷程度, 可以作為水環(huán)境重金屬生殖毒性效應機理研究的評估指標。

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BIOACCUMULATION OF CADMIUM AND ITS EFFECTS ON ANTIOXIDANT ENZYME ACTIVITIES, LIPID, PROTEIN AND DNA IN MALE ACCESSORY GLAND OF THE FRESHWATER CRAB SINOPOTAMON HENANENSE

HOU Yu-Hua, LI Na, LI Dan, JING Wei-Xin and WANG Lan
(School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

河南華溪蟹; 副性腺; 鎘; 抗氧化酶活性; 脂質(zhì)過氧化水平; DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率; 蛋白質(zhì)羰基化含量

Sinopotamon henanense; Male accessory gland; Cadmium; Antioxidant enzyme activity; Lipid peroxidation; DNA-protein crosslink; Protein carbonyl derivates

X171.5

A

1000-3207(2015)03-0621-06

10.7541/2015.82

2014-08-04;

2014-12-02

高等學校博導類基金(No. 20111401110010); 山西省特色學科重點項目(No.2011-SXDX-SWX-003)資助

侯宇華(1989—), 女, 山西省孝義市人; 碩士; 主要從事動物生殖毒理學研究。E-mail: hyh0163@163.com

王蘭, 主要從事環(huán)境生物學與基因調(diào)控的研究。E-mail: lanwang@sxu.edu.cn