李祥華，王學(xué)敏，徐辰俊，黃俊凱，何黎琴**，凌 勇**

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031；2南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001

NO供體型吉西他濱衍生物的設(shè)計(jì)、合成及其抗腫瘤活性*

李祥華1，王學(xué)敏2，徐辰俊2，黃俊凱1，何黎琴1**，凌 勇2**

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031；2南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001

在吉西他濱（gemcitabine）的N4位偶聯(lián)上不同的二醇取代的苯磺?；辉鄣趸铮O(shè)計(jì)合成了10個(gè)新型NO供體型吉西他濱衍生物9a～9e和10a～10e。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明，化合物9b～9d和10b～10d顯示較強(qiáng)的抗腫瘤活性，尤其化合物10c不僅對(duì)HepG2、HCT116和SW620抗增殖活性（IC50=2.44～3.57 μmol·L-1）強(qiáng)于吉西他濱（IC50=3.87～7.52 μmol· L-1），而且釋放出高濃度的NO。然而，加入NO清除劑后10c的抗腫瘤活性降低了近50%，提示NO供體型衍生物的抗腫瘤作用與NO釋放有關(guān)。

一氧化氮；苯磺?；辉?；吉西他濱；抗腫瘤活性

惡性腫瘤是當(dāng)今危害人類(lèi)健康最重要的疾病之一，近年來(lái)現(xiàn)有的抗腫瘤藥物在腫瘤治療方面仍然存在著局限性[1]。臨床上各種核苷類(lèi)藥物廣泛地應(yīng)用于癌癥的治療，其中吉西他濱是一種周期特異性抗代謝核苷類(lèi)藥物[2]，主要用于胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他實(shí)體腫瘤的治療[3-7]。然而，在臨床使用過(guò)程中存在如下缺點(diǎn)：脂溶性差、跨膜能力差；容易被脫氨酶降解失活，從而導(dǎo)致半衰期短，生物利用度低等[8]。因此，本課題組基于吉西他濱在臨床使用過(guò)程中存在的不足，設(shè)計(jì)及合成新型吉西他濱衍生物具有重要意義。

文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，吉西他濱的修飾主要是針對(duì)吉西他濱嘧啶環(huán)上的N4氨基進(jìn)行修飾，使其形成酰胺鍵。例如，口服N4位丙戊酸修飾的吉西他濱（LY2334737，見(jiàn)圖1-1）已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)，LY2334737可以避免吉西他濱進(jìn)入體內(nèi)后的快速降解，并且可以耐受胃腸道不同的酸堿環(huán)境[11-12]。吉西他濱N4氨基引入十八烷基的C18dFdC（見(jiàn)圖1-2），不僅可以避免被體內(nèi)的脫氨酶降解，而且可以改善吉西他濱在體內(nèi)代謝的生物利用度[13]。

NO作為重要的信使物質(zhì)和效應(yīng)分子在生理和病理過(guò)程扮演一個(gè)關(guān)鍵的角色[14]。文獻(xiàn)報(bào)道，高濃度的NO不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而且對(duì)化療、免疫治療、放療的腫瘤細(xì)胞更加敏感[15-16]。在NO供體型衍生物中，選擇能夠產(chǎn)生高濃度NO的苯磺?；辉鄣趸镒鳛镹O供體，不僅具有較好的親脂性，而且能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[17-19]?；谏鲜龅难芯浚瑢⒈交酋；辉酆图魉麨I通過(guò)丁二酸偶聯(lián)獲得目標(biāo)化合物9a～9e和10a～10e，期望能釋放高濃度的NO，進(jìn)一步提高吉西他濱衍生物的抗腫瘤效果。

圖1 吉西他濱衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 合成路線(xiàn)

目標(biāo)化合物9a～9e和10a～10e具體合成路線(xiàn)如圖2所示。首先5a～5e參照文獻(xiàn)合成方法[17，20]，以苯硫酚1為原料，在氫氧化鈉作用下，加入碳酸鈉和氯乙酸的混合溶液，得到白色棒狀晶體化合物2；化合物2與30%的過(guò)氧化氫反應(yīng)，以冰醋酸作為溶劑得到化合物3；然后化合物3與95%的發(fā)煙硝酸反應(yīng)，得到白色針狀晶體化合物4?；衔?與不同取代基的二醇在氫氧化鈉作用下，反應(yīng)得到化合物5a～5e；化合物5a～5e與丁二酸酐在縮合劑4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下，反應(yīng)生成化合物6a～6e；7與二碳酸二叔丁酯（Boc2O）以氫氧化鉀作為縛酸劑，反應(yīng)得到化合物8；化合物6a～6e與8在N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下得到目標(biāo)化合物9a～9e；化合物9a～9e在三氟乙酸（TFA）作用下，脫保護(hù)得到目標(biāo)化合物10a～10e。

圖2 目標(biāo)化合物9a～9e和10a～10e具體合成路線(xiàn)圖

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 化學(xué)實(shí)驗(yàn)

XT4A型熔點(diǎn)儀（北京科儀電光儀器廠(chǎng)）；Nicolet Avatar 370 DTGS型紅外光譜儀 （美國(guó) Thermo Electron公司）；Brucker AV-300型核磁共振儀（瑞士Brucker公司）；HP 1100LC/MSD質(zhì)譜儀（美國(guó)Agi-lent公司）；Elementar Vario ELⅢ型元素分析儀（德國(guó)Elementar公司）；GF254色譜硅膠 （青島海洋化工廠(chǎng)）；試劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品。吉西他濱（連云港金康醫(yī)藥科技有限公司，純度大于98%）。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）乙氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6a）

將5a（0.29g，1.00mmol）、DMAP（0.06g，0.50mmol）及1，4-丁二酸酐（0.12 g，1.20 mmol）加入50 mL圓底燒瓶，以二氯甲烷為溶劑，加畢，油浴回流反應(yīng)。反應(yīng)5 h后薄層色譜（TLC）檢測(cè)(乙酸乙酯-石油醚，4∶1）反應(yīng)完全。停止攪拌，室溫冷卻后將反應(yīng)液傾入50 mL水中，二氯甲烷（3×30 mL）萃取，合并有機(jī)層并用飽和氯化鈉水洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到淡黃色固體，產(chǎn)率90.0%。MS（ESI）m/z 387[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）丙氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6b）

參照6a的合成方法，5b代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應(yīng)最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率92.0%。MS（ESI）m/z 401[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）丁氧基）-3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6c）

參照6a的合成方法，5c代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應(yīng)最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率88.0%。MS（ESI）m/z 415[M+H]+。

4-（（4-（（3-羧基丙）氧基）丁-2-基）氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6d）

參照6a的合成方法，5d代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應(yīng)最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率85.0%。MS（ESI）m/z 415[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）戊氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6e）

參照6a的合成方法，5e代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應(yīng)最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率91.5%。MS（ESI）m/z 429[M+H]+。

4-氨基-1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）嘧啶-2-（1H）-酮（8）

將7（2.63 g，10.00 mmol）溶于2 mol·L-1KOH（80 mL）中，冰浴條件下進(jìn)行攪拌，將 Boc2O（10.90 g，50.00 mmol）溶于四氫呋喃（80 mL）中，N2保護(hù)下將其緩慢滴加至7的混合溶液中，滴加完畢，撤除冰浴恢復(fù)室溫反應(yīng)2 h，減壓蒸出四氫呋喃，并將其傾入200 mL水中，乙酸乙酯（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)層制砂過(guò)柱純化（二氯甲烷-甲醇，50∶1～20∶1），得到白色固體，產(chǎn)率88.6%。MS（ESI）m/z 464[M+H]+。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）乙氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9a）

將 6a（0.19 g，0.50 mmol）、NHS（0.07 g，0.60 mmol）、EDCI（0.12 g，0.60 mmol）、DMAP（0.01 g，0.10 mmol）加入50 mL圓底燒瓶，以無(wú)水CH2Cl2為溶劑加畢，常溫條件下N2保護(hù)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)2 h后TLC檢測(cè)（石油醚-乙酸乙酯，1∶4）反應(yīng)完全。將8（0.25 g，0.50 mmol）在N2保護(hù)下緩慢加入反應(yīng)液中，常溫條件下進(jìn)行反應(yīng)18 h后，TLC檢測(cè) （石油醚-乙酸乙酯，1∶1）反應(yīng)完全。停止攪拌，后將反應(yīng)液傾入50 mL水中，二氯甲烷（3×30 mL）萃取，合并有機(jī)層制砂過(guò)柱純化（石油醚-乙酸乙酯，5∶1～1∶1），得淡黃色固體，產(chǎn)率52.0%。IR（KBr，cm-1）：3460，2929，2848，1663，1619，1552，1447，1162；mp：142～145℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.18（s，1H，NH），8.20（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.00（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.73（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.21（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.22（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），5.76（m，1H，NCH），5.31（m，1H，OCH），4.59（m，2H，OCH2），4.40（m，2H，OCH2），3.98（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2O），3.65（m，1H，CH2O），2.74（m，2H，OCCH2），2.63（m，2H，OCCH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 832[M+H]+；C33H39F2N5O16S元素分析，理論值：C，47.65；H，4.73；N，8.42；實(shí)測(cè)值：C，47.50；H，4.87；N，8.30。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┍趸?3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9b）

參照 9a的合成方法，6b代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率57.0%。IR（KBr，cm-1）：3487，2925，2833，1661，1618，1562，1448，1160；mp：158～160℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.16（s，1H，NH），8.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.09（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.82（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.36（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.18（m，1H，NCH），5.37（m，1H，OCH），4.42（m，2H，OCH2），4.09（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.83（m，1H，CH2O），3.60（m，1H，CH2O），2.67（m，2H，OCCH2），2.58（m，2H，OCCH2），2.16（m，2H，CH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 846[M+H]+；C34H41F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.28；H，4.89；N，8.28；實(shí)測(cè)值：C，48.39；H，5.02；N，8.12。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）丁氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9c）

參照 9a的合成方法，6c代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率51.0%。IR（KBr，cm-1）：3400，2939，2874，1698，1622， 1557，1453，1161；mp：165～166℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.17（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.06（d，J=7.5 Hz，1H，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.27（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.35（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.19（m，1H，NCH），5.36（m，1H，OCH），4.47（m，2H，OCH2），4.06（m，2H，OCH2），3.88（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2O），3.64（m，1H，CH2O），2.74（m，2H，OCCH2），2.61（m，2H，OCCH2），1.82（m，2H，CH2），1.67（m，2H，CH2），1.28（s，18H，6× CH3）；MS（ESI）m/z 860[M+H]+；C35H43F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.89；H，5.04；N，8.15；實(shí)測(cè)值：C，48.72；H，5.19；N，8.03。

4-（（4-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）丁-2-基）氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9d）

參照9a的合成方法，6d代替6a與NHS、DMAP、EDCI及8反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率53.0%。IR（KBr，cm-1）：3450，2928，2852，1664，1613，1496，1448，1150；mp：144～146℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.29（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，J=7.5Hz，1H，CH=CHN），7.87（t，1H，J=7.5Hz，Ar-H），7.29（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.16（m，1H，NCH），5.39（m，1H，OCH），4.37（m，2H，OCH2），4.02（m，1H，OCH），3.87（m，1H，OCH），3.79（m，1H，CH2O），3.62（m，1H，CH2O），2.79（m，2H，OCCH2），2.59（m，2H，OCCH2），1.87（m，2H，CH2），1.29（s，18H，6×CH3），1.22（m，3H，CH3）；MS（ESI）m/z 860 [M+H]+；C35H43F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.89；H，5.04；N，8.15；實(shí)測(cè)值：C，48.72；H，5.22；N，8.01。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）-5-（（（叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）戊氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9e）

參照 9a的合成方法，6f代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率59.0%。IR（KBr，cm-1）：3469，2922，2853，1677，1615，1551，1447，1165；mp：172～174℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.36（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.18（m，1H，NCH），5.34（m，1H，OCH），4.49（m，2H，OCH2），4.12（m，2H，OCH2），3.87（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2O），3.68（m，1H，CH2O），2.79（m，2H，OCCH2），2.56（m，2H，OCCH2），1.82（m，2H，CH2），1.64（m，2H，CH2），1.53（m，2H，CH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 874[M+H]+；C26H29F2N5O12S元素分析，理論值：C，49.48；H，5.19；N，8.01；實(shí)測(cè)值：C，49.26；H，5.38；N，7.90。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┮已趸?3-(苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10a）

將9a（0.20 g，0.23 mmol）溶于5 mL無(wú)水二氯甲烷溶液中，緩慢滴加0.5 mL TFA，冰浴條件下反應(yīng)0.5 h，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)反應(yīng)完全，減壓蒸出反應(yīng)液溶劑，粗品通過(guò)柱層析純化（二氯甲烷-甲醇，50∶1～20∶1）得到淡黃色固體，產(chǎn)率86.7%。IR（KBr，cm-1）：3465，2927，2844，1662，1617，1558，1445，1160；mp：172～175℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.10（s，1H，NH），8.24（d，2H，J=7.5Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.90（t，1H，Ar-H），7.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.13（m，1H，NCH），5.33（m，1H，HOCH），4.48（m，2H，OCH2），4.42（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.65（m，1H，CH2OH），2.78（m，2H，OCCH2），2.58（m，2H，OCCH2）；MS（ESI）m/z 632[M+H]+；C23H23F2N5O12S元素分析，理論值：C，43.74；H，3.67；N，11.09；實(shí)測(cè)值：C，43.53；H，3.77；N，11.21。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┍趸?3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10b）

參照10a的合成方法，9b代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率82.8%。IR（KBr，cm-1）：3481，2927，2830，1663，1616，1560，1444，1160；mp：182～185℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.18（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.07（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5Hz，Ar-H），7.29（d，2H，J=7.5Hz，Ar-H），6.32（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.16（m，1H，NCH），5.30（m，1H，HOCH），4.43（m，2H，OCH2），4.06（m，2H，OCH2），3.88（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2OH），3.61（m，1H，CH2OH），2.68（m，2H，OCCH2），2.56（m，2H，OCCH2），2.11 （m，2H，CH2）；MS （ESI）m/z 646[M+H]+；C24H25F2N5O12S元素分析，理論值：C，44.65；H，3.90；N，10.85；實(shí)測(cè)值：C，44.38；H，4.08；N，11.00。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┒⊙趸?3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10c）

參照10a的合成方法，9c代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率81.6%。IR（KBr，cm-1）：3407，2934，2876，1696，1624，1559，1454，1165；mp：205～208℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.23（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.89（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.23（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.33（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.17（m，1H，NCH），5.31（m，1H，HOCH），4.41（m，2H，OCH2），4.08（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.65（m，1H，CH2OH），2.72（m，2H，OCCH2），2.60（m，2H，OCCH2），1.80（m，2H，CH2），1.68（m，2H，CH2）；MS（ESI）m/z 660[M+H]+；C25H27F2N5O12S元素分析，理論值：C，45.52；H，4.13；N，10.62；實(shí)測(cè)值：C，45.29；H，4.28；N，10.80。

4-（（4-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┒?2-基）氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10d）

參照10a的合成方法，9d代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率86.3%。IR（KBr，cm-1）：3455，2927，2856，1668，1614，1499，1444，1152；mp：195～197℃；1H NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.16（s，1H，NH），8.27（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.04（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.86（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.28（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.39（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.12（m，1H，NCH），5.36（m，1H，HOCH），4.38（m，2H，OCH2），4.00（m，1H，OCH），3.83（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.67（m，1H，CH2OH），2.77（m，2H，OCCH2），2.57（m，2H，OCCH2），1.89（m，2H，CH2），1.21（m，3H，CH3）；MS（ESI）m/z 660[M+H]+；C25H27F2N5O12S元素分析，理論值：C，45.52；H，4.13；N，10.62；實(shí)測(cè)值：C，45.79；H，4.27；N，10.82。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┪煅趸?3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10e）

參照10a的合成方法，9e代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應(yīng)，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率77.8%。IR（KBr，cm-1）：3466，2929，2858，1672，1618，1552，1447，1162；mp：218～220℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.11（s，1H，NH），8.25（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.03（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.87（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.19（m，1H，NCH），5.32（m，1H，HOCH），4.47（m，2H，OCH2），4.11（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2OH），3.66（m，1H，CH2OH），2.78（m，2H，OCCH2），2.55（m，2H，OCCH2），1.83（m，2H，CH2），1.62（m，2H，CH2），1.52（m，2H，CH2）；MS（ESI）m/z 674[M+H]+；C26H29F2N5O12S元素分析，理論值：C，46.36；H，4.34；N，10.40； 實(shí)測(cè)值：C，46.11；H，4.42；N，10.58。

2.2 藥理活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 MTT法 參照ATCC（American Type Cul-true Collection）相關(guān)說(shuō)明，將含每孔2×104～4×104個(gè)人源腫瘤細(xì)胞株包括人肝癌細(xì)胞（HepG2），人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116，SW620），人胃癌細(xì)胞（SGC7901），所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清，青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 U·mL-1的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中，過(guò)夜。加入含有不同濃度的受試化合物，吉西他濱作為陽(yáng)性對(duì)照藥，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。加入5 mg·mL-1噻唑藍(lán)（MTT）溶液于96孔板中的細(xì)胞孔中，每孔30 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清液，加150 μL/孔二甲亞砜（DMSO），平板搖床上振搖10 min。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定每孔的吸光度，分別計(jì)算各濃度下的細(xì)胞抑制率。用LOGIT法（Graph Pad Prism Version 4.03軟件）計(jì)算受試化合物IC50。

2.2.2 體外NO釋放實(shí)驗(yàn) 參照NO試劑盒相關(guān)說(shuō)明，采用Griess重氮化反應(yīng)法測(cè)試了目標(biāo)化合物NO的釋放量[21]。HepG2和HCT116細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程參照“2.2.1”的實(shí)驗(yàn)方法。受試化合物用DMSO溶解后用PBS稀釋?zhuān)茉囄餄舛葹?0-4mol·L-1。按50 μL/孔，在96孔板中加入樣品。于300 min時(shí)間點(diǎn)離心沉淀取上清液，在各孔中加入Griess試劑，室溫放置10 min，在540 nm處測(cè)吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算NO濃度。NO的釋放量以其相當(dāng)于硝酸鹽（NO3-）/亞硝酸鹽（NO2-）的量表示。

2.2.3 NO清除劑阻滯實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程參照“2.2.1”的實(shí)驗(yàn)方法，受試化合物所選濃度為5、10 μmol·L-1。Hemoglobin相對(duì)于受試化合物提前1 h加入培養(yǎng)基中，且分別采用 0、1、5、10 μmol·L-1Hemoglobin未見(jiàn)顯著的細(xì)胞毒性。受試化合物處理48 h后，檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物9a～9e和10a～10e體外細(xì)胞增殖抑制活性

通過(guò)MTT法測(cè)試化合物9a～9e和10a～10e對(duì)4種人癌細(xì)胞 系 HepG2、HCT116、SGC7901和SW620抑制活性，以吉西他濱作為陽(yáng)性對(duì)照。如表1所示，化合物9b～9d和10b～10d顯示較強(qiáng)的抗腫瘤活性，尤其目標(biāo)物10c對(duì)HepG2、HCT116和SW620抗腫瘤活性（IC50=2.44～3.57 μmol·L-1）強(qiáng)于吉西他濱（IC50=3.87～7.52 μmol·L-1）。

表1 化合物9a～e和10a～e體外細(xì)胞增殖抑制活性

3.2 化合物9b～9d和10b～10e體外NO釋放檢測(cè)

為考察NO供體型衍生物的NO釋放與其抗腫瘤活性之間的關(guān)聯(lián)，選擇9b～9d、10b～10e和吉西他濱測(cè)定了它們的體外NO釋放，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性最強(qiáng)化合物10c的NO釋放量最大，在300 min時(shí)達(dá)到最大值28.6 μmol·L-1；而細(xì)胞毒性相對(duì)較弱的化合物9b～9d、10e的NO釋放量較低。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[22]的高濃度NO對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞毒作用的結(jié)論是一致的。

圖3 NO供體型衍生物9b～9d和10a～10e體外NO釋放檢測(cè)

3.3 NO清除劑對(duì)NO供體型吉西他濱衍生物10c活性的阻滯作用

為了進(jìn)一步闡明化合物10c細(xì)胞毒性與NO釋放的相關(guān)性，考察了NO釋放較高的10c其N(xiāo)O釋放水平與抑制HepG2細(xì)胞之間的關(guān)系。如圖4所示，選取5、10 μmol·L-1的10c在細(xì)胞培液中加入不同濃度 0、1、5、10 μmol·L-1的 NO清除劑 Ho-moglobin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Homoglobin能劑量依賴(lài)性地促使目標(biāo)物10c的細(xì)胞抑制率下降，在Homoglobin最大劑量下能夠使得10c的抗腫瘤活性降低50%，提示NO供體型衍生物的抗腫瘤作用與NO釋放有關(guān)。

圖4 Homoglobin對(duì)NO供體型吉西他濱衍生物10c活性抑制

3.4 構(gòu)效關(guān)系研究

根據(jù) NO供體型吉西他濱衍生物 9a～9e和10a～10e抗腫瘤活性發(fā)現(xiàn)，連接鏈的長(zhǎng)短和Boc基團(tuán)對(duì)偶聯(lián)物的抗腫瘤活性有較大影響。例如，在不同鏈長(zhǎng)的二醇化合物中，發(fā)現(xiàn)鏈長(zhǎng)為3～4個(gè)碳鏈較其它長(zhǎng)度的連接片段具有更強(qiáng)的體外抗腫瘤活性；此外，發(fā)現(xiàn)脫保護(hù)的化合物10a～e的體外抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于未脫保護(hù)的化合物9a～9e。

4 小 結(jié)

本研究設(shè)計(jì)合成了一系列NO供體型吉西他濱衍生物9a～9e和10a～10e，體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，大部分化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，尤其是化合物10c不僅展現(xiàn)抗增殖活性強(qiáng)于吉西他濱，而且能釋放高濃度的NO。NO清除劑hemoglobin能夠明顯降低了10c對(duì)HepG2細(xì)胞近50%的抑制率，表明NO供體型衍生物發(fā)揮體外抗腫瘤活性與高濃度的NO釋放密切相關(guān)。

[1] Jordheim LP,Durantel D,Zoulim F,et al.Advances in the development of nucleoside and nucleotide analogues for cancer and viral diseases[J].Nat Rev Drug Discov, 2013,12(6):447-64.

[2] Hertel LW,Kroin JS,Misner JW,et al.Synthesis of 2-Deoxy-2,2-difluoro-D-ribose and 2-Deoxy-2,2-diflu-oro-D-ribofuranosyl Nucleosides[J].J Org Chem,1988, 53(11):2406-9.

[3] Manegold C.Gemcitabine (Gemzar)in non-small cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther,2004,4(3): 345-60.

[4] Heinemann V.Gemcitabine in metastatic breast cancer [J].Expert Rev Anticancer Ther,2005,5(3):429-43.

[5] Carmichael J,Fink U,Russell RC,et al.PhaseⅡ study of gemcitabine in patients with advanced pancre-atic cancer[J].Br J Cancer,1996,73(1):101-5.

[6] Ozols RF.Gemcitabine and carboplatin in second-line ovarian cancer[J].Semin Oncol,2005,32(1):S4-8.

[7] Khaled HM,Shafik HE,Zabhloul MS,et al.Gemc-itabine and cisplatin as neoadjuvant chemotherapy for invasive transitional and squamous cell carcinoma of the bladder:effect on survival and bladder preservation [J].Clin Genitourin Cancer,2014,12(1):e233-40.

[8] Moysan E,Basttiat G,Benoit JP.Gemcitabine versus Modified Gemcitabine:a review of several promising chemical modifications[J].Mol Pharm,2013,10(1): 430-44.

[9] Han HK,Amidon GL.Targeted prodrug design to opti-mize drug delivery[J].AAPS Pharm Sci,2000,2(1):E6.

[10] Stella VJ.Prodrugs:Some thoughts and current issues [J].J Pharm Sci,2010,99(12):4755-5.

[11] Pratt SE,Durland-Busbice S,Shepard RL,et al.Hu-man carboxylesterase-2 hydrolyzes the prodrug of gemcitabine (LY2334737)and confers prodrug sensi-tivity to cancer cells[J].Clin Cancer Res,2013,19 (12):1159-68.

[12] Wickremsinhe E,Bao J,Smith R,et al.Preclinical absorption,distribution,metabolism,and excretion of an oral amide prodrug of gemcitabine designed to de-liver prolonged systemic exposure[J].Pharmaceutics, 2013,5(2):261-76.

[13] Gupta A,Asthana S,Konwar R,et al.An insight into potentialofnanoparticles-assisted chemotherapy of cancer using gemcitabine and its fatty acid prodrug:a comparative study[J].J Biomed Nanotechnol,2013,9 (5):915-25.

[14] Fukumura D,Kashiwagi S,Jain RK.The role of nitric oxide in tumour progression[J].Nat Rev Cancer,2006, 6(7):521-34.

[15] Bonavida B,Baritaki S,Huerta-Yepez S,et al.Novel therapeutic applications of nitric oxide donors in can-cer:roles in chemo- and immunosensitization to apoptosis and inhibition of metastases[J].Nitric Oxide, 2008,19(7):152-7.

[16] Hirst D,Robson T.Targeting nitric oxide for cancer therapy[J].J Pharm Pharmacol,2007,59(1):3-13.

[17] Ling Y,Ye X,Zhang Z,et al.Novel nitric oxide-re-leasing derivatives of farnesylthiosalicylic acid:synthe-sis and evaluation of antihepatocellular carcinoma ac-tivity[J].J Med Chem,2011,54(1):3251-9.

[18] Maksimovic-Ivanic D,Mijatovic S,Harhaji L,et al. Anticancer properties of the novel nitric oxide-donat-ing compound(S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxazoleacetic acid-nitric oxide in vitro and in vivo[J].Mol Cancer Ther,2008,7(3):510-20.

[19] Huang Z,Zhang Y,Zhao L,et al.Synthesis and an-ti-human hepatocellular carcinoma activity of new ni-tric oxide-releasing glycosyl derivatives of oleanolic acid[J].Org Biomol Chem,2010,8(3):632-9.

[20] Chen L,Zhang Y,Kong X,et al.Design,synthesis, and antihepatocellular carcinoma activity of nitric ox-ide releasing derivatives of oleanolic acid[J].J Med Chem,2008,51(15):4834-8.

[21] Tarpey MM,Fridovich I.Methods of detection of vas-cular reactive species nitric oxide,superoxide,hydro-gen peroxide,and peroxynitrite[J].Circ Res,2001,89 (3):224-36.

[22] Megson IL,Webb DJ.Nitric oxide donor drugs:cur-rent status and future trends[J].Expert Opin Investig Drugs,2002,11(5):587-601.

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2015年3月美國(guó)FDA公布的藥品安全信息

1 FDA要求限制睪酮藥物的使用，警惕其心血管風(fēng)險(xiǎn)

FDA認(rèn)為，睪酮治療對(duì)于年齡相關(guān)的低睪酮水平男性并不合適，因?yàn)樗赡芘c心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

FDA當(dāng)局要求修改所有睪酮類(lèi)產(chǎn)品的藥品標(biāo)簽，明確它們的合理使用范圍。FDA同時(shí)警告稱(chēng)“任何使用這種激素的患者都存在心臟病發(fā)作和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)增加的可能性”。睪酮僅被批準(zhǔn)用于特殊疾病狀況的男性，但現(xiàn)在這類(lèi)療法被超標(biāo)簽地用于年齡相關(guān)的低睪酮水平男性患者中已是一種普遍情況。

低睪酮（low testosterone）即“Low T”處方量在過(guò)去10年來(lái)猛漲，這主要是由于與年齡增長(zhǎng)相關(guān)的低睪酮水平中年男性對(duì)這類(lèi)處方藥使用量的增加所致。隨著年齡增長(zhǎng)，睪丸功能減退，導(dǎo)致男性睪酮水平逐漸下降。低睪酮的癥狀包括性欲減退、肌肉質(zhì)量下降、疲勞及抑郁。

根據(jù)FDA公布的數(shù)據(jù)，從2009至2013年，處方睪酮藥物的男性患者數(shù)量激增75%至230萬(wàn)例，其中70%患者年齡在40～64歲之間。FDA此次發(fā)布的條令，將禁止制藥商在年齡相關(guān)性低睪酮群體中營(yíng)銷(xiāo)或推廣其產(chǎn)品。

根據(jù)從研究和FDA顧問(wèn)委員會(huì)所獲得的證據(jù)，F(xiàn)DA認(rèn)為使用睪酮類(lèi)產(chǎn)品可能會(huì)增加心血管風(fēng)險(xiǎn)。這些研究包括了老年男性使用睪酮治療。有些研究認(rèn)為使用睪酮治療會(huì)增加心臟病、中風(fēng)或死亡的風(fēng)險(xiǎn)，但也有些研究報(bào)告不這樣認(rèn)為。具體細(xì)節(jié)可查閱《FDA安全通告》的資料匯總。

FDA僅批準(zhǔn)睪酮類(lèi)藥品用于替代治療因睪丸、腦垂體或腦部疾病引起性腺機(jī)能減退而導(dǎo)致的睪酮水平低下。但該藥品的實(shí)際使用范圍被擴(kuò)大為緩解因年齡因素導(dǎo)致睪酮水平降低而產(chǎn)生的癥狀——而這種用法的效益和安全性還有待研究。

FDA建議醫(yī)療專(zhuān)業(yè)人員僅對(duì)由于疾病因素導(dǎo)致的、并且經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查確定的睪酮水平低下的男性患者使用睪酮類(lèi)產(chǎn)品。在決定開(kāi)始或繼續(xù)使用睪酮類(lèi)產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)讓患者知道可能會(huì)增加心血管風(fēng)險(xiǎn)?；颊咴谑褂迷擃?lèi)產(chǎn)品后出現(xiàn)心臟病或中風(fēng)的癥狀時(shí)應(yīng)立即就醫(yī)，如：胸痛、呼吸急促或呼吸困難、身體部分或一側(cè)無(wú)力，或口齒不清。

2 戒必適（瓦倫尼克林，Chantix）或與癲癇和降低酒精耐受性相關(guān)

FDA發(fā)出警示，憑處方銷(xiāo)售的戒煙藥戒必適（瓦倫尼克林）可能會(huì)改變使用者對(duì)酒精的耐受性。戒必適與酒精的相互作用會(huì)導(dǎo)致一些人醉酒加重，有時(shí)會(huì)伴有攻擊性行為和（或）健忘。另外，有報(bào)道稱(chēng)極少數(shù)患者在使用戒必適治療時(shí)出現(xiàn)癲癇。FDA已要求戒必適修改標(biāo)簽，加入上述風(fēng)險(xiǎn)的警告內(nèi)容。

戒必適是FDA批準(zhǔn)用于幫助成人戒煙的處方藥。該藥由美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)，于2006年被FDA批準(zhǔn)上市。此前，F(xiàn)DA已要求廠(chǎng)家更新過(guò)標(biāo)簽說(shuō)明，并附帶了一份黑框警告說(shuō)明，突出說(shuō)明了該藥物對(duì)神經(jīng)、精神方面的潛在副作用，包括自殺念頭、攻擊性和焦慮。

醫(yī)療專(zhuān)業(yè)人員在給患者使用戒必適之前，應(yīng)權(quán)衡癲癇的風(fēng)險(xiǎn)和潛在的收益，尤其對(duì)有癲癇史或其他因素可能降低癲癇發(fā)作閾的患者。應(yīng)告知患者在使用戒必適期間感覺(jué)煩亂、產(chǎn)生敵意、有攻擊性行為，情緒低落、行為或想法與往常不同、有自殺的想法或行為時(shí)需立即停藥。

除非清楚戒必適對(duì)其酒精耐受的影響程度，患者都應(yīng)該減少酒精的攝入量。當(dāng)患者使用戒必適期間發(fā)生癲癇，應(yīng)立即停藥并進(jìn)行治療。

（由江蘇省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心提供）

Synthesis and Biological Evaluation of Nitric Oxide-releasing Hybrids of Gemcitabine and Phenylsulfonyl Furoxans as Anti-tumor Agents*

LI Xiang-hua1,WANG Xue-min2,XU Chen-jun2, HUANG Jun-kai1,HE Li-qin1**,LING Yong2*
1Anhui Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine,Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031,China;2School of Pharmacy,Nan-tong University,Nantong,226001,PR China

A series of novel gemcitabine derivatives 9a-9e and 10a-10e were designed and synthesized by coupling phenylsulfonyl furoxans with gemcitabine through various diol linkers,and their biological activities were evaluated in vitro. Compounds 9b-9d and 10b-10d exhibited more potentanticanceractivities.Especially,compound 10c showed excellentanti-proliferative activities (IC50=2.44-3.57 μmol·L-1)which were better than gemcitabine(IC50=3.87-7.52 μmol·L-1).However,the inhibitory rates of 10c partially reduced by pretreatment with hemoglobin,demonstrating that their anticancer activities were associated with their NO release.

Nitric oxide;Phenylsulfonyl furox-ans;Gemcitabine;Anti-tumor activity

R914.5；R979.1

A

1673-7806（2015）02-097-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81302628）；安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（No.KJ2013A168）；江蘇省自然科學(xué)基金（No.BK2011389）

李祥華，男，碩士生 E-mail:lixianghua28@yeah.net

**通訊作者何黎琴，女，教授 E-mail:Hlq661125@126.com凌勇，男，副教授 E-mail:lyyy111@sina.com

2015-03-02

2015-03-20