李奕星， 袁德保，陳 嬌， 鄭曉燕， 李芬芳， 鄭麗麗， 王朝政， 譚 琳

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室， 海南 ?？?570102)

?

黃皮不同部位提取物的抗氧化活性

李奕星， 袁德保，陳 嬌， 鄭曉燕， 李芬芳， 鄭麗麗， 王朝政， 譚 琳*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 ?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室， 海南 ?？?570102)

為綜合開發(fā)利用黃皮，選擇黃皮枝條、果皮、果肉和種子4個部位，采用95 %乙醇浸提，得到4個部位的提取物，采用分光光度法，考察該4個部位提取物的多酚含量以及對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨(ABTS)自由基、羥自由基和過氧化氫的清除活性。結(jié)果表明：黃皮果皮、枝條、果肉和種子浸膏的多酚含量分別為165.6 μg/mg、152.0 μg/mg、131.8μg/mg和117.5μg/mg；在0.05～2.0 mg/mL，對4種自由基的清除率呈量效關(guān)系，且清除率和半數(shù)清除率(IC50)均為果皮>枝條>果肉>枝子。

黃皮； 抗氧化活性； 多酚

黃皮(ClausenalansiumLour.)為蕓香科(Rutaceae)黃皮屬(Clausena)小喬木[1]，是我國熱帶及亞熱帶的新興優(yōu)良果樹，已有1500年以上的栽培歷史[2]。其果實多汁，味道偏酸，完全成熟時，酸中帶甜，風(fēng)味獨特，清香爽口，可做甜品、果醬等。此外，其多糖的果汁發(fā)酵后能制作雞尾酒口味的碳酸飲料[3]?！吨兴幋筠o典》記載，黃皮的果、葉、根、種子均能入藥，其果實有行氣、消食、化痰的功效，主治食積脹滿、脘腹疼痛、疝痛、痰飲、咳喘，根、葉及種子也可治腹痛、胃痛、感冒發(fā)熱等證[4]。目前，已經(jīng)從黃皮中分離得到一系列的化合物，如黃皮酰胺類[5]、咔唑類[6-7]、香豆素類[8]和揮發(fā)油[9]等。

據(jù)文獻報道，黃皮的生物活性主要有抗真菌和艾滋病逆轉(zhuǎn)錄酶抑制作用[10]，抗毛滴蟲、抗糖尿病、抗炎和保肝活性[11]，抗過敏活性[12]等。此外，還有文獻報道，黃皮的皮具有抗氧化活性，且乙酸乙酯段活性最好[13]。然而，由于采收季節(jié)短，黃皮多為鮮食，并未得到廣泛推廣，且果皮、細枝、種子多被棄置，缺乏針對黃皮及其不同部位開發(fā)應(yīng)用的研究。因此，選擇黃皮為研究對象，分別對其枝條、皮、果肉、種子進行多酚含量測定，并通過清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、清除羥自由基和過氧化氫能力4個方面考察這4個部位的抗氧化能力，以期為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃皮成熟果實及枝條，購買于海南?？?，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站鑒定。

試劑與儀器設(shè)備：ABTS、DPPH(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)，F(xiàn)olin-酚(美國sigma公司)，沒食子酸(阿拉丁試劑上海有限公司)，水楊酸、鐵氰化鉀、水楊酸、過硫酸鉀、三氯乙酸、雙氧水等均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn))。

AXLD-1830超純水系統(tǒng)(美國阿修羅科技有限公司)，RF-UV1240紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，TGL-20bR高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 黃皮不同部位提取物的制備

取新鮮黃皮果及枝條洗凈、瀝干，將枝條、果皮、果肉、果核分開，于40℃烘箱中干燥后，粉碎過60目篩，用體積分數(shù)為95%的乙醇超聲浸提3次，抽濾，減壓濃縮至干，分別得到枝條浸膏、果皮浸膏、果肉浸膏和果核浸膏。

1.3 黃皮不同部位提取物的多酚含量測定

多酚標準曲線參照Hanmmerschmidt P A 等[14]報道的Folin-Denis改良法建立，精密稱取待測樣品，分別用無水乙醇稀釋成1 mg/mL，按照標準曲線的測定方法，平行測定3次，取其平均值，并按標準曲線計算多酚含量。

1.4 抗氧化性的測定

1.4.1 清除DPPH的活性 參照文獻[15]報道的方法進行測定。取無水乙醇將樣品分別配制成0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的待測樣品溶液。各取0.2 mL待測溶液，加入4 mL濃度為0.1 mmol/mL的DPPH溶液，搖勻置暗處反應(yīng)30 min后，于波長517 nm處測其吸光度Ai，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率 =[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(1)

式中，Ai為待測樣品溶液+ DPPH溶液的吸光度，Aj為待測樣品溶液+無水乙醇的本底吸光度，A0為無水乙醇+DPPH溶液的空白對照吸光度。

1.4.2 清除ABTS的活性 參考Villano D等[16]報道的方法，稍加改進。取超純水將樣品分別配制成0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的待測樣品溶液，各取0.2 mL，分別加入1.9 mL ABTS自由基工作液，準確反應(yīng)6 min后于734 nm處測定吸光度Ai，重復(fù)3次，取平均值。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率 =[1-(Ai-Aj) /A0]×100 %

(2)

式中，Ai為待測樣品溶液+ABTS溶液的吸光度，Aj為待測樣品溶液+超純水的本底吸光度，A0為超純水+ABTS溶液的空白對照吸光度。

1.4.3 清除羥自由基活性 采用孫紅男[17]報道的方法，并稍加改進。取超純水將樣品分別配制成0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的待測樣品溶液，在反應(yīng)體系中先加入5 mmol/L的水楊酸-乙醇2 mL、10 mmol/L的FeSO41 mL,混勻，分別加入1 mL不同濃度的待測樣品溶液，并用去離子水使反應(yīng)體系補至7 mL，最后加2 mL H2O2啟動反應(yīng)，37℃保溫30 min，于510 nm處測定吸光值同時，重復(fù)3次，取平均值。按式(3)計算羥自由基清除率。

羥自由基清除率 =[1-(Ai-Aj) /A0]× 100%

(3)

式中：Ai為加入待測樣品溶液的吸光度，Aj為不加H2O2時加入待測樣品溶液的本底吸光度，A0為加入待測樣品溶劑的空白對照吸光度。

1.4.4 清除過氧化氫活性 按文獻[18-19]方法，并加以改進。取pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液將樣品分別配制成0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的待測樣品溶液，取待測樣品溶液5 mL，加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液配制的10 mmol/L H2O2溶液，搖勻置暗處反應(yīng)30 min后，于波長248 nm處測其吸光度Ai，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。按式(4)計算過氧化氫清除率。

H2O2清除率 % =[1-(Ai-Aj) /A0]×100%

(4)

式中，Ai為待測樣品溶液+ H2O2溶液的吸光度，Aj為待測樣品溶液+磷酸鹽緩沖溶液的吸光度，A0為磷酸鹽緩沖溶液+ H2O2溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃皮不同部位提取物的多酚含量

以總酚(以沒食子酸計)濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，求得回歸方程：

y= 0.001 6x+ 0.054 1，R2= 0.997。

黃皮不同部位提取物的多酚含量最低的為種子浸膏(117.5±0.46)μg/mg，最高的為果皮浸膏(165.6 ±0.35) μg/mg，枝條浸膏和果肉浸膏的多酚含量分別為(152.0 ±0.75)μg/mg和(131.8 ±0.85)μg/mg。

圖1 沒食子酸的標準曲線

2.2 黃皮不同部位提取物的抗氧化活性

2.2.1 清除DPPH自由基能力 由圖2A可見，不同部位提取物清除DPPH自由基的能力與濃度呈線性關(guān)系，黃皮果皮、枝條、果肉、種子提取物與DPPH清除率的線性方程分別為

y果皮= 49.278x+ 16.574,R2= 0.920 6, IC50= 0.678 3 mg/mL；

圖2 黃皮不同部位提取物對DPPH、ABTS、OH-·H2O2的清除率

Fig.2 Scavenging rates of different parts ofC.lansiumon DPPH radical, ABTS radical, hydroxyl radical and hydrogen peroxide

y枝條= 45.711x+ 7.2134,R2= 0.995 4, IC50= 0.936 0 mg/mL；

y果肉= 42.509x+ 6.115 1,R2= 0.991 4, IC50= 1.032 4 mg/mL；

y種子= 30.968x+ 8.577,R2= 0.988 8, IC50= 1.337 6 mg/mL。

可見，清除DPPH自由基能力為果皮>枝條 >果肉>種子。

2.2.2 清除ABTS自由基能力 由圖2B可見，提取物清除ABTS自由基的能力與濃度呈線性關(guān)系，黃皮果皮、枝條、果肉、種子提取物與ABTS清除率的線性方程分別為

y果皮= 42.121x+ 9.900 7,R2= 0.980 1,

IC50= 0.952 0 mg/mL；

y枝條= 39.77x+ 8.208 6,R2= 0.980 2,

IC50= 1.050 8 mg/mL；

y果肉= 27.767x+ 9.192 2,R2= 0.993 1,

IC50= 1.469 6 mg/mL；

y種子= 20.445x+15.56,R2= 0.964 5,

IC50= 1.684 5 mg/mL。

可見，清除ABTS自由基能力為果皮 >枝條 >果肉>種子。

2.2.3 清除羥自由基能力 由圖2C可見，提取物清除羥自由基的能力與濃度呈線性關(guān)系，黃皮果皮、枝條、果肉、種子提取物與羥自由基清除率的線性方程分別為

y果皮= 360.1x+ 49.638,R2= 0.912,

IC50= 0.001 0 mg/mL；

y枝條= 234.71x+ 26.15,R2= 0.999 2,

IC50= 0.101 6 mg/mL；

y果肉= 157.57x+19.85,R2= 0.979 1,

IC50= 0.1913 mg/mL；

y種子= 39.07x+26.268,R2= 0.962,

IC50= 0.607 4 mg/mL。

可見，清除羥自由基能力為果皮 >枝條 >果肉>種子。

2.2.4 清除過氧化氫能力 由圖2D可知，提取物清除過氧化氫能力與濃度呈線性關(guān)系，黃皮果皮、枝條、果肉、種子提取物與雙氧水清除率的線性方程分別為

y果皮= 268.57x+ 43.6,R2= 0.023 8,

IC50= 0.952 0 mg/mL；

y枝條= 215.14x+ 38.5,R2= 0.982 5,

IC50= 0.053 4 mg/mL；

y果肉=198.29x+24.3,R2= 0.967,

IC50= 0.129 6 mg/mL；

y種子= 109.97x+22.382,R2= 0.954 1,

IC50= 0.2511 mg/mL。

可見，清除雙氧水能力為果皮>枝條 >果肉>種子。

3 討論與結(jié)論

在生活中，人們往往將黃皮的果皮、枝條和種子當作廢棄物扔掉。試驗發(fā)現(xiàn)，4個不同部位提取物的多酚含量大小順序為果皮65.6 μg/mg>枝條152.0 μg/mg>果肉131.8μg/mg>種子117.5 μg/mg，并采用了4種評價體系比較黃皮4個不同部位提取物的抗氧化活性，4種方法測定的自由基清除活性以及IC50值均為果皮 >枝條>果肉>種子，表明多酚含量越高，清除活性越好，且在試驗濃度范圍內(nèi)，4個不同部位對自由基的清除率隨著提取物的濃度增加而逐漸增加，最高清除率達100%，該結(jié)果極大的提高了黃皮的綜合開發(fā)價值，可以考慮將黃皮整果開發(fā)成大眾飲品，且黃皮枝條多酚也可作為一種天然抗氧化劑，在藥品、食品中具有較好的開發(fā)前景。

試驗主要測定了黃皮不同部位提取物的多酚含量及抗氧化能力，并探討其關(guān)系。然而，植物中的抗氧化物質(zhì)不僅只有多酚，還有多糖類化合物、生物堿類、皂苷類等物質(zhì)[20]，這些物質(zhì)與黃皮的抗氧化能力之間的關(guān)系如何,還需進一步研究。

本次研究結(jié)果豐富了黃皮的化學(xué)成分和生物活性，為黃皮及其廢棄物的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Antioxidant Activity of Extracts from Different Parts ofClausenalansium

LI Yixing, YUAN Debao, CHEN Jiao, ZHENG Xiaoyan, LI Fenfang,ZHENG Lili, WANG Chaozheng, TAN Lin*

(HaikouExperimentalStation,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，HainanKeyLaboratoryofBananaGeneticImprovement,Haikou,Hainan570102,China)

The polyphenolic contents and antioxidant activities of four extracts from different parts ofC.lansiumwere analyzed for comprehensive development and utilization ofC.lansium, the peels, stems, pulp and pips ofC.lansiumwere used as raw materials, and four extracts were obtained by extracting with 95 % ethanol. The antioxidant activity of the extracts, including the polyphenolic content, scavenging activities on DPPH radical, ABTS radical, hydroxyl radical and hydrogen peroxide, were determined by ultraviolet spectrophotometry. The results showed that the polyphenolic contents in the four extracts were 165.6 μg/mg, 152.6 μg/mg, 131.8 μg/mg and 117.5μg/mg, respectively. And have free radical scavenging activities with dose-effect relationship in the concentration range of 0.05～2.0 mg/mL. The free radical scavenging activities and IC50were as follows: peels >stems >pulp >pips.

Clausenalansium; antioxidant activities; polyphenol

2014-09-01； 2015-04-27修回

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚究蒲袉禹椖俊暗包S果等熱帶優(yōu)稀水果多酚、多糖的生物學(xué)活性研究”(HKZKY140204)； 農(nóng)業(yè)部財政項目“熱帶珍稀野生果樹資源調(diào)查、收集與評價”

李奕星(1985-)，女，研究實習(xí)員，碩士，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail：yixing0221@163.com

*通訊作者:譚 琳(1974-)，女，副研究員，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究。E-mail：tanlin7402@126.com

1001-3601(2015)05-0241-0075-04

O657;S38

A