鄭銳東, 姚啟聰, 廖 鵬, 吳漫曄

(1.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 實(shí)訓(xùn)中心， 廣東 揭陽 522000； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司， 廣東 廣州 510006； 3.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系， 廣東 揭陽 522000)

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三七根部總RNA不同提取方法的比較

鄭銳東1, 姚啟聰2，3, 廖 鵬3, 吳漫曄3

(1.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 實(shí)訓(xùn)中心， 廣東 揭陽 522000； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司， 廣東 廣州 510006； 3.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系， 廣東 揭陽 522000)

為探明三七根部總RNA的最佳提取方法，獲取高質(zhì)量RNA，選取三七根部為材料，比較Trizol試劑法、CTAB法、改良Trizol法和試劑盒法提取三七根部總RNA的質(zhì)量。結(jié)果表明：4種方法提取三七根部RNA效果不同，其中以改良Trizol法提取RNA的質(zhì)量最高，其RNA的OD260/OD280為2.00，OD260/OD230為1.90，28S∶18S為1.9，RIN值為7.4，質(zhì)量濃度為386 μg/μL。而另外3種方法易出現(xiàn)樣品降解、鹽離子殘留。結(jié)論：改良Trizol法適用于三七根部總RNA的提取。

三七根部； RNA提取； 改良Trizol法

三七(Panaxnotoginseng)又名田七，五加科人參屬植物[1]，藥用歷史悠久，是我國名貴的特產(chǎn)中藥材，僅產(chǎn)于我國滇桂西南部，素有參中之王美譽(yù)[2]。三七具有保護(hù)心血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、消炎、抗腫瘤、抗衰老等一系列藥理作用[3]。隨著對(duì)三七的深入研究，其更多的藥理作用及臨床應(yīng)用也越來越受到關(guān)注。一些學(xué)者已開始關(guān)注三七的微觀層次，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究其抗病蟲害基因、有效成分合成調(diào)控基因已成為三七的研究趨勢(shì)[4-5]。進(jìn)一步研究三七分子生物學(xué)作用，提取三七高質(zhì)量RNA是試驗(yàn)關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量關(guān)于三七分子生物學(xué)方面的研究并取得成效，趙洋等[6]采用CTAB法、天根試劑盒法、普通Trizol法、改良Trizol法對(duì)三七種子總RNA進(jìn)行提取比較表明，改良Trizol法提取的三七種子RNA純度好、濃度高，質(zhì)量符合后續(xù)的cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的要求；陳莉等[7]比較利用改進(jìn)的異硫氰酸胍一步法、異硫氰酸胍高鹽法、CTAB法和Thomas’RNA提取法等4種方法提取三七根莖2個(gè)部位總RNA的可行性表明，改進(jìn)的異硫氰酸胍一步法和異硫氰酸胍高鹽法能有效地抑制酚類物質(zhì)、多糖及皂苷等次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)總RNA的影響，可從三七根莖中獲得質(zhì)量高、完整性較好的總RNA。但比較Trizol試劑、CTAB、改良Trizol和試劑盒4種方法提取三七根部總RNA的質(zhì)量尚未見報(bào)道，故筆者利用此4種方法提取三七根部總RNA，以期解決因三七細(xì)胞成分的復(fù)雜性、次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性制約其提取高質(zhì)量RNA的難題，探明三七根部總RNA的最佳提取方法，為其相關(guān)分子生物學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 三七 四年生，取自云南文山平壩鎮(zhèn)。用清水沖洗表面泥土后用RNA-Free water沖洗1次，置于消毒濾紙上晾干，液氮速凍，-80℃保存。

1.1.2 試劑 Trizol購自Invitrogen公司，CTAB緩沖液(2% CTAB、2.5%聚乙烯吡咯烷酮PVP-40，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，25 mmol/L EDTA，2%β-巰基乙醇，2 mol/L NaCl)，以上除NaCl為國產(chǎn)分析純外，其余試劑均購自Sigma公司，去多糖多酚試劑盒、氯仿、酚∶氯仿(25∶24，pH5.2)、無水乙醇、異丙醇、75%乙醇、3 mol/L乙酸鈉、β-巰基乙醇、1%PVP、RNA-Free water(104 kPa，121℃滅菌45 min)購自Tiangen公司，以上試劑均用RNA-Free water配制。

1.1.3 儀器設(shè)備 4℃離心機(jī)、研缽(180℃烘4 h)、移液槍、RNA-Free離心管(購自Axygen公司)、RNA-Free槍頭、凝膠成像系統(tǒng)、毛細(xì)管電泳系統(tǒng)、NanoDrop 2000，Agilent 2100生物分析儀等。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 Trizol法[8]取0.1 g材料置于研缽中，在液氮環(huán)境下研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加1 mL Trizol充分混勻，15～25℃靜置10 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。再加入200 μL氯仿充分混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積酚仿(酚∶氯仿=25∶24)混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清液加入等體積的氯仿充分混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃沉淀1 h，4℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清，加 700 μL 75%乙醇，洗滌沉淀，重復(fù)1次，用4℃ 12 000 r/min離心5 min。棄上清，甩一下后吸干乙醇，真空干燥2 min，加30 μL RNA-Free 雙純水，室溫溶解10 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB法[9]取0.1 g材料置于研缽中，在液氮環(huán)境下研磨至粉末，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加600 μL預(yù)熱CTAB(預(yù)先加入2%β-巰基乙醇)充分混勻，65℃水浴30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液，混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清重復(fù)上一步。取上清加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，4℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清加入等體積異丙醇，沉淀后4℃ 12 000 r/min離心10 min。加700 μL 75%乙醇，洗滌沉淀，重復(fù)1次，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清。甩一下后吸干乙醇，真空干燥 2 min，加30 μL RNA-Free water，室溫溶解10 min ，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 改良Trizol法[8、10]取0.1 g材料置于研缽中，在液氮環(huán)境下研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加1 μL Trizol充分混勻，室溫靜置10 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min；取上清，加入200 μL氯仿、35 μL 3 mol/L乙酸鈉、15 μL β-巰基乙醇、10 μL 1%PVP，充分混勻，冰浴15 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min；取上清并加入等體積異丙醇、200 μL 3 mol/L乙酸鈉，-20℃沉淀1 h，4℃ 12 000 r/min離心10 min棄上清；加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)1次，4℃ 12 000 r/min 離心5 min，棄上清。甩一下后采用槍頭小心吸干，盡量減少乙醇?xì)埩?，真空干? min，加30 μL RNA-Free 雙純水，室溫溶解5 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試劑盒法[11]取500 μL裂解液RL(預(yù)先加入β-巰基乙醇)，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中。液氮中研磨0.1 g材料成粉末后轉(zhuǎn)入上述離心管中，劇烈振蕩20 s，充分裂解，室溫靜置5 min。將裂解物12 000 r/min離心2 min，取上清并轉(zhuǎn)移至SC過濾柱上12 000 r/min離心2 min，精確測(cè)量裂解物(上清)體積，加0.5體積無水乙醇，混勻。將混合物加入吸附柱CR3中，12 000 r/min離心15 s，去除廢液；加350 μL去蛋白液RW1，12 000 r/min離心15 s，去除廢液；加入80 μL DNase I工作液，室溫靜置15 min，加350 μL去蛋白液RW1，12 000 r/min離心15 s，去除廢液。加入350 μL漂洗液RW(使用前加入60 mL無水乙醇)，12 000 r/min離心15 s，去除廢液；加入500 μL漂洗液RW，重復(fù)1次。將CR3置于空收集管，12 000 r/min離心2 min，去除漂洗液；取出CR3，放入RNase free離心管中，在吸附膜的中間部位加30 μL RNase free water，室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 質(zhì)量及完整性檢測(cè)

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳 稱取0.3 g瓊脂糖加入30 mL TAE，加熱熔化瓊脂糖，待溫度下降到60℃，加入3 μL EtBr，把溶液倒入制膠板中冷卻，在電泳槽中加入500 mL電泳液，分別上樣1 μL RNA 樣品，100 V穩(wěn)壓電泳15 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照。

1.3.2 RNA完整性檢測(cè) 分別取不同提取方法中的1 μL RNA溶液在NanoDrop 2000檢測(cè)濃度及在260/280、260/230中的吸光度。

1.3.3 毛細(xì)管電泳檢測(cè) 取4種不同方法中RNA完整性最優(yōu)的RNA進(jìn)行毛細(xì)管電泳，Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RIN及28S∶18S。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取三七根部總RNA完整性

由圖1可見，常規(guī)Trizol法可以提取18S、28S和5S，但5S非常亮，說明RNA大部分已降解；28S和18S兩者熒光強(qiáng)度差別小，未呈明顯的2倍差異關(guān)系，而且出現(xiàn)大片段條帶，說明存在DNA污染，總體上RNA完整性較差。改良Trizol法提取的總RNA，28S和18S譜帶整齊清晰，帶型無拖尾和彌散，亮度接近明顯的2∶1關(guān)系，而且5S條帶較弱，表明RNA基本無降解，結(jié)構(gòu)完整，加之點(diǎn)樣孔中無亮帶，雜質(zhì)少，表明該法提取的RNA質(zhì)量?jī)?yōu)良。傳統(tǒng)的CTAB法提取繁瑣而且需要過夜沉淀， RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)增加，故提取的RNA 5S非常亮，未出現(xiàn)28S和18S，證明RNA全部降解，表明此方法不適合參試材料RNA的提取。試劑盒提取法從電泳圖上看基本無28S和18S，5S也較弱，RNA已經(jīng)全部降解。因?yàn)镽AN過柱子時(shí)將小片段的RNA分子已經(jīng)全部過濾，故5S也較弱。因此，此方法也不適合三七根部總RNA的提取。綜合上述4種方法，改良Trizol法提取的RAN質(zhì)量明顯優(yōu)于其他3種提取方法，由此初步地確立改良Trizol法為提取三七根部總RNA首選方案。

注(Note)：M:DL2000 Marker;Note1,PanaxnotoginsengRNA.

圖1 不同方法提取三七根總RNA的電泳圖譜

Fig.1 The total RNA electrophoretogram of different extraction methods fromP.pseudoginsengroot

2.2 不同方法提取三七根部總RNA濃度和純度

由表1可知，改良Trizol法、CTAB法提取的RNA總量較高。但從OD260/OD280的比值看，Trizol法為1.59<1.80，表明提取物中含有多糖多酚污染，導(dǎo)致RNA獲得率降低。CTAB法和試劑盒法的OD260/OD280比值偏高，說明樣品存在降解。從OD260/OD230的比值來看，Trizol法、CTAB法和柱子法均小于1.80，說明還有鹽離子殘留。而改良Trizol法的OD260/OD280和OD260/OD230均在1.80～2.00，說明無蛋白和次生代謝產(chǎn)物污染，總量和濃度均符合要求。結(jié)合電泳圖，改良Trizol法是最適宜三七根部組織RNA提取的方法。

表1 不同方法提取三七根部總RNA的濃度和純度

圖2 三七根部RNA的完整性與28S、18 S比值

Fig.2 The integrity and ratios of 28S∶18S of the RNA which meets the demand for transcriptome analysis

2.3 毛細(xì)管電泳分析RNA用于高通量測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)

比較4種提取RNA方法結(jié)果，選擇改良Trizol法提取三七根部的RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)。如圖2所示，RIN值為7.4，28S∶18S為1.9，濃度為386 μg/μL，表明，改良Trizol法提取的RNA符合進(jìn)行RNA-sep等高通量測(cè)序要求。

3 結(jié)論與討論

RNA本身不穩(wěn)定，易降解。此外，不同植物種類及同種植物不同組織內(nèi)部物質(zhì)組分、含量有較大差異，不同部位代謝產(chǎn)物差異也非常顯著，其RNA提取方法也不盡相同[12]。因此，要獲得高質(zhì)量RNA需要不斷地摸索和優(yōu)化條件。特別是成熟三七根部中含有大量的酚類、多糖類及其他代謝產(chǎn)物，其中多糖類物質(zhì)在研磨過程中會(huì)包含RNA形成沉淀[13-14]；酚類物質(zhì)易被氧化成醌，并與RNA發(fā)生不可逆結(jié)合，形成褐化效應(yīng)[15]，影響RNA的提取。Trizol法提取總RNA時(shí)，溶液中酚類物質(zhì)容易被氧化成醌，后者能與RNA結(jié)合，直接影響RNA的提取。CTAB是一種陽離子去污劑，可有助于細(xì)胞裂解并能從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀酸性多聚糖和核酸的特性。而在高離子強(qiáng)度溶液環(huán)境中，由于溶解度差異，CTAB與多聚糖、蛋白形成沉淀，但核酸仍可通過有機(jī)溶劑抽提，去除酚類、蛋白等雜質(zhì)后加乙醇即可分離出核酸[16-17]。試劑盒法提取RNA時(shí)先用異硫氰酸胍/酚裂解細(xì)胞，同時(shí)使RNA酶失活，然后RNA在高鹽環(huán)境下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，通過多次快速漂洗、離心，除去蛋白等雜質(zhì)，最后利用RNAase free water洗脫RNA[18]。但根據(jù)分析結(jié)果，上述3種方法并不適合三七根部RNA提取。改良Trizol法中的PVP因具有很強(qiáng)的酚螯合能力，且β-巰基乙醇具有強(qiáng)還原性，雙重作用能有效防止酚類物質(zhì)被氧化成醌進(jìn)而與RNA結(jié)合。同時(shí)，PVP為水溶性，容易通過抽提除去[19]，故改良Trizol法能最大程度地簡(jiǎn)化操作程序，分離純化出完整性較好的總RNA。此法中加入試劑的作用機(jī)理與趙洋等[6]提到的方法原理有相似之處，結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了其在三七根部總RNA提取中的可靠性。

與其他3種方法相比，改良Trizol法能有效去除提取過程中殘留的β-巰基乙醇、異硫氰酸胍及三七的酚、糖類物質(zhì)，提取的總RNA純度高，完整性好，可用于進(jìn)一步的RT-PCR和構(gòu)建cDNA文庫等分子操作，是三七根部總RNA提取最適宜的方法。

[1] 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京:科學(xué)出版社,1983:1024-1025.

[2] 王海燕, 容 蓉, 田景振.三七活性成分藥理作用及臨床應(yīng)用概述[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,38(2):178.

[3] 甘 雨, 徐惠波, 孫曉波.三七總皂苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(5):1251-1252.

[4] 趙勝軍.高羊茅耐鹽基因工程育種及耐鹽植物脅迫相關(guān)基因NHX|TaPOD|TaPOX的克隆、表達(dá)及功能分析[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2007.

[5] 王春暉,趙云雷,王紅梅,等.適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棉花幼根總RNA提取方法篩選[J].棉花學(xué)報(bào),2013,25(4):372.

[6] 趙 洋,段承俐.三七種子總RNA提取方法的比較[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,26(1):42-46.

[7] 陳 莉,朱 華,李 坤,等.三七總RNA提取方法的對(duì)比研究[J].生物技術(shù)通訊，2005,16(5):428-430.

[8] 李 苗,李國旗.羅布麻總RNA提取方法比較研究[J].北方園藝, 2014(11):93-96.

[9] 賴 來.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MADS-box基因轉(zhuǎn)化黃瓜初步研究[D].上海:上海交通大學(xué),2007.

[10] 陳 靜,高 飛,周宜君,等.改良Trizol 法提取高質(zhì)量蒙古沙冬青總RNA[J].生物技術(shù)通報(bào), 2013(10):88.

[11] 羅 兵.甘藍(lán)SRK-SCR相互作用研究及作用強(qiáng)度與酵母生長(zhǎng)關(guān)系模型的構(gòu)建[D].重慶:西南大學(xué),2011.

[12] 田 偉,田義軻,王彩虹,等.蘋果組織總RNA提取方法的比較研究[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(2):122-125.

[13] 李 宏,王新力.植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對(duì)策[J].生物技術(shù)通報(bào),1999(1):36-38.

[14] Lewinsohn E, Steele C L, Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J]．Plant Mol Biol Reptr,1994,12:20-25.

[15] Lessard P, Decroocq V, Thomas M, et al. Extraction of RNA, cloning and subtractive Hybridization[C]. Clark MS. Plant molecular biology: A laboratory manual. New York: Springer, 1997:154-222.

[16] 劉曉菊,洪海波,李 敏,等.改良CTAB法提取核桃總RNA試驗(yàn)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(1):97-99.

[17] 賴曉鷗.人工栽培黃花蒿單株樣本青蒿素含量測(cè)定方法的優(yōu)化與遺傳多態(tài)性的分析研究[D].成都:四川師范大學(xué),2007.

[18] 李 玲.miRNA128-b在NSCLC中調(diào)節(jié)EGFR的表達(dá)[D].濟(jì)南:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2010.

[19] 胡 薇,白 石,祝 濤,等.人參根組織RNA提取方法的研究與優(yōu)化[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(5):505-508.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Comparison of Different Extraction Methods of Total RNA fromPanaxpseudoginsengRoot

ZHENG Ruidong1, YAO Qicong2,3, LIAO Peng3, WU Manye3

(1.TrainingCenter,JieyangVocationalandTechnicalCollege,Jieyang,Guangdong522000； 2.GuangzhouGeneDenovoBiologicalTechnologyCo.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong510006;3.BioengineeringDepartment,JieyangVocationalandTechnicalCollege,Jieyang,Guangdong522000,China)

In order to obtain efficient extraction method and high quality RNA fromP.pseudoginsengroot, Comparison of Trizol method, CTAB method, modified Trizol method and isolation kit method for total RNA extraction from root ofP.pseudoginsengwas conducted. Results: The four methods were of various extraction effects, of which, the modified Trizol method with 2.00 OD260/OD280, 1.90 OD260/OD230, 1.9 28S∶18S, 7.4 RIN, 386 μg/μL mass concentration was the best. The other three methods easily lead to sample degradation or saltion residues. Conclusion: The modified Trizol method is an efficient extraction method of RNA fromP.pseudoginsengroot.

Panaxpseudoginsengroot; RNA extraction; modified Trizol method

2014-11-09； 2015-04-15修回

鄭銳東(1982-)，男，講師，從事生物工程教學(xué)與研究。E-mail:superzrd@163.com

1001-3601(2015)05-0268-0183-04

S567.23+6

A