張曉春，金元哲

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽110032)

Fractalkine(FKN)是一種近年發(fā)現(xiàn)的CX3C 家族趨化因子，具有趨化活性。IL -8 是一種炎癥因子，與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。而關(guān)于FKN 與IL-8 的關(guān)系，目前國內(nèi)外研究較少。纈沙坦(Valsartan)已在臨床廣泛應(yīng)用，除降壓作用外還表現(xiàn)出抑制炎癥反應(yīng)的效應(yīng)。本文主要研究FKN 對(duì)人血單個(gè)核細(xì)胞IL-8 表達(dá)的影響及蛋白激酶C(PKC)在其中的作用，并觀察纈沙坦的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

健康人外周新鮮抗凝血、Hank’s 液(USA，康寧)、優(yōu)等胎牛血清(FBS)(Hyclone 公司)、青霉素及鏈霉素(華北制藥廠)、淋巴細(xì)胞分離液(濃度1.077 g/mL)(天津，TBD 公司)、乙二胺四乙酸(EDTA，Promega 公司)、人IL -8 ELISA 檢測(cè)試劑盒(武漢，USCN. Life Science Inc)、重組人Fractalkine(Sigma)、Ro31 -8220(Sigma)、Valsartan(Sigma)、RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco)，DMSO(Sigma)。

1.2 方 法

1.2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及分組:無菌條件下，先用密度梯度離心法從人外周血濃縮白細(xì)胞中分離PBMC，然后每孔將1 ×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞/0.2 mL/鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為5 組，每組2 個(gè)復(fù)孔。對(duì)空白照組將PBMC置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。FKN 組在PBMC 培養(yǎng)液中加FKN，終濃度1 μg/mL。Ro31 -8220(PKC 阻斷劑)組在PBMC 培養(yǎng)液中加入Ro31 - 8220 (終 濃 度 為250 μg/mL)。FKN +Ro31 -8220 組在PBMC 培養(yǎng)液中加入Ro31 -8220(終濃度為250 μg/mL)，作用2 h 后，加入FKN(終濃度為1 μg/mL)。FKN +纈沙坦組在PBMC 培養(yǎng)液中加入纈沙坦(終濃度為250 μg/mL)，作用2 h后，加入FKN(終濃度為1 μg/mL)。除對(duì)照組外，另4 組FKN 終濃度加至1 μg/mL 后，均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 IL -8 含量的檢測(cè):收集各組單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)上清，在FKN 終濃度加至1 μg/mL 后于12 和24 h 用ELISA 法檢測(cè)其IL-8 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

細(xì)胞培養(yǎng)12 h 或24 h 后，單純Ro31 -8220 組與空白對(duì)照組比較，IL -8 表達(dá)無明顯差異(P ＞0.05)。FKN 刺激12 h 后，IL -8 表達(dá)較空白對(duì)照組均明顯減少(P ＜0.05);應(yīng)用Ro31 -8220 預(yù)刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 組，IL-8 表達(dá)較FKN組明顯增加(P ＜0.05);應(yīng)用纈沙坦預(yù)刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 組，IL-8 表達(dá)較FKN 組明顯減少(P ＜0. 05)。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，上述各組IL-8亦表現(xiàn)出同樣的變化。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h各組IL-8 表達(dá)均較12 h 明顯減少(P ＜0.05)。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)12 h 和24 h 后IL-8 濃度Tab 1 Results of the IL-8 expression from each group cultured after 12 h and 24 h (n=3，pg/mL，±s)

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)12 h 和24 h 后IL-8 濃度Tab 1 Results of the IL-8 expression from each group cultured after 12 h and 24 h (n=3，pg/mL，±s)

1)與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05;2)與FKN 組比較，P ＜0.05

組別12 h 24 h空白對(duì)照組992.81±109.73 90.37±2.74 FKN 組 747.15±109.511) 74.41±4.601)Ro31-8220 組 976.42±88.522) 85.23±2.842)FKN+Ro31-8220 組 2218.08±184.121)2) 78.34±6.791)2 FKN+纈沙坦組 61.34±4.561)2) 57.47±1.331)2

3 討 論

最近研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)炎癥反應(yīng)過程［1-2］，F(xiàn)KN 是近年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的炎癥趨化因子，具有趨化和粘附的雙重作用，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。IL -8 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過趨化中性粒細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)，影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生［5-6］。

PKC 是一種細(xì)胞質(zhì)酶，在未受刺激的細(xì)胞中，PKC 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈非活性構(gòu)象。一旦有第二信使的存在，PKC 將成為膜結(jié)合的酶，它能激活細(xì)胞質(zhì)中的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時(shí)也能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控，是一種多功能的酶。研究表明，PKC 及其介導(dǎo)的信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展密切相關(guān)［7］。

FKN 和IL -8 都可影響細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)，但二者相互作用及引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不明確。本組此前研究表明，趨化因子FKN 可能通過ERK、PI3K 信號(hào)途徑抑制IL - 8 的表達(dá)，而通過NF-κB 途徑促進(jìn)IL -8 的表達(dá)［8］。那么，PKC 信號(hào)途徑在FKN 抑制IL -8 表達(dá)中起著什么樣的作用?本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PKC 特異性抑制劑Ro31 -8220 阻斷PKC 的作用，結(jié)果顯示單純Ro31 -8220 對(duì)IL-8的表達(dá)無明顯影響，而經(jīng)FKN 誘導(dǎo)后IL -8 的表達(dá)明顯增加，說明FKN 可能通過PKC 途徑抑制IL -8的表達(dá)。

有研究顯示，纈沙坦(Valsartan)除降壓作用外還表現(xiàn)出抑制炎癥反應(yīng)的效應(yīng)［9］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，纈沙坦在FKN 抑制IL-8 表達(dá)過程中起協(xié)同抑制作用，機(jī)制可能是纈沙坦抑制炎癥因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步使IL-8 表達(dá)減少。

本研究證實(shí)FKN 可抑制人外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-8 的表達(dá)，這一作用可能通過PKC 途徑實(shí)現(xiàn)，纈沙坦可增強(qiáng)FKN 對(duì)IL -8 表達(dá)的抑制作用。探索FKN 與IL-8 的關(guān)系，研究FKN 引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，有助于提高對(duì)免疫炎癥因子復(fù)雜的錯(cuò)綜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)臨床實(shí)踐;而Ang II 受體拮抗劑纈沙坦可抑制IL-8 的表達(dá)，為纈沙坦的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用提供了依據(jù)。

［1］ Jaipersad AS，Lip GYH，Silverman S，et al.The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis［J］. J Am Coll Cardiol，2014，63(1):1 -11.

［2］ Frosteg?rd J. Immunity，atherosclerosis and cardiovascular disease［J］.BMC Medicine，2013，11(1):117.

［3］ Ioannidis JP，Tzoulaki I.Minimal and null predictive effects for the most popular blood biomarkers of cardiovascular disease［J］.Circ Res，2012，110(5):658 -662.

［4］ Yao K，Lu H，Huang R，et al.Changes of dendritic cells and fractalkine in type 2 diabetic patients with unstable anginapectoris:a preliminary report［J］. Cardiovas Diabet，2011，10:50 -59.

［5］ Samnegard A，HultheJ，Silveira A，et al. Gender speciticassociationsbetween matrix metalloproteinases and inflammatory markers in post myocardial unfarction patients［J］.Atherosclerosis，2009，202(2):550 -556.

［6］ Beaudeux J，Giral P，Bruclert E，et al.Matrix metallorapeutic perspectires［J］. Clin Chem Lab Med，2004，42(2):121 -131.

［7］ Steinberg SF. Cardiac actions of protein kinase C isoforms［J］.Physiology:Bethesda，2012，27(3):130 -139.

［8］ 金元哲，雷明明，顏冰，等.趨化因子FKN 對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-8 表達(dá)的影響及ERK、PI3K 和NF-κB 在其中的作用［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36(2):124 -128.

［9］ Yang J，Jiang H，Yang J，et al. Valsartan preconditioning protects against myocardial ischemia - reperfusion injury through TLR4/NF - κB signaling pathway［J］. Mol Cell Biochem，2009，330(1 -2):39 -46.