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多聚賴氨酸與EDTA交聯(lián)物對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的毒性研究*

**通信作者 E-mail:jiany110@sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.50 12.R.20150420.1929.028.html

李英琦， 張海燕**

(貴陽醫(yī)學(xué)院附院 眼科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察多聚賴氨酸與乙二胺四乙酸(EDTA)的交聯(lián)物(PLE)對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性程度。方法： 小鼠成纖維細(xì)胞L929分為正常組、對(duì)照組、多聚賴氨酸組、PLE組和EDTA組，采用MTT法比較相同濃度下，EDTA、多聚賴氨酸與EDTA交聯(lián)物對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929相對(duì)增殖率的影響。結(jié)果： 以正常組作為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組和對(duì)照組對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的相對(duì)增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在質(zhì)量濃度達(dá)為1 000 μmoL/L時(shí)，EDTA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性為2級(jí)，PLE和多聚賴氨酸對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的毒性為1級(jí)。結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)濃度的PLE和EDTA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929毒性較低，具有一定的安全性。

[關(guān)鍵詞]多聚賴氨酸； 乙二胺四乙酸； 成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞毒性

白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)主要的致盲眼病之一，隨著我國(guó)人口的老齡化，有學(xué)者預(yù)計(jì)在2020年我國(guó)50歲及以上人群的患病比例約為25%。目前治療白內(nèi)障的唯一有效的方法就是通過手術(shù)來恢復(fù)視覺功能，但術(shù)后的后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO) 是最常見并發(fā)癥。PCO的出現(xiàn)亦可能引起患者再次發(fā)生視力障礙(又稱后發(fā)性白內(nèi)障)。現(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)保留了囊袋， 囊袋由部分前囊和整個(gè)后囊組成， 起到隔離房水和玻璃體的作用，大部分囊袋內(nèi)放置了人工晶狀體。白內(nèi)障術(shù)后剩余前囊膜的晶狀體上皮細(xì)胞會(huì)頑固地殘留，這些殘留的晶狀體上細(xì)胞(1ens cells，LEC)黏附、增殖、移行，導(dǎo)致后囊epithelial混濁。LEC需要黏附才能正常生長(zhǎng)，細(xì)胞黏附的破壞可以致細(xì)胞凋亡。整合素是一類ca2+依賴的介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用的黏附分子，維持正常細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)，其與細(xì)凋亡的關(guān)系密切。劉建亭研究發(fā)現(xiàn)，EDTA可破壞細(xì)胞間連接，減輕后囊膜混濁。張海燕等研究發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid,EDTA)的交聯(lián)物(polylysine-EDTA,PLE)可顯著降低兔PCO的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞 L929中加入PLE,觀察其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

1材料和方法

1．1　材料

DMEM/1640(美國(guó)Sigma公司)， PBS片溶劑(美國(guó)Sigma公司)， 胰蛋白酶(美國(guó)Solarbio公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)， MTT(美國(guó)Solarbio公司)， EDTA(美國(guó)Sigma公司)，DMSO(重慶川東化工)，多聚賴氨酸( Poly-L-Lysine， 美國(guó)Sigma公司)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，湖南湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所)。Olympus倒置顯微鏡CKX-41(日本，Olympus)，板式酶標(biāo)儀ZS-2(北京，新風(fēng)機(jī)電)，二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-175(日本，三洋)，超凈工作臺(tái)BHC-1300(蘇洲，安泰)。

1．2　方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組小鼠成纖維細(xì)胞L929，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，成纖維細(xì)胞分5組：正常組，加入1 000 μmoL/L的 DMSO細(xì)胞培養(yǎng)液；對(duì)照組，加入含1 000 μmoL/L的二甲基亞砜培養(yǎng)液；多聚賴氨酸組，加入含1 000 μmoL/L的多聚賴氨酸培養(yǎng)液；PLE組，加入1 000 μmoL/L的PLE培養(yǎng)液；EDTA組，加入1 000 μmoL/L的EDTA培養(yǎng)液。

1.2.2試驗(yàn)步驟參照使用說明書，利用EDC將EDTA與多聚賴氨酸結(jié)合起來，將所得PLE 40 mL (含2.687 mmoL/L EDTA) 放入冷凍干燥機(jī)中濃縮， 加蒸餾水至100.748 mL (含1 000μmol/L EDTA)，同時(shí)用5.6% NaHCO3調(diào)pH值至7。參照GB/T16886.5-ISO10993-5，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成纖維細(xì)胞L929 用質(zhì)量濃度為2.5 g/L 的胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成終濃度為5×107/L 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，而后每孔加入新配制的5 g/L MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔中上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL溶解甲瓚沉淀，用微型超聲振蕩器震蕩搖勻 10 min，使紫色培結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3　觀察指標(biāo)

根據(jù)測(cè)定的吸光值按下式計(jì)算相對(duì)增殖度(RGR)，并按表1的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。RGR%=A試驗(yàn)組/A正常組×100%。

表1　毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　成纖維細(xì)胞的相對(duì)增殖度

由表2可知，以正常組作為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組、對(duì)照組對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929 的相對(duì)增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組RGR值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；多聚賴氨酸組、PLE組之間RGR值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2　各試驗(yàn)組對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性

EDTA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性為2級(jí)，PLE和多聚賴氨酸對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性為1級(jí)。見表2。

3討論

后發(fā)性白內(nèi)障是因術(shù)后殘留的前囊膜下及赤道部晶體上皮細(xì)胞，增殖轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞，并沿后囊膜遷徙，使晶狀體后囊出現(xiàn)混濁。利用藥物和免疫方法，抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和纖維化反應(yīng)，是預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障研究中的熱點(diǎn)。EDTA是一種常用的Ca2+螯合劑，它在水中溶解度高，不易透過細(xì)胞膜，相對(duì)無毒，分子量372道爾頓；在體外實(shí)驗(yàn)中常用于分離上皮細(xì)胞與基底膜。利用EDTA分散組織細(xì)胞的特性， Humphry等和 Nishi等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EDTA能夠很好地松解晶狀體上皮細(xì)胞；Bretton等[10]研究發(fā)現(xiàn)多聚賴氨酸可選擇性地與晶狀體囊膜結(jié)合；楊金玲等[11]將EDTA與多聚賴氨酸交聯(lián)后特異性作用于晶狀體囊，以達(dá)到有效地清除晶狀體上皮細(xì)胞的目的。

表2　各實(shí)驗(yàn)組小鼠成纖維細(xì)胞L929

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與陽性對(duì)照組比較，P<0.01

細(xì)胞毒性試驗(yàn)大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量、測(cè)試時(shí)間較短、靈敏度較高、重現(xiàn)性較好，可以用于藥物安全性的快速篩查和初步篩查。目前國(guó)內(nèi)外一般使用MTT法和形態(tài)學(xué)觀察法對(duì)藥物的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析[12]。形態(tài)學(xué)觀察法檢測(cè)藥物毒性最為常用，在顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，藥物濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)細(xì)胞會(huì)變圓、固縮性壞死和脫落，但此法主觀性強(qiáng)，結(jié)果可靠性不高。目前MTT3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法在體外腫瘤細(xì)胞化療藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用越來越廣泛，成為評(píng)價(jià)藥物安全的重要指標(biāo)，檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO) 能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在一定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，此法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。本試驗(yàn)分別采用MTT法，分析測(cè)定結(jié)果以評(píng)價(jià)PLE對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929 的毒性，結(jié)果顯示，以正常組作為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組和對(duì)照組對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929 的相對(duì)增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在質(zhì)量濃度達(dá)為1 000 umoL·L-1時(shí)，EDTA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性為2級(jí)，PLE和多聚賴氨酸對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞 L929的毒性為1級(jí)。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLE對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，其細(xì)胞相對(duì)增殖率較高而細(xì)胞毒性較低，具有一定的安全性。

4參考文獻(xiàn)

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(2014-10-18收稿，2015-02-14修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Toxicity Study of Conjugates of PLL and EDTA on Mouse Fibroblast

LI Yingqi， ZHANG Haiyan

(OphthalmologyCenter,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the toxicity degree of PLE from EDTA and Poly-L-Lysine (PLL) on fibroblast L929 of mouse in vitro culture. Methods: Mouse fibroblast L929 were divided into normal group, control group, PLL group, PLE group and EDTA group, adopting MTT method to compare the effect of EDTA and PLE on proliferation of mouse fibroblast L929 under the same concentration. Results: Taking normal group as standard (100%), relative growth rate (RGR) of L929 in PLL group, EDTA group, PLE group and control group were 79.87%、69.35%、81.47% and 20.12%, lowered than normal group, differences were statistically significant (P<0.05). As the mass concentration reached 1 000 μmoL/L, toxicity of EDTA on fibroblast L929 reached level 2, PLE group reached level 1. Conclusions: Experiment concentration PLE and EDTA has minor toxicity on mouse fibroblast L929.

[Key words]poly-L-Lysine; ethylene diamine tetracetic acid; fibroblasts; cytotoxicity

[中圖分類號(hào)]R776.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)04-0360-03

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合OZ字(20092)]