周志華趙宗保牛國清（ 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室，上海 000； 中國科學(xué)院大連物理化學(xué)研究所，大連60； 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 000）

新功能生物元器件的篩選、設(shè)計與功能鑒定

周志華1趙宗保2牛國清3
（1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室，上海 200032；2 中國科學(xué)院大連物理化學(xué)研究所，大連
116023；3 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

周志華，上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所研究員，課題組長。研究方向：活性萜類化合物的合成途徑及其關(guān)鍵生物元件的解析與功能鑒定；重要萜類天然化合物于真菌底盤細胞中的異源合成與途徑優(yōu)化；真菌底盤細胞的基因組編輯及適配性優(yōu)化。

E-mail:zhouzhihua@sippe.ac.cn

作者簡介

趙宗保，研究員，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部副主任。主要從事能源生物技術(shù)和化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的探索性、前瞻性研究和技術(shù)創(chuàng)新。

E-mail:zhaozb@dicp.ac.cn

作者簡介

牛國清，博士，中國科學(xué)院微生物研究所副研究員。研究方向為微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成與調(diào)控。

E-mail:Niugq@im.ac.cn發(fā)展在環(huán)境、資源、能源等方面面臨的若干重大挑戰(zhàn)提供新技術(shù)與方法 。合成生物學(xué)旨在將工程原理應(yīng)用到生物系統(tǒng)來改變生物技術(shù) 。在短短不到十年的時間里，合成生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生了很多技術(shù)應(yīng)用，為藥品生產(chǎn) 、生物基產(chǎn)品的生產(chǎn) 和基因治療 提供了新的途徑。

生物元件或器件、裝置和系統(tǒng)是合成生物學(xué)的三大基本要素。生物元件是指遺傳系統(tǒng)中最簡單、最基本的生物積塊（BioBrick），是具有特定功能的氨基酸或者核苷酸序列，可以在更大規(guī)模的設(shè)計中與其他元件進一步組合成具有特定生物學(xué)功能的生物學(xué)裝置（Device） 。2003年，美國麻省理工大學(xué)相關(guān)合成生物學(xué)實驗室就成立了標準生物元件登記庫（Registry of Standard Biological Parts）（http://partsregistry.org/），專門收集各種滿足標準化條件的生物元件。全世界的科學(xué)家都可以提交自己設(shè)計的模塊供其他人獲取，以設(shè)計更加復(fù)雜的系統(tǒng)。目前標準生物元件登記庫有15 000多個生物元件（http://partsregistry.org/cgi/ partsdb/Statistics.cgi），既包括啟動子、轉(zhuǎn)錄單元、質(zhì)粒骨架、接合轉(zhuǎn)移元件、轉(zhuǎn)座子、蛋白質(zhì)編碼區(qū)等DNA序列，也包括核糖體綁定位點和終止子等RNA序列以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。標準生物元件登記庫中，每一個生物學(xué)元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點（RBS）都以載體形式保存。

雖然越來越多的生物元件被發(fā)現(xiàn)，但很多生物元件都沒有被詳細定性。如標準生物元件庫中的元件大部分是由iGEM參賽者提供的，其中很多都沒有經(jīng)過系統(tǒng)的定性，也無法保證品質(zhì)。生物元件的性能會隨不同的底盤細胞類型、不同的實驗條件而改變，而不是總表現(xiàn)相同的功能，且發(fā)揮功能的時間也不總是相同的 。2010年12月12日，在夏威夷舉行的生物技術(shù)工業(yè)組織環(huán)太平洋地區(qū)會議上，合成生物學(xué)工程研究中心的創(chuàng)建人Drew Endy和Vivek Mutalik發(fā)起了國際發(fā)展生物技術(shù)開放基金，由美國國家自然基金（NSF）、勞倫斯伯克利國家實驗室（LBNL）和生物磚基金（BBF）聯(lián)合支持，用于開發(fā)新的生物元件并對已經(jīng)存在的元件進行詳細定性描述。Drew Endy、Vivek Mutalik以及生物磚基金的執(zhí)行主席Holly Million強調(diào)該開放基金的目的是開發(fā)可免費使用的標準DNA元件，推動合成生物學(xué)的研究進程，縮短研發(fā)周期并降低研發(fā)成本。

為了使合成生物學(xué)像其他工程學(xué)設(shè)計那樣，可以在電腦幫助的模擬設(shè)計下構(gòu)建新的生物系統(tǒng)，英國學(xué)者創(chuàng)建了一個標準虛擬生物元件庫（SVPs） ，為合成生物學(xué)提供模塊化建模元件庫。華盛頓大學(xué)的研究者創(chuàng)建了一個標準生物元件知識庫（SBPkb），查詢和檢索生物元件用于合成生物學(xué)研究和應(yīng)用 。SBPkb將標準生物元件知識庫中所有元件的信息轉(zhuǎn)換成可以利用合成生物學(xué)元件語義框架進行運算的信息。該框架稱作為合成生物學(xué)公開語言語義（SBOL-semantic），是合成生物學(xué)公開語言的一部分，用于描述通用的合成生物學(xué)實體，其目的是提高所有生物元件的分散和交換。

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與自然界巨大的生物元件資源相比，MIT標準生物學(xué)元件登記庫中的現(xiàn)有庫存僅僅是滄海一粟?，F(xiàn)階段如何鑒定與建立更多的通用性生物元件依然是合成生物學(xué)的重要任務(wù) 。2010年，我國“973”計劃啟動合成生物學(xué)重大項目，“新功能人造生物器件的構(gòu)建與集成”、“抗逆元器件構(gòu)建和機理研究”和“生物固氮與抗逆模塊的人工設(shè)計與優(yōu)化”等項目關(guān)注生物元器件的設(shè)計、構(gòu)建與改造。生物元件可以從自然界分離出來，也可以對天然生物元件進行修飾、重組和改造后獲得具有新功能的生物元器件。

1 新功能元器件的篩選與功能鑒定

1.1 基于基因組或轉(zhuǎn)錄組信息挖掘與功能鑒定生物元器件

生物元件主要來源于自然界，因此從自然界中分離是獲得生物元件的主要途徑之一。以植物重要次生代謝產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵生物元件的篩選與功能鑒定為例，雖然合成生物學(xué)的核心在于設(shè)計，但是對于結(jié)構(gòu)多樣而合成途徑未知的天然化合物，合成途徑的設(shè)計還需要向自然界學(xué)習，從其在自然界中的生物合成途徑中獲得啟發(fā)。在大規(guī)模基因組測序前，從自然界中分離生物元件主要是運用傳統(tǒng)的分子克隆方法或基于保守序列的PCR方法。

近十年來，隨著DNA測序技術(shù)效率的提高與成本的大幅下降，越來越多可生產(chǎn)重要天然產(chǎn)物的植物或微生物的基

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基于人參cDNA數(shù)據(jù)的分析，韓國與日本科學(xué)家首先于2006年克隆并鑒定了達瑪稀二醇合酶（DDS） ，2011年韓國科學(xué)家克隆與鑒定細胞色素P450 （CYP716A47）是催化達瑪稀二醇轉(zhuǎn)化為原人參二醇（PPD）的關(guān)鍵酶 ，2012年又進一步鑒定了催化原人參二醇產(chǎn)生原人參三醇（PPT）的細胞色素P450（CYP716A53v2） ，但這些細胞色素P450的還原酶以及將PPD和PPT轉(zhuǎn)化為人參皂苷的糖基轉(zhuǎn)移酶尚沒有被報道。雖然國內(nèi)外研究機構(gòu)已經(jīng)公開了13個人參屬植物（包括人參、西洋參和三七）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但由于采用第二代測序技術(shù)（如solexa），獲得的讀長為80～150bp，傳統(tǒng)的方法僅能拼接到少數(shù)的基因全長序列。中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室 采用短reads的優(yōu)化拼接方法，大大提高了拼接基因的序列長度及完整ORF的比例。從人參屬植物的cDNA數(shù)據(jù)的重拼接數(shù)據(jù)中，獲得512個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（長度＞1000bp），并通過設(shè)計引物從人參cDNA樣品中克隆了其中80多個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因。同樣的方法，還克隆了2個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）-細胞色素P450還原酶，功能鑒定表明這2個細胞色素P450還原酶與CYP716A47或/和CYP716A53v2可以高效地催化DM或/和PPD的羥基化反應(yīng)（PCT/CN2015/073550）。

圖1 基于人參UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選與鑒定確定了人參皂苷CK兩條潛在合成途徑

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筆者實驗室表達了從人參中克隆得到的80多個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因并獲得了65個表達產(chǎn)物（UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的初提物），確定了其中20個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶在糖基供體UDP-葡萄糖存在的條件下對已知的人參皂苷前體或皂苷具有轉(zhuǎn)糖基催化作用～（PCT/ CN2013/088819），其他UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的底物（糖基受體）與糖基供體還有待進一步研究。對這20個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特性進行分析后，發(fā)現(xiàn)這些糖基轉(zhuǎn)移酶具有較強位點（或空間）特異性～（圖1）。

UGTPg1和UGTPg45分別特異性催化原人參二醇及其皂苷的C-20S、C-3位的羥基糖基化 ，UGTPg100特異性催化原人參三醇及其皂苷的C-6位的羥基糖基化 ，UGTPg29則可以進一步在Rh2的3位糖基上再延伸一個葡萄糖基生成人參皂苷Rg3。筆者實驗室還發(fā)現(xiàn)了一些氨基酸序列相似性較高的糖基轉(zhuǎn)移酶，其具有不同功能或活性，基于這些酶的序列比對及定點突變分析，鑒定了多個決定糖基轉(zhuǎn)移酶活性或底物特異性的關(guān)鍵氨基酸殘基 。

1.2 通過基因組文庫克隆與基因簇的分析功能鑒定生物元器件

鏈霉菌是天然產(chǎn)物的重要來源之一，參與這些次級代謝產(chǎn)物合成的基因一般以成簇的形式排列，對這些基因的克隆與鑒定常常依賴于基因組文庫的構(gòu)建。禾粟鏈霉菌（Streptomyces graminearus）產(chǎn)生的核苷肽類抗生素谷氏菌素，具有抗細菌、支原體及抗病毒和腫瘤等活性。中國科學(xué)院微生物研究所牛國清副研究員基于HPLC、MS和NMR確定了谷氏菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過篩選禾粟鏈霉菌fosmid文庫克隆了完整的谷氏菌素生物合成基因簇，并在異源的底盤鏈霉菌中成功表達該基因簇。通過功能鑒定，已經(jīng)確定生物合成基因簇中含有1個調(diào)控基因gouR和14個結(jié)構(gòu)基因（gouA-N），通過體內(nèi)遺傳（基因敲除與互補）和中間積累產(chǎn)物的化學(xué)分析，對部分結(jié)構(gòu)基因的功能進行了鑒定?；谶@些實驗結(jié)果和生物信息學(xué)分析，其生物合成途徑推測如下：胞嘧啶首先與尿苷二磷酸葡糖醛酸（UDP-glucuronic acid）相連形成胞嘧啶葡糖醛酸 （cytosylglucuronic acid，CGA），CGA經(jīng)氧化、胺化形成4氨基CGA；隨后活化的絲氨酸和肌氨酸依次與4氨基CGA相連，形成云南霉素；云南霉素的葡糖醛酸C-6位經(jīng)氨化形成谷氏菌素（圖2）。此外，對調(diào)控基因gouR進行深入研究，發(fā)現(xiàn)GouR通過協(xié)調(diào)谷氏菌素的合成和外排調(diào)控谷氏菌素的產(chǎn)生～。

1.3 利用元基因組技術(shù)挖掘與功能鑒定新功能生物元器件

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隨著微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使人們認識到自然界中的大部分微生物是不可培養(yǎng)的，可培養(yǎng)的微生物僅占自然界中實際存在微生物的1%，這些未培養(yǎng)微生物中必然蘊藏著巨大的生物元件資源。近年發(fā)展起來的元基因組技術(shù)，可以讓人們走出純培養(yǎng)微生物的局限，從自然界，特別是極端環(huán)境中獲得更豐富的生物資源，包括合成生物學(xué)所需要的各種生物元件。利用元基因組

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王磊. 基于煙酰胺胞嘧啶二核苷酸的代謝電路研究. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所博士學(xué)位論文, 2014.技術(shù)，一方面通過測序可以獲得未培養(yǎng)生物中的基因信息，獲得許多未知的生物元件信息；另外一方面可以通過功能篩選，獲得許多具有各種用途的功能基因。如對河底沉積物的富集培養(yǎng)物元基因組測序后，找到了以NO2-為電子受體來氧化甲烷的新代謝途徑 。目前各國科學(xué)家利用元基因組技術(shù)，從未培養(yǎng)生物中分離獲得許多有重要工業(yè)應(yīng)用價值的酶基因，如酯酶基因 、脂肪酶基因 、蛋白酶基因 ，以及從冰川冰的元基因組文庫中篩選到的DNA聚合酶I基因 。事實證明，從環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的元基因組中，基于序列篩選或元基因組文庫的功能篩選，可以挖掘到大量新的生物元件。

圖2 禾粟鏈霉菌中谷氏菌素的生物合成途徑

中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室在環(huán)境微生物元基因組研究過程中建立了基于（元）基因文庫的糖基水解酶功能篩選平臺 ，并以454焦磷酸測序技術(shù)獲得的兩個讀長較短（約230bp）的厭氧沼氣發(fā)酵微生物群落元基因組數(shù)據(jù)為研究對象，利用優(yōu)化的短序列拼接方法對上述元基因組454短序列進行拼接，得到了167個較長的含有木質(zhì)纖維素酶基因的contigs（＞1kb），其代表了整個厭氧沼氣發(fā)酵群落中優(yōu)勢的糖基水解酶。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計引物驗證了其中50個contigs拼接的準確性，并利用這些引物對沼氣發(fā)酵群落的fosmid文庫進行了篩選，找到了含有這些contigs的陽性克隆。對11個陽性克隆進行測序，發(fā)現(xiàn)有些fosmid可以被拼接成更大的contig（Contig76N21和Contig76E20的長度分別達到80kb和60kb） 。在這些大的contig中，發(fā)現(xiàn)了含有多個纖維素降解相關(guān)基因的基因簇。如在Contig76N21和Contig76E20中，除了纖維素降解酶之外，還有一些調(diào)節(jié)纖維素酶基因表達的調(diào)控因子和編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的基因成簇排列，這些大的基因簇應(yīng)該來源于發(fā)酵群落中優(yōu)勢的纖維素菌，可能在纖維素的高效降解過程中發(fā)揮重要作用 。同時，通過這些優(yōu)勢纖維素酶基因的分析，僅發(fā)現(xiàn)小部分基因編碼形成纖維小體所需的dockerin結(jié)構(gòu)域，這說明所研究的厭氧沼氣發(fā)酵群落中纖維小體并不是優(yōu)勢的纖維素降解系統(tǒng)。此外，GH5家族是纖維素降解中很重要的一種糖基水解酶，對拼接得到的4個具有全長序列的GH5家族基因在大腸桿菌中進行了表達。其中Contig8188-GH5編碼的糖基水解酶具有較高的甘露糖酶酶活（2625U/mg蛋白），其最適溫度和最適pH分別為60℃和 6.0，因此具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。這種優(yōu)化的序列拼接方法也同樣適用于高通量測序儀solexa等來源的短讀長元基因組reads（150～300bp）的拼接，適用于從各種環(huán)境中挖掘天然產(chǎn)物合成基因簇。

2 生物元件的設(shè)計與改造

人工設(shè)計與合成或改造生物元件將為合成生物學(xué)提供物質(zhì)基礎(chǔ)與新思路。通過數(shù)學(xué)模型預(yù)測、設(shè)計生物器件或生物系統(tǒng)，是合成生物學(xué)的核心目標。為實現(xiàn)這一目標，有必要對現(xiàn)有生物元件的結(jié)構(gòu)與功能進行優(yōu)化與改造。通過解析單個功能元件以及互作的功能元件復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)，揭示生物分子的相互作用模式，特別是負責催化與調(diào)控的蛋白質(zhì)元件以及這兩者之間的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化改造各種功能元件，使設(shè)計的生物器件或系統(tǒng)達到最優(yōu)。2014年12月1日，《Nature》雜志公布了劍橋大學(xué)研究團隊的最新研究成果。研究人員利用人造遺傳物質(zhì)合成出世界上第一個人工酶，合成的酶（XNAzymes）自然界中并不存在，但可以在實驗室中引起化學(xué)反應(yīng) 。2014年11月，《Nature Communications》雜志發(fā)表了中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授劉海燕研究組在蛋白質(zhì)分子設(shè)計方法方面的研究成果 。蛋白質(zhì)是由不同類型的氨基酸按照特定順序串聯(lián)成的長鏈狀生物大分子，很多蛋白質(zhì)分子需要在空間折疊成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮功能。目前能夠折疊成穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)幾乎都是天然蛋白質(zhì)，其氨基酸序列是自然進化形成的。而蛋白質(zhì)設(shè)計是人工指定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，使其具有預(yù)期的三維結(jié)構(gòu)和功能。劉海燕研究組建立了一種全新的統(tǒng)計能量函數(shù)用于蛋白質(zhì)設(shè)計，不僅檢測效率高，還能通過實驗篩選對設(shè)計做出改進?；诖朔椒?，研究組以3種不同天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)為設(shè)計目標，獲得了4個穩(wěn)定折疊的人工蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)從頭設(shè)計的新途徑，可以保證設(shè)計的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與預(yù)定目標高度吻合，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的設(shè)計與改造提供了新工具。

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2.1 人工氧化還原體系的設(shè)計、構(gòu)建和功能鑒定

氧化還原反應(yīng)是最常見的代謝反應(yīng)類型之一，其中絕大部分通過輔因子依賴型氧化還原酶催化實現(xiàn)。由于輔因子還廣泛參與胞內(nèi)其他生物學(xué)過程，人工代謝途徑改造擾動輔因子水平的生物學(xué)效應(yīng)尚難以預(yù)測 。設(shè)計構(gòu)建基于輔因子的正交體系，是避免人工代謝體系與天然代謝體系相互干擾、降低系統(tǒng)復(fù)雜度、提高調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)有效性的新策略 。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所趙宗保課題組 在前期研究生物正交氧化還原體系所取得成果的基礎(chǔ)上，拓展NAD類似物的結(jié)構(gòu)空間，并以與萜類或聚酮合成代謝相關(guān)的氧化還原酶為目標，創(chuàng)建依賴于NAD類似物的氧化還原代謝步驟，從而為選擇性調(diào)控氧化還原代謝提供新元件和新工具。課題組完成了22個NAD類似物的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)鑒定（圖3），測定了部分類似物與蘋果酸酶突變體ME L310R/Q401C以及ME-L310K/ L404S的活性，發(fā)現(xiàn)類似物NBrCD、NMeCD和NClCD等可與蘋果酸酶突變體形成較好的活性配對 。

亞磷酸脫氫酶（PTDH）催化亞磷酸轉(zhuǎn)化為磷酸同時將NAD還原為NADH，該反應(yīng)在水溶液中不可逆。因此，利用PTDH有可能為細胞提供一種新的還原力（能量）供給途徑。筆者課題組全合成了來源于Pseudomonas stutzeri WM88 的PTDH基因，將其克隆到載體pET24b 和pUC18。依據(jù)PTDH與NAD結(jié)合的特點，選擇構(gòu)建了系列雙位點飽和突變體表達文庫N145/M153、Q172/K177、A212/L217、I150/M153、E175/K177 和T214/L217，篩選得到可有效利用NCD的突變體PTDH（L151V/D213C/ T214P/L217P）。將來源于Ralstonia sp. R4506的PTDH基因克隆到載體pUC18，得到表達質(zhì)粒pUC-R4506 （Amp抗性，Lac啟動子）。構(gòu)建了PTDHR4506（I151R）系列飽和突變體表達文庫，篩選獲得突變體PTDHR4506（I151R/E213D/I218F），其利用NCD的偏好性比野生型PTDH提高了1600倍，為高效、高選擇性產(chǎn)生NCDH奠定了基礎(chǔ)。

圖3 NAD類似物的合成

以E. coli為宿主，在其胞內(nèi)表達核苷轉(zhuǎn)運蛋白AtNDT2、可利用NCD的突變酶ME L310R/Q401C和PTDH L151V/D213Q，構(gòu)建了模型能量傳遞調(diào)控體系。當培養(yǎng)基中存在亞磷酸、NCD和亞磷酸鹽時，工程菌株能氧化利用亞磷酸鹽產(chǎn)生NCDH，推動胞內(nèi)丙酮酸還原羧化生產(chǎn)蘋果酸，蘋果酸產(chǎn)量提高35%（圖4）。這是世界首次實現(xiàn)耦合胞外能量源，選擇性推動胞內(nèi)物質(zhì)代謝的研究實例 。這些結(jié)果表明，NAD類似物有可能作為非天然的能量載體，而與NAD類似物匹配的氧化還原酶可作為選擇性控制能量傳遞的模塊，在合成生物學(xué)研究中發(fā)揮獨特的作用。

2.2 啟動子改造和文庫構(gòu)建

啟動子是合成生物學(xué)工程技術(shù)中非常重要的調(diào)控元件之一，各種遺傳線路 、基因開關(guān) 、基因振蕩 和細胞群體系統(tǒng)脈沖發(fā)生器 等功能的發(fā)揮大都需要通過啟動子的調(diào)控來實現(xiàn)。同時，異源合成途徑在底盤細胞中的適配性的優(yōu)化也需要通過調(diào)節(jié)途徑中關(guān)鍵酶的啟動子強度來實現(xiàn)。目前，合成生物學(xué)常用的底盤細胞自身可用的啟動子極其有限，因此需要對現(xiàn)有的啟動子進行改造獲得新的啟動子。蛋白定向改造技術(shù)日益成熟，已經(jīng)應(yīng)用于啟動子的改造。

通過定向改造技術(shù)，建立包括各種不同強度啟動子的文庫，是實現(xiàn)～基因精確調(diào)控的有利遺傳工具。目前，已經(jīng)對畢赤酵母和釀酒酵母中的啟動子進行了改造，通過構(gòu)建啟動子文庫，得到了一系列不同強度的啟動子元件。在工程化的產(chǎn)番茄紅素菌株的優(yōu)化過程中，人們發(fā)現(xiàn)番茄紅素產(chǎn)量與脫氧磷酸木酮糖酶合酶表達水平成線性增長關(guān)系：脫氧磷酸木酮糖酶合酶參與的反應(yīng)是限速步驟，最大番茄紅素的產(chǎn)量需要最適的脫氧磷酸木酮糖酶合酶表達水平 。因此，需要分析不同強度啟動子下脫氧磷酸木酮糖酶合酶表達量與番茄紅素產(chǎn)量的相關(guān)性。為此，研究者利用易錯PCR方法對釀酒酵母的TEF1啟動子進行改造，建立了突變啟動子庫，得到了一系列強度不同的突變啟動子 。在此基礎(chǔ)上，Nevoigt等 進一步對TEF1突變庫的11個啟動子特性進行了研究。研究表明，這些突變啟動子的活性是野生型活性的8%～120%。

圖4 模型能量傳遞調(diào)控體系

除了基因的組成型表達以外，建立一個易于控制、可進行條件誘導(dǎo)或抑制的基因表達盒也常應(yīng)用于合成生物學(xué)研究與工程中。通過啟動子的改造，得到具有特定調(diào)節(jié)特性的啟動子將有望執(zhí)行基因表達的復(fù)雜調(diào)控，并突破由于誘導(dǎo)劑的毒性、高價格和介導(dǎo)的多效性等影響誘導(dǎo)型啟動子應(yīng)用的限制。德國科學(xué)家應(yīng)用隨機突變和多級流式細胞篩選，改造與篩選釀酒酵母的氧響應(yīng)性啟動子DAN1的突變子，獲得了兩個在非嚴謹厭氧條件下可誘導(dǎo)的突變子。這使得酵母發(fā)酵中基因表達的誘導(dǎo)可以通過細胞生長過程中氧氣的消耗來完成，而且，無論是在嚴格厭氧還是微厭氧環(huán)境下，突變啟動子的表達量遠遠高于野生型啟動子的DAN1。

利用模塊化的組件構(gòu)建具有可預(yù)測行為的工程化基因網(wǎng)絡(luò)是合成生物學(xué)的主要目標之一 。然而，由于缺乏合適的組件和構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)通常需要大量反復(fù)測試工作，使得構(gòu)建預(yù)期功能的基因網(wǎng)絡(luò)受到阻礙。美國波士頓大學(xué)學(xué)者發(fā)表了一種利用啟動子文庫結(jié)合雜交模型用于指導(dǎo)預(yù)測釀酒酵母基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法。利用芯片模型耦合了由多元化組件組成的文庫，這些多元化組件是通過隨機非必需序列合成的。他們在釀酒酵母中合成了調(diào)節(jié)啟動子文庫，并利用該文庫構(gòu)建具有各種預(yù)期輸入輸出特性的前饋環(huán)網(wǎng)絡(luò)，通過該研究證實了上述方法的有效性。為了拓寬該方法的應(yīng)用范圍，他們合成了一個具有計時器功能的基因網(wǎng)絡(luò)，并可通過組件的選擇進行更改。運

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隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，具有相似功能的生物元件會越來越多，那么如何對這些元件進行挑選，以達到系統(tǒng)或者裝置的設(shè)計目標，是一個非常重要的問題。一般的方法，是利用這些元件分別合成目標序列，然后來比較它們的功能。但是，在目前的條件下，由于元件的數(shù)量越來越多，合成的步驟也越來越復(fù)雜，往往不可能針對所有候選元件進行實驗 。因此，利用計算機輔助設(shè)計（computer-aided design，CAD）來幫助進行生物元件的選擇，已成為合成生物學(xué)一個重要的研究方向。Ellis等 就是通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，然后根據(jù)計算結(jié)果來選擇適當強度的啟動子，從而合成了所需的基因回路，達到了預(yù)期的實驗?zāi)繕恕Ｄ壳?，已?jīng)有一些計算機軟件來幫助建立數(shù)學(xué)模型，然后根據(jù)生物元件的生物學(xué)數(shù)據(jù)（動力學(xué)參數(shù)和啟動子強度等）來預(yù)測合成的系統(tǒng)是否符合設(shè)計的目標，從而幫助生物元件的選擇，計算機輔助設(shè)計大大加快了合成生物學(xué)的研究速度 。

［本研究得到合成生物學(xué)“973”項目“新功能人造生物器件的構(gòu)建與集成”課題3“新功能人造生物器件的構(gòu)建”（2012CB721103）的資助。］

■ 反饋服務(wù)編碼 W3618

10.3969/j.issn.1674-0319.2015.06.007

合成生物學(xué)與基因工程、代謝工程最顯著的區(qū)別，在于能夠?qū)⒋罅可镌骷M行快速、隨意的組裝，而實現(xiàn)這一目標的前提，是將生物元件或器件進行詳細地功能表征與標準化。目前合成生物學(xué)面臨的主要挑戰(zhàn)之一，是可用的生物元件和模塊（器件）種類局限、數(shù)量不足、表征描述不清楚、通用性程度不高。為此，有必要在功能元件的挖掘、表征、設(shè)計、改造與標準化方面開展系統(tǒng)研究。文章對重要天然產(chǎn)物合成途徑的生物元件進行了挖掘與功能表征，并對氧化還原代謝的功能元件進行了設(shè)計與改造。

合成生物學(xué)是按照一定的規(guī)律和已有的信息設(shè)計和構(gòu)建新的生物元件、裝置和系統(tǒng)，或者重新設(shè)計已有的天然生物系統(tǒng)（http://syntheticbiology. org/）。合成生物學(xué)的核心在于設(shè)計、改造、重建或制造生物器件、生物反應(yīng)系統(tǒng)、代謝途徑與過程，乃至創(chuàng)造具有生命活動能力的細胞和生物個體，為生命起源、生物進化、復(fù)雜疾病、干細胞等生物學(xué)難題的研究開拓新的蹊徑，為解決人類