白景舒，王 健，趙雪峰

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連116021)

結(jié)直腸癌是胃腸道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)［1］。結(jié)直腸癌的臨床分期是判斷預(yù)后的重要的因素。近期研究表明，晚期結(jié)直腸癌的5年生存率為不足50%，甚至有些病人失去了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)［2］。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)病率為25%左右，手術(shù)切除病灶后5年生存率為25% ～58%，復(fù)發(fā)率為25%～50%［3］。因此，對(duì)于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子生物機(jī)制的研究與新型靶向治療藥物的研發(fā)對(duì)結(jié)直腸癌的治療具有重要的意義。

目前有諸多抗腫瘤藥物用于臨床的治療，并取得了一定的療效，但仍存在毒副作用大、耐藥性強(qiáng)等問(wèn)題，尚需開(kāi)發(fā)新的針對(duì)腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)途徑中多環(huán)節(jié)作用靶點(diǎn)的高效低毒抗腫瘤藥物。獲得純度高且量大的抗腫瘤藥物的關(guān)鍵是建立有效而穩(wěn)定的藥物篩選模型。本研究組之前構(gòu)建過(guò)符合臨床腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展特點(diǎn)的動(dòng)物模型，也曾研究過(guò)大腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療，但治療途徑的選擇只能經(jīng)口或腹腔內(nèi)灌注［4］。本研究首先建立裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型，其后經(jīng)靜脈注入常用化療藥物，觀察抗腫瘤效能。期待近期會(huì)成為評(píng)價(jià)新型藥物抗腫瘤活性的有利藥物篩選模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 和環(huán)磷酰胺(CTX)由韓國(guó)CNU 腫瘤研究所Young - Kyu Park 教授捐贈(zèng)。BALb/c 品系裸鼠30 只，6 周齡雌性，體重18 ～20 g，由韓國(guó)CNU 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及懸液制備:人HT29 結(jié)直腸癌細(xì)胞株在攝氏37 ℃、5% CO2，含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2 ～3 d 換1 次培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)至80% ～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化液消化后，1200 r/min 離心3 min，棄上清液，加無(wú)血清RPMI 1640 培養(yǎng)液洗細(xì)胞2 次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，用無(wú)血清RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度分別為5 ×106/mL、1 ×107/mL 及5 ×107/mL。制備好的細(xì)胞懸液放冰浴保存，于30 min 內(nèi)分別進(jìn)行接種。

1.2.2 動(dòng)物模型設(shè)計(jì):制模前1 周為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安定期，防止進(jìn)行對(duì)裸鼠的一切刺激性操作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共30 只，隨機(jī)分為15 只低濃度環(huán)磷酰胺治療組(L-CTX 治療組;CTX 1.0 mg·kg-1)和15 只高濃度環(huán)磷酰胺治療組(H-CTX 治療組;CTX 4.0 mg·kg-1)。L-CTX 治療組再分為5 只HT29 大腸癌細(xì)胞濃度梯度為5 ×105/100 μL 制模組、5 只HT29 結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組及5只HT29 結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度為5 ×106/100 μL制模組;H-CTX 治療組也同L -CTX 治療組分類(lèi)。CTX 治療組在制模后3 d 起經(jīng)遠(yuǎn)端半脾每隔3 d 進(jìn)行治療。L-CTX 治療組經(jīng)遠(yuǎn)端半脾注入濃度1.0 mg·kg-1，而H-CTX 治療組經(jīng)遠(yuǎn)端半脾注入濃度4.0 mg·kg-1。制模30 d 后所有30 只裸鼠進(jìn)行處死，解剖觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 放大鏡輔助下結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型的建立:根據(jù)麻醉預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇異氟醚進(jìn)行全身麻醉。放大鏡輔助下(Binocular lens，Heine，Germany)取上腹正中切口長(zhǎng)約5 mm，逐層入腹后小心牽拉大網(wǎng)膜并顯露脾臟(圖1A)。脾臟中央利用一次性鈦夾夾閉并切斷，分成兩個(gè)帶血管蒂的半脾(圖1B)。近端半脾牽出切口外，用31 號(hào)無(wú)損傷針頭迷路進(jìn)針約2 mm，分組并分別緩慢注入HT29 結(jié)直腸癌細(xì)胞懸液5 ×105/100 μL、1 ×106/100 μL 及5 ×106/100 μL 至脾被膜下，總量為100 μL，注射部位脾被膜可見(jiàn)發(fā)白腫脹，拔針時(shí)用止血小紗布輕輕按壓30 s(圖1C)。10 min 后夾閉、切斷近端半脾臟血管(圖1D)，切除并移除近端半脾(圖1E)。切口左側(cè)皮下游離至使皮下形成儲(chǔ)存囊，將遠(yuǎn)端半脾擺放在其囊內(nèi)，送回部分網(wǎng)膜等附件后，逐層關(guān)腹(圖1F)。建立模型全程應(yīng)防止遠(yuǎn)端半脾血管的損傷，同時(shí)也要防止胰腺、胃及重要血管的損傷。

1.2.4 結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)制模預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇制模及治療后30 d 處死裸鼠，并制定的肝轉(zhuǎn)移評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0 為無(wú)肝轉(zhuǎn)移;1 為最低限度浸及肝臟，浸潤(rùn)范圍≤0.50 cm2;2 為輕度浸及肝臟，浸潤(rùn)范圍0.51 ～1.00 cm2;3 為中度浸及肝臟，浸潤(rùn)范圍1.01 ～2.00 cm2;4 為重度浸及肝臟，浸潤(rùn)范圍＞2.00 cm2。

1.2.5 觀察指標(biāo):每天常規(guī)觀察記錄裸鼠狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)量、皮膚狀態(tài)、排泄物。裸鼠出現(xiàn)頻死前癥狀或觀察期滿(mǎn)30 d 時(shí)予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔及胸腔內(nèi)情況，具體記錄肝轉(zhuǎn)移評(píng)分、有無(wú)淋巴結(jié)腫大及轉(zhuǎn)移、有無(wú)血性腹水、有無(wú)腹腔種植轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean ±SD 表示，研究組和對(duì)照組的比較采用t 檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 半脾模型Fig 1 Hemispleen model

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度梯度的結(jié)直腸癌細(xì)胞制模后肝轉(zhuǎn)移評(píng)分

30 只裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率皆為100%，無(wú)一例手術(shù)死亡，制模有效。L -CTX 治療組按大腸癌細(xì)胞濃度梯度(5 ×105/100 μL、1 ×106/100 μL 及5 ×106/100 μL)，肝轉(zhuǎn)移評(píng)分分別為1.80 ±0.45，2.60±0.55 及3.60 ±0.55，其差異有顯著性意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。H-CTX 治療組也同L-CTX治療組按結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度分類(lèi)，肝轉(zhuǎn)移評(píng)分分別為0.80±0.55，1.20 ±0.55 及2.40±0.55，其差異也有顯著性意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 CTX 治療效能及模型穩(wěn)定性比較

30 只裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型減瘤率皆為100%。大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型觀察，發(fā)現(xiàn)L -CTX治療組淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移(11/15;73.3%)、血性腹水(8/15;53.3%)、腹膜種植轉(zhuǎn)移(3/15;20.0%)及肺轉(zhuǎn)移(1/15;6.7%)。但H-CTX 治療組無(wú)腹膜種植轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移，而表現(xiàn)出淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移(2/15;13.3%)、血性腹水(1/15;6.7%)。L-CTX 治療組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血性腹水明顯少于H-CTX 治療組，其差異有顯著性意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

表1 不同濃度梯度的結(jié)直腸癌細(xì)胞制模后肝轉(zhuǎn)移評(píng)分比較Tab 1 The liver metastasis scores between two concentrations of CTX in different concentrations of HT29 human colon cancer cells of hemispleen models

圖2 半脾模型致肝轉(zhuǎn)移Fig 2 The hepatic metastasis of hemspleen model

表2 不同濃度梯度CTX 治療效能的比較Tab 2 The therapeutic effects of different concentrations of CTX in hemispleen model (n)

2.3 藥物敏感性篩選模型的選定

L-CTX 與H -CTX 治療組的相互比較中，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模相其平均肝轉(zhuǎn)移評(píng)分的差值減少最顯著，見(jiàn)表1。結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模相其組織及臟器轉(zhuǎn)移能力明顯下降，見(jiàn)表2。人HT29 結(jié)直腸癌細(xì)胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組，其模型具有高度的穩(wěn)定性和對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。

3 討 論

隨著腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究，信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤藥物的研究，有望成為腫瘤治療的新途徑［5］。然而，在前臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇有效而穩(wěn)定的藥物篩選模型是能否研發(fā)高效而低毒的抗腫瘤藥物的先決條件。

經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)，癌腫的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是有選擇性的而非隨機(jī)的，具有很強(qiáng)的器官特異性，如結(jié)直腸癌容易發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移［6］。建立合理的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型是研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室曾成功建立過(guò)胃腸道腫瘤的原位或異位移植肝轉(zhuǎn)移模型。真正應(yīng)用于前臨床實(shí)驗(yàn)只能經(jīng)口或腹腔內(nèi)抗腫瘤藥物的灌注［4，7］，故本研究建立裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型，后經(jīng)保留的遠(yuǎn)端脾靜脈直接注入常用化療藥物，觀察抗腫瘤效能。此模型更有利于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子生物機(jī)制及新型靶向治療藥物的研發(fā)，是較為理想的抗腫瘤藥物篩選模型。本模型與目前報(bào)道的常用大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型相比，有如下優(yōu)點(diǎn):(1)有效利用了裸鼠脾臟特殊的解剖特點(diǎn);(2)經(jīng)靜脈給藥，更加貼近于臨床，值得強(qiáng)力推薦于前臨床試驗(yàn);(3)可模擬臨床廣泛應(yīng)用于腫瘤患者的皮下埋置的化療泵，不用開(kāi)腹就能利用注射器來(lái)定期注入抗腫瘤藥物;(4)可模擬應(yīng)用于腫瘤化療患者的周?chē)行撵o脈的PICC 管，必要時(shí)連接抗腫瘤藥物;(5)可作為肝轉(zhuǎn)移的有效治療，也可應(yīng)用于預(yù)防性肝轉(zhuǎn)移治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。此藥物篩選模型值得前臨床試驗(yàn)的推廣應(yīng)用，但其弱勢(shì)在于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，需要反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的來(lái)熟練其手術(shù)操作。

在本組的前臨床實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞建立的肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率和減瘤率皆為100%。尤其是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組，顯示出模型穩(wěn)定性和抗腫瘤藥物的敏感性。

綜上所述，本文所構(gòu)建的裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了較為理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。肝轉(zhuǎn)移半脾模型為抗腫瘤藥物體外篩選模型方法，其模型的建立能應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選。

特此，感謝韓國(guó)Young Kyu Park 教授的捐贈(zèng)。

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