侍建濤李 志桂建芳周 莉

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

斑馬魚(yú)fem-1c cDNA克隆與表達(dá)分析

侍建濤1,2李 志1桂建芳1周 莉1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

為進(jìn)一步探究魚(yú)類性別決定的相關(guān)機(jī)理, 增加對(duì)魚(yú)類性控基因表達(dá)和功能的認(rèn)識(shí), 克隆斑馬魚(yú)fem-1c基因并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析。研究采用RACE-PCR方法從斑馬魚(yú)卵巢組織cDNA中克隆了fem-1c的cDNA全長(zhǎng)序列, 其大小為2701 bp, 編碼618個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示, 斑馬魚(yú)FEM-1C蛋白包含9個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域、2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域和2個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域, 與其他脊椎動(dòng)物的FEM-1C蛋白序列保守性較高。脊椎動(dòng)物的fem-1c與tmed7、trim36等鄰近的4—5個(gè)基因具有保守的同線性關(guān)系。半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚(yú)fem-1c在受精后17d開(kāi)始表達(dá), 并特異地表達(dá)于成體卵巢組織中。RNA原位雜交結(jié)果顯示, fem-1c基因mRNA定位于卵巢組織的Ⅰ期和Ⅱ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中。fem-1c的時(shí)空表達(dá)特征暗示其在斑馬魚(yú)卵巢分化中具有重要作用。

fem-1c; 卵巢分化; 原位雜交; 斑馬魚(yú)

fem-1(Feminization-1)基因最早發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(chóng), 參與線蟲(chóng)性別決定。fem-1基因與 her-1 (hermaphroditization-1)、tra-1 (transformer-1)、tra-2、tra-3、fem-2(feminization-2)和 fem-3等其他基因共同調(diào)控線蟲(chóng)性別分化[1—5]。線蟲(chóng)fem-1基因編碼一種錨蛋白-重復(fù)蛋白(ankyrin-repeats protein), 并與FEM-2、FEM-3及 CUL-2泛素連接酶(Cullin-2 ubiquitin ligase complex)等蛋白組成復(fù)合體負(fù)調(diào)控TRA-1(transformer-1)。TRA-1是一種 DNA-結(jié)合鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子, 其作用是促進(jìn)線蟲(chóng)的雌性化發(fā)育。有研究顯示, 線蟲(chóng) fem-1的突變導(dǎo)致對(duì) TRA-1蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)降低或失效, 進(jìn)而促使線蟲(chóng)向雌性化發(fā)育(雄性轉(zhuǎn)變?yōu)榇菩弁w)[6—8]。

目前, 在人和其他脊椎動(dòng)物如小鼠、斑胸草雀和斑馬魚(yú)中已發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)fem-1基因的同源基因家族成員。脊椎動(dòng)物fem-1基因家族由fem-1a、fem-1b和fem-1c三個(gè)成員組成[9]。fem-1基因家族編碼蛋白有一個(gè)共同特征, 即C端以一個(gè)保守的11個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)終止: Proline(P)-x-x-Leucine(L)-x-x-Phenylalanine (F)-x-x-x-Histidine(H)(x=可變氨基酸)[10,11]。fem-1a與fem-1c編碼蛋白序列相似度較高, 其區(qū)別在于fem-1c末尾還有一個(gè)精氨酸殘基(Arginine residue, R)[9]。

近期的一些研究顯示, fem-1基因家族成員在其他動(dòng)物中的表達(dá), 同樣呈現(xiàn)出與性別相關(guān)的特征。譬如, 對(duì)大馬哈魚(yú)虱(Caligus rogercresseyi)雌雄個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到fem-1B , 該基因具有性別表達(dá)差異[12]。在斑胸草雀(zebra finch)中, fem-1c有兩個(gè)拷貝fem1c-Z和fem1c-W, 分別位于Z和W性染色體中。fem1c-Z表達(dá)于纖維原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中; 而fem1c-W 發(fā)生了點(diǎn)突變, 導(dǎo)致第一個(gè)外顯子出現(xiàn)了缺失從而沒(méi)有功能[13]。在人類中, FEM-1A 或FEM-1B 突變與女性多囊卵巢綜合癥(Polycystic ovary syndrome, PCOS)的發(fā)生相關(guān)[14,15]。在斑馬魚(yú)中, 對(duì)雌雄性腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析表明, 卵巢組織中高表達(dá)fem-1c[16], 但目前對(duì)斑馬魚(yú)fem-1c的分子和表達(dá)特征并不清楚。

斑馬魚(yú)(Danio rerio)作為模式生物, 具有發(fā)育周期短、發(fā)育速度快、胚胎透明、個(gè)體小且易養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)[17], 在發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域有重要地位。為了進(jìn)一步研究fem-1c基因在斑馬魚(yú)卵巢分化中的作用, 我們首先從斑馬魚(yú)中克隆了fem-1c基因的全長(zhǎng) cDNA序列, 采用生物信息學(xué)方法分析了脊椎動(dòng)物fem-1c的結(jié)構(gòu)特征和同線性等特征, 并揭示出斑馬魚(yú)fem-1c在受精后17d開(kāi)始表達(dá), 特異地表達(dá)于成體卵巢Ⅰ期和Ⅱ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中。fem-1c的克隆鑒定可為進(jìn)一步研究 fem-1基因家族成員在脊椎動(dòng)物性別分化中的作用提供線索和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型的斑馬魚(yú)來(lái)自AB型健康成魚(yú)的交配,飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。獲得的受精卵置于28.5℃培養(yǎng)箱中孵化, 采用14h光照/10h黑暗光周期飼養(yǎng)。胚胎的培育和分期以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)取材均根據(jù)Kimmel等[18]進(jìn)行。

1.2 cDNA模板制備與斑馬魚(yú)fem-1c基因cDNA序列獲取

取斑馬魚(yú)新鮮卵巢組織于1 mL Trizol (Invitrogen)中, 按照說(shuō)明書(shū)提取總 RNA。用購(gòu)自 Clontech公司的SMART cDNA合成試劑盒合成斑馬魚(yú)卵巢cDNA文庫(kù), 具體文庫(kù)構(gòu)建步驟可詳見(jiàn) SMART cDNA synthesis Kit (Clontech)操作手冊(cè)。根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中得到 fem-1c部分序列, 設(shè)計(jì)引物5′-RACE-R1、5′-RACE-R2、3′-RACE-F1和3′-RACE-F2 (表1)。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 操作說(shuō)明書(shū), 進(jìn)行5′和 3′ RACE從斑馬魚(yú)卵巢cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增 fem-1c的 5′端與 3′端[19], 其中, 5′UPM和 3′UPM(表 1)為試劑盒提供的通用引物。PCR反應(yīng)條件如下: 94℃預(yù)變性5min; 然后94℃變性30s, 66℃復(fù)性30s, 72℃延伸2min, 反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)后, 切膠回收相應(yīng)的目的片段,并克隆到pMD19-T載體上, 16℃水浴連接4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 挑單克隆搖菌, PCR篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序后進(jìn)行結(jié)果比對(duì)拼接, 獲得fem-1c的 cDNA全長(zhǎng)序列。

1.3 蛋白序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)所獲得的斑馬魚(yú)fem-1c基因cDNA全長(zhǎng)序列, 結(jié)合Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)信息檢索, 我們得到FEM-1C蛋白序列。采用SMART 在線程序(http:// smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)fem-1c的蛋白結(jié)構(gòu)[20]。在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索其他脊椎動(dòng)物fem-1c基因編碼的FEM-1C蛋白序列(表2)。采用ClustalX 1.83對(duì)斑馬魚(yú)及其他脊椎動(dòng)物FEM-1C蛋白序列進(jìn)行比對(duì), 使用MEGA 5.2軟件構(gòu)建FEM-1C基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21], 方法為鄰接法(Neighbor-Joining), 并進(jìn)行1000 次自展檢驗(yàn)(bootstrap)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)分支可信度。

1.4 不同物種 fem-1c基因及其鄰近基因同線性分析

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)獲得斑馬魚(yú)及其他不同脊椎動(dòng)物fem-1c及其上下游基因, 按照相同的比例繪制各物種fem-1c及其周邊基因的同線性關(guān)系, 部分基因間距較大, 繪圖中采用雙斜線省略處理。其中銀鯽(Carassius auratus gibelio)相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室BAC測(cè)序, BAC文庫(kù)構(gòu)建及篩選參照[22]進(jìn)行。采用Genscan和Fgenesh軟件預(yù)測(cè)基因, 暫命名為BAC L-16。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及用途Tab. 1 The sequences and usage of primers used in this study

表2 斑馬魚(yú)FEM-1C與其他脊椎動(dòng)物同源蛋白序列一致性(Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù))Tab. 2 Pairwise identity of zebrafish FEM-1C with other selected homologues (Ensembl database)

1.5 斑馬魚(yú)fem-1c在組織中表達(dá)分布

分別取雌性成體斑馬魚(yú)的心臟、腦、脾臟、腎、肝臟、皮膚、肌肉、卵巢組織以及雄性成體斑馬魚(yú)的精巢組織, 液氮速凍, –80℃保存。將各組織置于1 mL Trizol 中, 提取總RNA, 取1 μg總RNA DNaseI (Fermentas)處理后, 采用RevertAid? First Strandc DNA Synthesis Kit (Fermentas)制備cDNA 模板。以各組織cDNA 為模板, 用fem-1c基因特異引物Fem1c-F1和Fem1c-R1(表1)進(jìn)行半定量RT-PCR 檢測(cè), 以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系: 1 μL cDNA為模板, 0.6 μL mol/L 引物, 10 μL 2× Taq DNA 聚合酶Mix,補(bǔ)H2O 至總體積20 μL。調(diào)整好各模板濃度及PCR循環(huán)數(shù)后進(jìn)行反應(yīng): 94℃預(yù)變性4min, 94℃變性 20s, 58℃復(fù)性20s, 72℃延伸 50s, 反應(yīng)進(jìn)行24 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。

1.6 fem-1c在斑馬魚(yú)早期性腺發(fā)育中表達(dá)時(shí)序

取斑馬魚(yú)受精后發(fā)育至8胞期、尾牙期、24h、 48h、72h受精卵各30顆, 5d、10d、15d魚(yú)苗各30尾并去除頭部和尾部, 液氮速凍, –80℃保存; 取16d、17d、18d、19d、23d、35d和 45d魚(yú)苗各 30尾, 3月齡雌性斑馬魚(yú) 1尾, 取性腺組織, 于 RNA later中–20℃保存。提取上述樣品的總 RNA, 并反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以各發(fā)育時(shí)期的 cDNA 為模板,用跨內(nèi)含子的 fem-1c特異引物 Fem1c-F2和Fem1c-R2(表1)進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè), 以β-actin為內(nèi)參。半定量RT-PCR按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增: 94℃預(yù)變性5min, 然后以94℃變性30s, 54℃復(fù)性30s, 72℃延伸50s, 反應(yīng)進(jìn)行26個(gè)循環(huán), 再以72℃延伸10min。

1.7 卵巢組織原位雜交

根據(jù)fem-1c已知的cDNA序列, 設(shè)計(jì)引物probe-F和probe -R(表1)。在引物的5′端加入T7啟動(dòng)子序列, 經(jīng)過(guò)PCR獲得帶有T7啟動(dòng)子的DNA片段。體外轉(zhuǎn)錄獲得帶地高辛(Digoxigenin)標(biāo)記的反義和正義RNA探針(Roche), 1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA探針的質(zhì)量。取6月齡斑馬魚(yú)卵巢, 于4% PFA中4℃固定16—18h, 再經(jīng)30%蔗糖4℃滲透過(guò)夜, OTC包埋后進(jìn)行冰凍切片, 切片的厚度為10 μm。之后利用地高辛標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行切片原位雜交。實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要包括: 切片復(fù)水, 蛋白酶消化, PFA固定, 雜交,洗脫, 抗體孵浴, 染色, 顯色等步驟, 具體操作步驟參照本實(shí)驗(yàn)室方法[23—25]以及斑馬魚(yú)整體原位雜交方法[26]。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú) fem-1c的基因組結(jié)構(gòu)及其鄰近基因保守的共線性關(guān)系

通過(guò)搜索和分析Ensembl和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合RACE-PCR擴(kuò)增fem-1c全長(zhǎng)cDNA序列, 我們獲得了斑馬魚(yú) fem-1c基因的結(jié)構(gòu)示意圖(圖 1)。斑馬魚(yú) fem-1c位于斑馬魚(yú) 8號(hào)染色體, 基因全長(zhǎng)約13.8 kb, 由 5個(gè)外顯子和 4個(gè)內(nèi)含子組成; 全長(zhǎng)cDNA大小為 2701 bp, 其中5′非編碼區(qū)長(zhǎng)279 bp, 3′非編碼區(qū)長(zhǎng) 549 bp, 編碼區(qū)長(zhǎng)度 1857 bp, 編碼618個(gè)氨基酸。

根據(jù)Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的fem-1c相關(guān)區(qū)域數(shù)據(jù), 我們繪制了斑馬魚(yú)及其他脊椎動(dòng)物fem-1c及其上下游基因連鎖圖(圖2), 比較發(fā)現(xiàn)fem-1c與其鄰近的4—5個(gè)基因具有保守的共線性關(guān)系。具體表現(xiàn)在: fem-1c上游, 除銀鯽(由于 BAC序列接近尾端而缺失相關(guān)信息)和原雞外, 其他物種均存在tmed7基因; fem-1c下游, 所分析物種中均依次出現(xiàn) trim36、pggt1b、CCDC112等基因或特征序列, 沒(méi)有基因錯(cuò)位或顛倒現(xiàn)象發(fā)生。另外, 隨著物種的進(jìn)化, 總體來(lái)講, 越高等的物種, 上述基因的間距越大, 即彼此鄰近的基因在物種的進(jìn)化歷程中呈位置“擴(kuò)散”趨勢(shì)。

圖2 fem-1c基因與其鄰近基因保守的共線性關(guān)系(數(shù)據(jù)來(lái)自ensembl數(shù)據(jù)庫(kù))Fig. 2 Schematic diagram for fem-1c gene and context genes of zebrafish and the fem-1c homologs of other species from ensemble database

2.2 斑馬魚(yú)fem-1c編碼蛋白的分子特征、保守的種間結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

用 SMART 在線程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)了斑馬魚(yú)fem-1c的蛋白結(jié)構(gòu)(圖3), 斑馬魚(yú)FEM-1C包含9個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域、2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域和2個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域。其中, 有7個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域串聯(lián)排布于蛋白 N端(第 1—200個(gè)氨基酸范圍內(nèi)), 另外2個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域位于第500—550個(gè)氨基酸范圍內(nèi); 2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域分別位于第240—270和第320—350個(gè)氨基酸范圍內(nèi); 2個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域分別位于第 380—390和第 440—460個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。

圖3 斑馬魚(yú)FEM-1C蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3 Schematic diagram for structure prediction of zebrafish FEM-1C

不同物種FEM-1C蛋白序列比對(duì)結(jié)果(表2)顯示, FEM-1C蛋白序列在各物種中具有較高的保守性。斑馬魚(yú) FEM-1C蛋白序列與銀鯽(Carassius auratus gibelio)FEM-1C蛋白序列的一致性最高, 為87.10%;與原雞(Gallus gallus)的最低, 為75.93%。與其他魚(yú)類的FEM-1C蛋白序列的一致性在82.07%以上, 而與其他脊椎動(dòng)物 FEM-1C蛋白序列的一致性在75.93%—79.48%。但斑馬魚(yú)FEM-1C與無(wú)脊椎動(dòng)物動(dòng)物FEM-1蛋白一致性較低。譬如, 與線蟲(chóng)FEM-1蛋白的一致性僅為33.08%。

采用MEGA5.2軟件鄰接法構(gòu)建了N-J系統(tǒng)樹(shù)(圖 4)。從圖中可以看出, 系統(tǒng)樹(shù)分為兩支: 其中一支, 斑馬魚(yú)和銀鯽的 FEM-1C聚為一簇, 鱈、闊尾魚(yú)、羅非魚(yú)和青鳉的 FEM-1C聚為一簇, 兩簇再聚為一支。在另一支中, 智人、大猩猩和黑猩猩的FEM-1C聚為一簇, 家貓、大熊貓、羊駝的FEM-1C聚為另一簇, 兩簇再聚為一個(gè)亞支; 蜥蜴、中華軟殼龜、斑胸草雀和原雞的 FEM-1C聚為一個(gè)亞支; 非洲爪蟾FEM-1C獨(dú)立為一個(gè)亞支。

2.3 fem-1c特異地表達(dá)于斑馬魚(yú)卵巢組織并定位于Ⅰ、Ⅱ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)

采用半定量RT-PCR 方法分析fem-1c在斑馬魚(yú)成體組織、胚胎發(fā)育以及個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況, 結(jié)果表明, 斑馬魚(yú)fem-1c 特異地表達(dá)于卵巢組織, 而在心臟、腦、脾臟、腎、肝臟、皮膚、肌肉和精巢組織中沒(méi)有表達(dá)(圖5A)。斑馬魚(yú)fem-1c在胚胎發(fā)育中不表達(dá)(結(jié)果未顯示), 從受精后 17d起魚(yú)苗性腺中可以檢測(cè)到fem-1c的轉(zhuǎn)錄本, 隨后表達(dá)逐漸增強(qiáng), 35d后表達(dá)達(dá)到高峰(圖5B)。

利用合成的fem-1c正、反義探針對(duì)斑馬魚(yú)卵巢組織進(jìn)行原位雜交, 結(jié)果顯示, 雜交信號(hào)主要出現(xiàn)在Ⅰ期和Ⅱ期卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。伴隨卵母細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期, 信號(hào)強(qiáng)度也有變化。其中Ⅰ期卵母細(xì)胞(50 μm ＜φ＜150 μm)信號(hào)最強(qiáng), 信號(hào)出現(xiàn)在胞質(zhì)中, 呈明顯環(huán)狀分布, 中間的核區(qū)清晰可見(jiàn)。Ⅱ期卵母細(xì)胞(140 μm ＜φ＜340 μm)信號(hào)強(qiáng)度減弱, 雜交信號(hào)均勻分布于除皮質(zhì)小泡和細(xì)胞核以外的胞質(zhì)中。Ⅲ期(340 μm ＜φ＜700 μm)和Ⅳ期(φ＞700 μm)卵母細(xì)胞信號(hào)消失(圖6A)。

3 討論

圖4 NJ法構(gòu)建的不同物種FEM-1C基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of FEM-1C in different species based on NJ method

圖 5 fem-1c在斑馬魚(yú)成體組織(A)和個(gè)體發(fā)育(B)中的表達(dá)分析Fig. 5 Expression pattern of fem-1c in zebrafish adult tissues (A) and larvae at different development stages (B)

圖6 斑馬魚(yú)fem-1c mRNA在卵巢組織中的細(xì)胞定位(φ表示細(xì)胞直徑)Fig. 6 Cellular distribution of fem-1c mRNA in zebrafish ovarian tissue (φstands for cellular diameter)

斑馬魚(yú)fem-1c蛋白主要由ANK結(jié)構(gòu)域和TPR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。ANK結(jié)構(gòu)域(錨蛋白重復(fù), Ankyrin repeats)是一種廣泛存在于各類蛋白的結(jié)構(gòu)域, 一般由30個(gè)左右的氨基酸殘基構(gòu)成, 通常以重復(fù)結(jié)構(gòu)串聯(lián)排列在蛋白中, 具體重復(fù)數(shù)目因蛋白行使功能及物種的不同而不同[27]。具有串聯(lián) ANK結(jié)構(gòu)域的蛋白可以行使多種功能, 在蛋白-蛋白相互作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 在動(dòng)物界中廣泛存在。例如在周期蛋白激酶抑制因子[Cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Transcriptional regulators)以及細(xì)胞骨架蛋白(Cytoskeletal organizers)中均存在 此類結(jié)構(gòu)[28,29]。TPR結(jié)構(gòu)域(三角形四肽重復(fù), Tetratricopeptide repeats)通常由34個(gè)氨基酸殘基組成, 以3—16個(gè)不等的基序串聯(lián)排布在蛋白中, 多個(gè)TPR可組成支架結(jié)構(gòu)介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用, 或者參與多蛋白復(fù)合物的組裝[30]。如前所述, 線蟲(chóng)FEM-1蛋白N端存在6個(gè)串聯(lián)ANK重復(fù)結(jié)構(gòu)域, 與FEM-2和FEM-3組成蛋白復(fù)合體, 作為CUL-2泛素連接酶的酶識(shí)別底物, 并共同組成蛋白復(fù)合體調(diào)控下游TRA-1表達(dá), 最終影響線蟲(chóng)性腺組織發(fā)育[6,8,31]。因此, 斑馬魚(yú)FEM-1C蛋白這種類似結(jié)構(gòu)的存在暗示了FEM-1C可能也參與蛋白復(fù)合體的構(gòu)成或者相關(guān)酶活性位點(diǎn)的識(shí)別。

從斑馬魚(yú)fem-1c基因與其他物種fem-1c基因蛋白序列比對(duì)結(jié)果來(lái)看, FEM-1C在各物種中具有較高的保守性: 蛋白N端都是由“MDLKTAV” 7個(gè)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)為起始; C端都以R氨基酸結(jié)尾; 第80—190個(gè)氨基酸(包含第3—6個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域)和第310—400個(gè)氨基酸(包含第2個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域和第1個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域)兩區(qū)間保守性尤高, 分別僅有15個(gè)和9個(gè)氨基酸在不同物種中存在差異。此外, 對(duì)上述僅有的15個(gè)和9個(gè)氨基酸差異進(jìn)行分析, 可以發(fā)現(xiàn)這些差異反映出魚(yú)類與其他脊椎動(dòng)物的不同。譬如, 第145個(gè)氨基酸和第355個(gè)氨基酸, 所列6種魚(yú)類編碼同一種氨基酸, 而其余物種編碼另一種相同氨基酸。類似現(xiàn)象在其他位置(第407、431、438、441、479、483、513、550和557個(gè)氨基酸)也多次出現(xiàn)。這顯示出魚(yú)類在進(jìn)化關(guān)系上有別于與其他陸生高等動(dòng)物的特點(diǎn)。

在野生型斑馬魚(yú)中, 雌雄性腺分化始于受精后15d, 最明顯的分化現(xiàn)象集中發(fā)生在受精后19—23d,期間未分化性腺經(jīng)歷了兩種發(fā)育過(guò)程: 雄性斑馬魚(yú)性腺中, 出現(xiàn)了卵巢細(xì)胞凋亡及卵巢腔裂解; 而雌性斑馬魚(yú)性腺中, 卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育直至成熟[32]。根據(jù)半定量RT-PCR分析fem-1c基因的時(shí)空表達(dá)特征, fem-1c基因在斑馬魚(yú)中的起始表達(dá)時(shí)間與斑馬魚(yú)性別分化期吻合。根據(jù)組織原位雜交結(jié)果, fem-1c基因在斑馬魚(yú)卵巢發(fā)育過(guò)程中定位于Ⅰ期、Ⅱ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中。且隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育, 信號(hào)強(qiáng)度經(jīng)歷了由弱到強(qiáng), 再減弱直至消失的過(guò)程, 顯示出斑馬魚(yú)fem-1c只在斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞發(fā)育的特定時(shí)期表達(dá), 在成熟卵細(xì)胞中不表達(dá)的基本特征。fem-1c的這些表達(dá)特征, 暗示著該基因很可能與斑馬魚(yú)雌性個(gè)體的卵巢分化有關(guān), 但其具體生物學(xué)功能有待進(jìn)一步的研究。

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THE CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF ZEBRAFISH FEM-1C, A MEMBER OF FEM-1 FAMILY

SHI Jian-Tao1,2, LI Zhi1, GUI Jian-Fang1and ZHOU Li1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Feminization-1 (fem-1) gene was first discovered in Caenorhabditis elegans, and it plays an important role in nematode sex determination. The mutation in fem-1c could feminize the nematode sex differentiation. There are three conservative members of fem-1 family in vertebrate, namely fem-1a, fem-1b and fem-1c. We cloned the entire cDNA sequence of fem-1c from zebrafish ovary cDNA library using RACE-PCR. The full length of zebrafish fem-1c cDNA was 2701 bp, encoding a 618-amino acid protein. We used online bioinformatic software and predicted that the FEM-1C protein contained 9 ANK domains, 2 TPR domains and 2 low complexity regions. Zebrafish FEM-1C shared a highly conservative protein sequence with its homologues in other vertebrates. The sequence analysis also revealed that in vertebrates there was a conservative synteny between fem-1c and its neighborhood genes, especially the nearest 4—5 genes such as tmed7 and trim36. We conducted the expression analysis in different tissues of adult zebrafish using RT-PCR and found that fem-1c was exclusively expressed in the ovary. The expression analysis in the gonad of larvae at different development stages showed that the expression of fem-1c began on the 17th day post-fertilization. The in situ hybridization results showed that fem-1c was expressed in cytoplasm at stage I and Ⅱ of oocyte. This specific expression pattern suggested that fem-1c might play a role in zebrafish ovary development.

fem-1c; Ovary differentiation; In situ hybridization; Zebrafish

Q344+.1

A

1000-3207(2015)03-0459-09

10.7541/2015.61

2014-05-04;

2014-08-11

國(guó)家973計(jì)劃(2010CB126301); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(NYCYTX-49)資助

侍建濤(1987—), 男, 內(nèi)蒙古阿拉善盟人; 碩士研究生; 主要從事發(fā)育遺傳學(xué)研究。E-mail: sjt0408@163.com

周莉, E-mail: zhouli@ihb.ac.cn