李穎 張繼磊 程盼盼 張顥

·基礎(chǔ)研究·

As2O3介導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡的JNK磷酸化機(jī)制研究

李穎 張繼磊 程盼盼 張顥

目的探討JNK磷酸化在As2O3誘導(dǎo)的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡過程中的參與機(jī)制。方法人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY1隨機(jī)分為5組:對照組、三氧化二砷低劑量、中劑量、高劑量組及JNK阻斷劑SP600125組。對照組和三氧化二砷組細(xì)胞給予DMSO或三氧化二砷(1 Μm，5 μM和25 μM)孵育20 h。SP600125組在三氧化二砷(25 μM)孵育的同時(shí)加入SP600125(10 μM)孵育。CCK-8測定各組LY1細(xì)胞活力情況，qPCR和Western Blot分析各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase9及JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY1隨著三氧化二砷作用濃度升高而活力逐漸降低，且各組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)。qPCR和Western Blot結(jié)果顯示三氧化二砷各組細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Caspase9表達(dá)升高，而Bcl2表達(dá)降低。同時(shí)，三氧化二砷組中p-JNK1/2表達(dá)明顯增高。而SP600125組上述異常均得到部分恢復(fù)。結(jié)論JNK磷酸化過程參與了三氧化二砷誘導(dǎo)的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞凋亡過程。

三氧化二砷;彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤;LY1;細(xì)胞凋亡

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:1107～1111)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是臨床上常見的血液惡性腫瘤［1］，而彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一組在臨床特征、細(xì)胞遺傳學(xué)及免疫表型方面存在較大異質(zhì)性的惡性腫瘤［2］。三氧化二砷主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用［3］。Bax/Bcl2是一組與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。同時(shí)，細(xì)胞凋亡還與Caspase家族相關(guān)。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介導(dǎo)了多種腫瘤細(xì)胞的信號(hào)交流過程，與細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等相關(guān)［4］。本文分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2、Capsase3/9及JNK通路在As2O3誘導(dǎo)人DLBCL細(xì)胞株LY1細(xì)胞凋亡中的參

與機(jī)制，為臨床治療及相關(guān)新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1．1 試劑及儀器

熒光定量PCR儀(ABI 7700)，ABI，美國;冷凍高速離心機(jī):Eppendorf，德國;電泳儀轉(zhuǎn)印槽及PVDF膜，Bio-Rad，美國;CK40顯微鏡，奧林巴斯，日本。

DAB顯色試劑盒購自北京中山生物有限公司;高純總RNA提取試劑盒、TRIzol、氯仿購自BioTek公司，逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)購自Invitrogen，βactin及目的基因、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司。

1．2 細(xì)胞株培養(yǎng)

人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞株LY1由本單位保存。將LY1細(xì)胞株于IMDM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的LY1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3 細(xì)胞分組及藥物處理

取對數(shù)生長期的LY1細(xì)胞0．2 ml(1×105/ml)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，As2O3組分別加入As2O3溶液控制其最終濃度為1 Μm、5 μM和25 μM。SP600125組控制As2O3和SP600125的濃度分別為25 μM和10 μM。對照組加入等量的DMSO孵育20 h。

1．4 CCK-8測定細(xì)胞活力

向1．3處理后的細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入10 μL的CCK8(避光)，震蕩混勻并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板于450 nm處測定吸光度。細(xì)胞活力(%)=(A處理-A空白)/(A0處理-A空白)× 100。A處理:含細(xì)胞、As2O3和CCK8培養(yǎng)孔吸光度; A空白:含培養(yǎng)基和CCK8培養(yǎng)孔的吸光度;A0處理:含細(xì)胞和CCK8培養(yǎng)孔的吸光度。

1．5 qPCRmRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

Real-Time PCR反應(yīng)條件:95℃熱啟動(dòng)10 min;94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集熒光，共37個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1．6 Western Blot

LY1細(xì)胞在冰水浴中用裂解液充分裂解，采用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量后以等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至PVDF膜上后5%脫脂牛奶室溫條件下封閉2 h。然后與一抗4℃溫孵12 h，PBS漂洗3次后與二抗室溫反應(yīng)1 h。PVDF膜用PBS漂洗后用ECL混合液顯色、曝光、顯影、定影，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以β-actin作為參照，進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 As2O3抑制DLBCL細(xì)胞株LY1的增殖

結(jié)果發(fā)現(xiàn):LY1細(xì)胞株的細(xì)胞活力隨As2O3濃度的增高而降低，且與對照組相比，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)。而JNK抑制劑SP600125組細(xì)胞活力明顯恢復(fù)，與As2O3高劑量組細(xì)胞活力比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)，見圖1。

圖1 As2O3及其抑制劑誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞活力變化

2．2 qPCR檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，As2O3組Bax的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，且具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)水平明顯降低，也與對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)。SP600125組的上述2種mRNA的異常表達(dá)部分恢復(fù)，見圖2。

圖2 As2O3及其抑制劑誘導(dǎo)LY1細(xì)胞細(xì)胞凋亡因子Bax、Bcl2 mRNA表達(dá)的變化

2．3 Bax及Bcl2蛋白異常表達(dá)

免疫印跡顯示，As2O3組促細(xì)胞凋亡蛋白Bax和抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)變化與mRNA的變化基本一致:與對照組相比，均具有顯著差異(P＜0．01)，而JNK抑制劑SP600125可以顯著恢復(fù)上述靶點(diǎn)的異常表達(dá)(P＜0．01)，見圖3。

圖3 As2O3及其抑制劑誘導(dǎo)LY1細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Bcl2表達(dá)的變化

2．4 As2O3誘導(dǎo)p-JNK蛋白上調(diào)異常表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，As2O3組p-JNK表達(dá)水平均較對照組明顯升高(P＜0．01)，而總JNK的表達(dá)量在各組間無顯著差異性(P＞0．05)，且JNK抑制劑SP600125組比高劑量As2O3組對p-JNK表達(dá)的調(diào)控作用更明顯，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)，見圖4。

圖4 As2O3及PD600125誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞JNK及p-JNK表達(dá)的變化

2．5 Caspase9蛋白上調(diào)表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，As2O3組促細(xì)胞凋亡蛋白Caspase9的表達(dá)水平均較對照組明顯增高(P＜0．01)，且JNK抑制劑SP600125組比高劑量As2O3組的Caspase9的調(diào)控效果更明顯，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0．01)，見圖5。

圖5 As2O3及其抑制劑誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 9表達(dá)的變化

3 討論

非霍奇金淋巴瘤是惡性腫瘤中除霍奇金淋巴瘤以外的腫瘤，主要發(fā)生于淋巴結(jié)及結(jié)外淋巴組織，主要與免疫功能異常密切相關(guān)，而彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的主要種類。本研究通過As2O3與人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤LY1細(xì)胞株共孵育發(fā)現(xiàn)，As2O3可以明顯減弱LY1細(xì)胞的細(xì)胞活力，且可以明顯增高細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase9的表達(dá)，同時(shí)降低抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，即As2O3引起了LY1細(xì)胞的凋亡過程。同時(shí)，As2O3各組中JUN通路關(guān)鍵蛋白p-JNK1/2表達(dá)明顯增高，表明JNK通路的激活也參與了As2O3誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞凋亡過程。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的1種主動(dòng)的程序化的細(xì)胞死亡過程，主要有外源性和內(nèi)源性兩種信號(hào)通路。細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通路主要與線粒體功能的異常相關(guān):線粒

體除了參與細(xì)胞凋亡過程外，還是主要的能量供應(yīng)細(xì)胞器［5］。研究證實(shí)，Bcl2家族是定位于線粒體上的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。與正常對照組細(xì)胞相比，As2O3引起LY1細(xì)胞抑制凋亡因子Bcl2蛋白表達(dá)的下調(diào)，并同時(shí)誘導(dǎo)了促細(xì)胞凋亡因子Bax蛋白表達(dá)的增大，提示As2O3誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞凋亡主要通過內(nèi)源性通路，促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl2參與了該過程。Bax/Bcl2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的最重要的一組調(diào)控蛋白。Bcl2蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體膜通道孔的開關(guān)、抑制細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)來抑制細(xì)胞的凋亡過程。而Bax通常以無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)時(shí)，Bax發(fā)生構(gòu)象的變化，轉(zhuǎn)移至線粒體膜上，形成同源性二聚體狀態(tài)，干擾線粒體膜的完整性，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡過程。

Capase細(xì)胞凋亡家族也與Bax/Bcl2相關(guān):Bax蛋白增多或Bcl2蛋白降低均可誘導(dǎo)Caspase家族蛋白的激活，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［6］。本研究中As2O3誘導(dǎo)的LY1細(xì)胞凋亡過程中Capase3的mRNA及蛋白和Caspase9的蛋白表達(dá)均增高，提示Capase家族也參與了細(xì)胞凋亡的病理過程。這與本文中發(fā)現(xiàn)的Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl2表達(dá)下調(diào)結(jié)論一致。

JNK通路是MAPK通路的重要組分，介導(dǎo)了細(xì)胞的增殖、分化、生長和凋亡的過程。本研究中As2O3可以引起彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中p-JUN蛋白表達(dá)的明顯增高，而總JNK蛋白表達(dá)量在各組之間無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，即As2O3引起LY1細(xì)胞中JUN通路被激活。在其他類的腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)As2O3或其他砷類化合物引起的JNK通路的激活。因此，我們推斷，As2O3引起的細(xì)胞凋亡過程是由Bax/Bcl2及Caspase家族引起的，而JNK通路在此過程中起到了關(guān)鍵的作用。Caspase蛋白在細(xì)胞中主要以酶原的形式存在，而凋亡信號(hào)誘導(dǎo)了JUK通路的激活，并進(jìn)一步促進(jìn)Caspase酶原的降解，形成了活化形式的Caspase9，并誘導(dǎo)了LY細(xì)胞的凋亡過程。

因此，三氧化二砷可以明顯降低彌漫大B淋巴瘤的細(xì)胞活力，同時(shí)JNK磷酸化過程參與了三氧化二砷誘導(dǎo)的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞凋亡過程。

［1］賈存東，趙兵，古力克孜·吾守爾，等．大劑量BEAC方案聯(lián)合自體外周血干細(xì)胞移植治療非霍奇金淋巴瘤臨床分析〔J〕．中華腫瘤防治雜志，2013，20(21):1665-1667，1671．

［2］陸錦標(biāo)，季菊玲，李小秋，等．彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤中mTOR信號(hào)通路的激活〔J〕．腫瘤防治研究，2012，17 (11):1385-1387．

［3］高克非，馮艷玲，黃永文，等．三氧化二砷聯(lián)合塞來昔布對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用〔J〕．腫瘤，2014，9(7):602-608．

［4］傅應(yīng)亞，韓曉黎，黎友倫．抑制JNK信號(hào)通路下調(diào)A549中LRP表達(dá)可增強(qiáng)順鉑化療敏感性〔J〕．中國腫瘤臨床，2013，21(24):1518-1522．

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［6］姚峰，陳倩，陶琳，等．Caspase-3基因在肺癌中的表達(dá)及其與bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的關(guān)系〔J〕．腫瘤防治雜志，2004，3(1):4-6．

The Involvement of JNK Phosphorylation in Diffuse Large-B Cell Lymphoma Apoptosis Mediated by As2O3

LI Ying，ZHANG Jilei，CHENG Panpan，et al．Affiliated Hospital of Jining Medical College，Jining，272000

ObjectiveTo explore the participation of JNK phosphorylation in the apoptosis of diffuse large-B cell lymphoma induced by As2O3．MethodsHuman DLBCL cell line LY1 was divided into the control group，As2O3group and JNK inhibitor SP600125 group．And As2O3group were divided into the low dose，middle dose and high dose group．The control group and As2O3group were incubated with DMSO or As2O3(1 Μm，5 μM and 25 μM)for 20 h．SP600125 cells were incubated with As2O3(25 μM)and SP600125(10 μM)．The cellular viability was calculated by CCK-8 and apoptotic proteins Bax、Bcl2、Caspase9，JNK and p-JNK were detected by qPCR and Western Blot．ResultsThe viability of LY1 decreased with the increase of As2O3concentration，there had significant difference(P＜0．01)．qPCR and Western Blot showed that apoptotic proteins Bax and Caspase9 increased in As2O3group while Bcl2 decreased．p-JNK in As2O3group increased dramatically．SP600125 can alleviate the aforementioned parameters greatly．ConclusionThe apoptosis of LY1 cell line induced by As2O3is regulated by apoptotic proteins that mediated by JNK phosphorylation．

As2O3;Diffuse large-B cell lymphoma;LY1;Apoptosis

10．3969/j．issn．1001-5930．2015．08．001

R733．4

A

1001-5930(2015)08-1107-05

2014-11-05

2015-07-01)

(編輯:吳小紅)

山東省科技廳項(xiàng)目(2012YD18066);濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目(2012AA2Z3354)

272000山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科