莊惠如黃祖芳翁笑艷盧 瑋舒惠琳

(1. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350007; 2. 福建師范大學(xué)醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350007; 3. 福州市環(huán)境監(jiān)測(cè)站, 福州 350011 )

微囊藻群體內(nèi)生黏偽魚腥藻熒光特征及空間分布

莊惠如1黃祖芳2翁笑艷3盧 瑋1舒惠琳1

(1. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350007; 2. 福建師范大學(xué)醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350007; 3. 福州市環(huán)境監(jiān)測(cè)站, 福州 350011 )

水華是淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程中形成的一種現(xiàn)象,藍(lán)藻水華產(chǎn)生的巨大生物量、藻毒素以及異味物質(zhì)已對(duì)公共衛(wèi)生、人體安全和水體生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了極大的威脅, 由此引起的水環(huán)境問題已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。微囊藻屬(Microcystis Kutz.)是主要的水華藍(lán)藻生物, 在自然水體中, 該植體成微觀或目力可見的膠群體。偽魚腥藻屬(Pseudanabaena Lauterborn)則是絲狀體型的藍(lán)藻。有研究表明, 偽魚腥藻不僅是常見的水華藍(lán)藻, 部分種類也是藍(lán)藻毒素和異味化合物的生產(chǎn)者[1,2]。我們?cè)谡{(diào)研福建省典型飲用水源地藍(lán)藻水華發(fā)生狀況的過程中發(fā)現(xiàn), 一種極微小的黏偽魚腥藻P. mucicola 常在水華爆發(fā)期間大量增殖, 并且常以內(nèi)生的習(xí)性生活在微囊藻群體的膠被中。由于普通顯微鏡在分辨率和清晰度上的局限性, 多年來,在浮游植物種類鑒定和水體污染生物監(jiān)測(cè)過程, 體型微小的P. mucicola 往往被忽略了。迄今為止, 有關(guān)黏偽魚腥藻和微囊藻伴生的生理生態(tài)學(xué)研究也尚未見報(bào)道。

激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)是一種集激光、顯微鏡和計(jì)算機(jī)于一體的新型、高精顯微鏡系統(tǒng)。與其他顯微鏡相比, LCSM 不僅具有成像分辨率高、樣品制片簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn), 在活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察、顯微熒光圖像處理、熒光定位定量分析、組織細(xì)胞的光學(xué)連續(xù)切片和三維結(jié)構(gòu)重建等方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)[3]。我們?cè)鴳?yīng)用LCSM對(duì)幾種海洋微藻結(jié)構(gòu)的熒光圖像、光譜特性等方面進(jìn)行研究嘗試, 并獲得初步成效[4,5]。本文應(yīng)用LCSM研究偽魚腥藻在微囊藻群體中的空間分布及其熒光特性, 旨在進(jìn)一步拓展LCSM 在微藻研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍, 為水華藍(lán)藻的生理生態(tài)研究提供一種有效新方法。

1 材料與方法

1.1 水樣采集與樣品制備

水樣于夏季取自福州山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華聚集的表層水, 經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察, 并在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上, 取活體微囊藻群體和游離生活的黏偽魚腥藻個(gè)體, 直接滴在載玻片上制成臨時(shí)水裝片進(jìn)行LCSM觀察。

1.2 激光共焦掃描顯微鏡系統(tǒng)

采用 LSM510 型激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Zeiss), 單光子激發(fā)光源, 波長(zhǎng)為 488 nm Ar+激光器(美國(guó)相干公司), 最大輸出功率 30 mW。物鏡40×(NA=0.75)用于激發(fā)和采集光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置合適的濾色片獲得藻體的熒光圖像。同時(shí), 在Lambda 模式下, 通過軟件附帶的圈選工具, 測(cè)量隨機(jī)選定的 10—20個(gè)藻細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值, 統(tǒng)計(jì)不同細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度, 獲得樣品平均熒光強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)(500—714 nm)之間的二維熒光光譜。另外對(duì)微囊藻群體進(jìn)行不同深度的逐層掃描, 每個(gè)群體掃描約35層, 每層厚度為1 μm, 將同一群體的系列掃描圖像進(jìn)一步三維處理后獲得三維熒光圖像。

2 結(jié)果

2.1 微囊藻群體內(nèi)生偽魚腥藻的形態(tài)學(xué)特征

微囊藻植體成熟時(shí)由許多小群體聯(lián)合組成不規(guī)則網(wǎng)狀或窗格狀的團(tuán)塊, 群體膠被透明, 易水化或堅(jiān)實(shí)[6]。鏡檢觀察發(fā)現(xiàn), 不同種類的微囊藻膠被中, 常見一種個(gè)體極微小的短絲體藍(lán)藻附生或內(nèi)生(圖版Ⅰ-1—3)。此外, 水體中還有一定數(shù)量的游離生活個(gè)體, 表明該藍(lán)藻的生活習(xí)性可能以內(nèi)生為主, 兼性浮游。該藍(lán)藻絲體多由 3—6個(gè)細(xì)胞構(gòu)成, 直或稍有彎曲, 不具膠鞘, 細(xì)胞橫壁處有收縊或不明顯, 細(xì)胞長(zhǎng)大于寬, 圓柱形, 寬約 0.5—0.8 μm,原生質(zhì)體均勻, 不具氣囊。根據(jù)Anagnostidis & Komárek的藍(lán)藻分類系統(tǒng)[7]上述微囊藻群體內(nèi)生的藍(lán)藻初步鑒定為黏偽魚腥藻 Pseudanabaena mucicola (Naumann & Huber-Pestalozzi) Schwabe。

鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn), 不同種類的微囊藻群體中, 偽魚腥藻內(nèi)生程度不一。其中, 膠被明顯但易水化的銅綠微囊藻(M. aeruginosa)和細(xì)胞排列疏松的史密斯微囊藻(M. smithii)群體中內(nèi)生的偽魚腥藻數(shù)量較多。膠被寬厚堅(jiān)實(shí)的惠氏微囊藻(M. wesenbergii)群體中內(nèi)生的偽魚腥藻較少。而膠被不明顯的魚害微囊藻(M. ichthyoblabe)以及細(xì)胞排列比較密實(shí)的水華微囊藻(M. flosaquae)群體中則少見偽魚腥藻附生。

2.2 微囊藻群體內(nèi)生黏偽魚腥藻及游離個(gè)體的自發(fā)熒光圖像及其光譜

為了證實(shí)微囊藻群體內(nèi)生短絲體及其游離個(gè)體的藍(lán)藻屬性, 應(yīng)用共聚焦掃描顯微鏡分別收集水樣中不同個(gè)體的熒光信號(hào)。圖Ⅰ-4—5是在 LSCM 中, 用 488 nm Ar+激光激發(fā)獲得的微囊藻群體內(nèi)生黏偽魚腥藻和游離個(gè)體的自發(fā)熒光圖像。微囊藻和黏偽魚腥藻均是原核生物,細(xì)胞原生質(zhì)體均勻, 沒有葉綠體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。所以, 由激光激發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)分散的色素物質(zhì)發(fā)出的紅色熒光使藻體形態(tài)清晰可見。

圖1a是在Lamda模式下, 隨機(jī)選取20個(gè)游離個(gè)體收集熒光信號(hào)獲得的平均熒光光譜圖。由圖 1a可知, 游離生活黏偽魚腥藻的自發(fā)熒光在500—714 nm 范圍內(nèi)有 2個(gè)明顯的主峰, 其中小高峰位于580 nm 處, 此為藍(lán)藻藻紅蛋白(C-PE)的特征峰[8]; 最高峰出現(xiàn)在661 nm, 是別藻藍(lán)蛋白(APC)的熒光峰; 在 682 nm處還有一個(gè)不明顯的肩峰, 其歸屬于藻膽體中末端發(fā)射體(APC-B)和葉綠素 a的熒光峰。藻膽蛋白是藍(lán)藻、紅藻及隱藻門的捕光色素蛋白, 包括三大類即藻藍(lán)蛋白(PC, λem 650 nm)、別藻藍(lán)蛋白(APC, λem 660 nm)和藻紅蛋白(PE, λem 577 nm)[9,10]。藍(lán)藻細(xì)胞主要含藍(lán)色的藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白, 故藻體多呈藍(lán)綠色。上述結(jié)果表明, P. mucicola細(xì)胞不僅含有藻藍(lán)蛋白, 還含有藻紅蛋白。此結(jié)果與文獻(xiàn)中有關(guān)偽魚腥藻種類具有藻紅蛋白的報(bào)道[11]相吻合。

圖1b是隨機(jī)選取群體中微囊藻和內(nèi)生黏偽魚腥藻的20個(gè)細(xì)胞收集熒光信號(hào), 分別獲得微囊藻和內(nèi)生黏偽魚腥藻的熒光光譜圖。由圖1b可知, 群體內(nèi)生黏偽魚腥藻的自發(fā)熒光除了在 575 nm 處有一小高峰外, 在 650 nm (PC特征峰)處出現(xiàn)一高峰后, 譜線繼續(xù)走高(661 nm、671 nm)至682 nm達(dá)到最高峰。和游離生活個(gè)體的光譜相比, 群體內(nèi)生偽魚腥藻的 PE熒光峰由 580 nm偏移至575 nm, 最高峰移至682 nm處。此外, 在650—682 nm之間, 由于PC、 APC、APC-B和 Chl. a的熒光發(fā)射峰彼此接近, 因此形成一個(gè)寬大并平緩走高的峰形。顯然,群體內(nèi)生的細(xì)胞與游離生活的個(gè)體在熒光光譜上存在一定差異。

圖1 微囊藻群體內(nèi)生偽魚腥藻及游離個(gè)體自發(fā)熒光光譜Fig. 1 The autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in mucilage of Microcystis and free P. mucicola

比較圖1b中黏偽魚腥藻和微囊藻的自發(fā)熒光光譜還可知, 微囊藻沒有PE峰(575 nm), 但在650—682 nm也同樣呈現(xiàn)一個(gè)寬大并平緩走高的熒光峰。此外, 從熒光強(qiáng)度上看, 內(nèi)生黏偽魚腥藻在 650—682 nm的峰值均高于微囊藻的。此結(jié)果顯示, 黏偽魚腥藻和微囊藻在捕光色素構(gòu)成上也有明顯差異。

2.3 黏偽魚腥藻在微囊藻群體中空間分布的熒光分析

利用 LSCM 對(duì)微囊藻群體進(jìn)行不同深度的逐層掃描,結(jié)果顯示, P. mucicola 多數(shù)內(nèi)生在微囊藻群體外部的膠被中, 部分個(gè)體可深入群體內(nèi)部, 但數(shù)量較少(圖版Ⅰ-6—11)。

圖2a是在Lamda模式下, 分別選取群體邊緣和中部?jī)?nèi)生的黏偽魚腥藻各10個(gè)個(gè)體, 用488 nm Ar+激光激發(fā)獲得的平均熒光光譜。由圖 2a可以看出, 不同部位內(nèi)生的黏偽魚腥藻細(xì)胞的熒光光譜峰形是一致的, 但熒光峰值存在一定差異。位于中部的黏偽魚腥藻細(xì)胞較邊緣的具有相對(duì)較高的熒光峰值。進(jìn)一步對(duì)光譜中主要熒光峰的比較結(jié)果表明(圖 2b), 群體中部?jī)?nèi)生的黏偽魚腥藻比分布群體邊緣的個(gè)體具有相對(duì)較高的PE/PC值, 而Chl. a/PE值則較低, Chl. a/PE值差異不明顯。此結(jié)果表明, 位于群體中部的黏偽魚腥藻其藻紅蛋白可能含量較高。

圖2 群體中不同部位偽魚腥藻自發(fā)熒光光譜比較Fig. 2 The compare of autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in different parts of colony

3 討論

偽魚腥藻隸屬于藍(lán)藻門, 顫藻目, 偽魚腥藻科。形態(tài)上與偽魚腥藻比較相近的藍(lán)藻是澤絲藻屬(Limnothrix Meffert)種類。但后者藻絲橫壁處不收縊, 細(xì)胞多具氣囊[7]。國(guó)外對(duì)偽魚腥藻的研究除了傳統(tǒng)的形態(tài)分類, 生理生態(tài)外, 還涉及分子生物學(xué)、異味物質(zhì)及毒性生理等。近年來,國(guó)內(nèi)在湖庫(kù)浮游植物的調(diào)查中, 偽魚腥藻種類時(shí)有報(bào)道,但少有針對(duì)偽魚腥藻的研究。潘雙葉等[11]曾對(duì)亭下水庫(kù)偽魚腥藻的晝夜垂直變化進(jìn)行研究, 但未確定其種類名稱。在光學(xué)顯微鏡下, 黏偽魚腥藻不僅體型微小, 體色也多呈透明 勻質(zhì)狀態(tài)。在生態(tài)習(xí)性上, 黏偽魚腥藻喜內(nèi)生在其他浮游藍(lán)藻群體膠被中。因此, 以往的浮游生物調(diào)查過程, 容易把微囊藻群體中內(nèi)生的黏偽魚腥藻歸屬到細(xì)菌等微生物范疇。本研究利用 LSCM觀測(cè)活體材料的便利性, 并根據(jù)熒光光譜特征, 可以判斷這種內(nèi)生的絲狀體為藍(lán)藻種類。進(jìn)一步根據(jù)其藻絲短, 橫壁有收縊以及無氣囊等形態(tài)學(xué)特征, 基本可以確定其分類屬性。雖然黏偽魚腥藻分布廣, 數(shù)量大, 但國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道卻極為有限。造成文獻(xiàn)檢索不到的原因, 除了體型微小, 易被忽略外, 可能還與分類鑒定所使用的分類系統(tǒng)不一致有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn), 在水華發(fā)生期間, 不同種類的微囊藻或多或少均有黏偽魚腥藻殖入性內(nèi)生或附生其群體的膠質(zhì)中。顯然, 群體膠被的厚薄、質(zhì)地是影響?zhàn)昔~腥藻內(nèi)生數(shù)量多寡的主要因素。本研究還發(fā)現(xiàn), 黏偽魚腥藻的生活習(xí)性是以內(nèi)生為主, 兼性浮游, 在細(xì)胞密度上有時(shí)可成為水華的次優(yōu)勢(shì)種。在浮游植物數(shù)量周年變化的調(diào)查過程, 還發(fā)現(xiàn), 微囊藻和黏偽魚腥藻在數(shù)量上存在某種對(duì)應(yīng)關(guān)系(結(jié)果另文報(bào)道), 此也映證了二者的伴生關(guān)系。

本文首次應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微術(shù), 針對(duì)黏偽魚腥藻的熒光光譜特性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 黏偽魚腥藻細(xì)胞不僅含藻藍(lán)蛋白也具有藻紅蛋白。Silvia等[8]曾對(duì) 28株偽魚腥藻進(jìn)行表型與基因型的研究, 結(jié)果表明, 約占63%的種類, 其細(xì)胞中既含有藻藍(lán)蛋白也有藻紅蛋白。Kling等[12]對(duì)一種紅色偽魚腥藻的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該藻體顏色在低光強(qiáng)條件呈紅色, 暴露在高光下則變成綠色,并推斷藻紅蛋白的存在與其色適應(yīng)能力有關(guān)。Silvia等[8]的光譜分析也表明, 不同光質(zhì)條件下偽魚腥藻的吸收光譜中, PE/PC和Chl. a/PC的比率存在差異。本研究結(jié)果顯示, 游離生活的黏偽魚腥藻個(gè)體與群體內(nèi)生的細(xì)胞在熒光光譜上既有共性又存在一定差異。二者均具有 PE峰,但前者的最高熒光峰來自APC, 后者的PC、APC和Chl. a均有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。此外, 群體內(nèi)不同部位藻細(xì)胞的熒光光譜峰形一致, 但熒光峰值發(fā)生變化, 尤其是PE/PC和Chl. a/PC比率的不同顯示其色素含量的變化。究其原因, 筆者認(rèn)為, 微囊藻群體膠被的存在是產(chǎn)生差異的重要原因, 由于光線透入群體膠被時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)弱變化, 可能導(dǎo)致藻細(xì)胞在捕光色素構(gòu)成、含量以及光能傳遞效率上的變化。本研究結(jié)果為偽魚腥藻的色適應(yīng)能力提供了佐證。

此外, 本研究還利用 LSCM 的連續(xù)光切片方法, 對(duì)自然狀態(tài)下的微囊藻群體進(jìn)行逐層掃描, 成功獲得黏偽魚腥藻在微囊藻群體中的空間分布信息, 這不僅為黏偽魚腥藻與微囊藻相互關(guān)系的進(jìn)一步研究提供重要依據(jù),也為水華藍(lán)藻的形態(tài)學(xué)和微觀生態(tài)研究提供了一種便捷而有效的方法。鑒于黏偽魚腥藻在藍(lán)藻水華發(fā)生期間的數(shù)量之多, 進(jìn)一步對(duì)該種的生理生態(tài)以及產(chǎn)毒與否進(jìn)行深入研究尤顯必要, 也極具現(xiàn)實(shí)意義。

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STUDY ON THE FLUORESCENCE SPECTRAL CHARACTERISTICS OF PSEUDANABAENA MUCICOLA AND SPATIAL DISTRIBUTION IN MUCILAGE OF MICROCYSTIS

ZHUANG Hui-Ru1, HUANG Zu-Fang2, WENG Xiao-Yan3, LU Wei1and SHU Hu-Lin1
(1. School of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2. Key Laboratory of Opto-Electronic Science and Technology for Medicine, Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3. Fuzhou Environmental Monitoring, Fuzhou 350011, China)

黏偽魚腥藻; 微囊藻; 熒光光譜; 激光掃描顯微術(shù); 空間分布

Pseudanabaena mucicola; Microcystis; Fluorescence spectra; LSCM; Spatial distribution

圖版Ⅰ 黏偽魚腥藻在微囊藻群體內(nèi)的空間分布圖PlateⅠ The image of spatial distribution of P. musicola in Microcystis spp. colony

Q949.2

A

1000-3207(2015)03-0633-05

10.7541/2015.84

2014-06-30;

2014-11-26

福建省科技廳社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Y0023)資助

莊惠如(1957—), 女, 福州人; 教授, 碩士; 主要從事藻類生理生態(tài)研究, E-mail: huang@fjnu.edu.cn