吳茉莉，李 萍，汪黎鴻，陳曉燕，孔慶友，程曉馨

(大連醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 細胞生物學教研室，遼寧 大連116044)

脫髓鞘是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(損傷)如多發(fā)性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、壞死出血性白質(zhì)腦炎及脊髓損傷的重要病理特征［1］。研究認為，髓鞘再生依賴于內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPC)向少突膠質(zhì)細胞(形成髓鞘)的成熟分化［2］。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenic protein 4，BMP4)是抑制OPC 成熟分化的重要因素之一［3］，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘損傷后BMP4 呈高水平表達［4］。有研究報道，BMP4 水平的升高與損傷處反應性星形膠質(zhì)細胞的高水平表達相關［4］;另一方面，損傷病灶周圍的星形膠質(zhì)細胞活化、增殖，形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)再生［5-6］;這些均是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復的重要因素。有關BMP4 與反應性星形膠質(zhì)細胞增殖之間關系的報道甚少。本實驗利用源于成年SD 大鼠脊髓損傷原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞模型，探討B(tài)MP4 與星形膠質(zhì)細胞增殖的關系，以期尋找調(diào)節(jié)髓鞘再生及抑制膠質(zhì)瘢痕形成的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材 料

成年雌性SD 大鼠(200 ～220 g)，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，NYU 脊髓損傷儀(美國)，倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)。所有實驗均通過了大連醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 方 法

1.2.1 成年SD 大鼠星形膠質(zhì)細胞的純化及處理:采用腹腔內(nèi)膜注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)麻醉。于第9 胸椎水平(T9)對大鼠實施背側(cè)椎板切除術暴露脊髓，借助NYU 脊髓損傷儀產(chǎn)生力度為150 kdyn 的脊髓鈍性挫傷。損傷后的第7 天，長度為2 cm 的脊髓(含損傷脊髓部分)被解剖取出，于Hanks 平衡鹽溶液(含10 mmol/L HEPES)中切成體積為1 mm3的碎塊，然后在預先配制的酶溶液(Hanks 平衡鹽溶液含10 mmol/L HEPES、0. 01%papain、0.1% trypsin 及0.01% DNase I)中37 ℃消化30 min，隨后用等體積的含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化過程，用移液管輕柔吹打組織，用70 μm 的尼龍網(wǎng)過濾，離心4 min(1500 r/min)，棄上清，加入星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液(DMEM +10%FBS+1 ×N2)，輕柔吹打，制成細胞懸液(1 ×106)，接種于T75 培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。每2 天換液1 次，約10 ～14 d 后細胞匯合，將培養(yǎng)瓶置于振蕩器(Thermo Scientific)上，37℃振蕩過夜(275 r/min)，去除小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)前體細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元［7］。培養(yǎng)瓶中的細胞經(jīng)0.25%胰酶(含0.05% EDTA)消化，以4 ×104的細胞密度接種于多聚賴氨酸(PDL)包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿預先置入細胞片用于免疫熒光及細胞增殖情況的檢測。通過對星形膠質(zhì)細胞的標記分子波形蛋白(vimentin)染色以確定星形膠質(zhì)細胞的純度。

人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4，R＆D Systems Inc.，Minneapolis，USA)以0.1%乙酸作為溶劑制成濃度為10 mg/mL 的貯存液，使用前用培養(yǎng)液稀釋至工作液濃度10 ng/mL;Noggin［8］(BMP4 拮抗劑，R＆D Systems Inc.，Minneapolis，USA)使用前用培養(yǎng)液稀釋至工作液濃度100 ng/mL。實驗分為4 組:(1)正常對照組，培養(yǎng)液正常培養(yǎng);(2)BMP4 組:10 ng/mL BMP4 持續(xù)處理細胞48 h;(3)Noggin 組:100 ng/mL Noggin 持續(xù)處理細胞48 h;(4)BMP4 +Noggin 組:用100 ng/mL Noggin 處理細胞30 min 后加入10 ng/mL BMP4，兩者共同處理細胞48 h。實驗結(jié)束后取各實驗組的細胞爬片，用4%的多聚甲醛固定，進行各項指標的免疫熒光染色。為了實驗的可信性，每個實驗重復至少3 次。

1.2.2 細胞增殖分析:將配制好的5 -溴脫氧尿嘧啶核苷(5 -bromodeoxyuridine，Brdu，Sigma 公司)液體加入細胞培養(yǎng)液中(終濃度為10 μmol/L)，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h［7］，收集細胞爬片，行抗Brdu 免疫熒光染色，對星形膠質(zhì)細胞的增殖情況進行檢測和分析。

1.2.3 免疫熒光:取4%多聚甲醛固定的細胞爬片，1 ×PBS 洗滌細胞3 次，用0.01% Triton X -100和羊血清室溫封閉1 h，清除封閉液，加含抗BrdU(1∶200)或抗vimentin(鼠單克隆抗體)的一抗溶液，4 ℃過夜，1 ×PBS 清洗細胞3 次，加入相應的熒光標記二抗(1∶200，Jackson ImmunoResearch)，37 ℃避光孵育1 h，用DAPI(藍色熒光)染細胞核;1 ×PBS洗滌細胞3 次，防熒光淬滅的封片劑封片，在熒光顯微鏡下進行觀察、計數(shù)及拍照。在10 ×物鏡下，任意選取10 個視野，計算Brdu 陽性細胞占星形膠質(zhì)細胞的百分比。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

經(jīng)過分離、純化和培養(yǎng)，98%以上的細胞為vimentin 陽性細胞(星形膠質(zhì)細胞的標記分子，見圖1)。

免疫熒光的結(jié)果顯示，各實驗組中Brdu 陽性細胞占星形膠質(zhì)細胞的平均百分比分別為:正常對照組3.10%，Noggin 組3.13%，BMP4 組14.03%，BMP4 +Noggin 組3.81%。與正常對照相比較，BMP4 組的Brdu 陽性細胞明顯增多(P ＜0.01)。與BMP4 組相比，BMP4+Noggin 組的Brdu 陽性細胞明顯減少(P ＜0.01)。見圖1和圖2。

3 討 論

圖1 各實驗組星形膠質(zhì)細胞中vimentin 和Brdu 的免疫熒光染色Fig 1 Immunofluorescent stainings of vimentin and Brdu in cultured astrocytes of different groups

圖2 BMP4 對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響Fig 2 The effects of BMP4 on cell proliferation in cultured astrocytes

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病中，軸突因表面髓鞘喪失而容易發(fā)生變性，而髓鞘再生可使受損的軸突免于進一步變性［9］。有研究顯示髓鞘再生需要OPC 向產(chǎn)生髓鞘的成熟少突膠質(zhì)細胞方向分化［2］。在病理狀態(tài)下，脫髓鞘損傷處雖然存在少突膠質(zhì)前體細胞，但這些細胞常常處于未分化狀態(tài)，無法向少突膠質(zhì)細胞方向分化［10］。因此，促進少突膠質(zhì)前體細胞的成熟分化是髓鞘再生的理想策略之一。近年來，越來越多的研究表明，BMP4 是抑制少突膠質(zhì)前體細胞成熟分化的重要因素，在脊髓脫髓鞘損傷過程中，BMP4 的表達水平升高且與臨床疾病的嚴重程度呈正相關［3-4］。有研究報道BMP4 水平的升高與損傷處活化增殖的星形膠質(zhì)細胞的分泌相關［4］。本研究利用成年SD 大鼠脊髓損傷原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞模型發(fā)現(xiàn)，活化增殖的星形膠質(zhì)細胞不僅可分泌BMP4，而且BMP4 還可有效地促進反應性星形膠質(zhì)細胞的增殖，表明BMP4 與星形膠質(zhì)細胞增殖之間呈正反饋的關系。鑒于BMP4 與星形膠質(zhì)細胞在髓鞘病理性損傷中的重要作用，BMP4 有望成為神經(jīng)退行性疾病及脊髓損傷的潛在治療靶點。另一方面，膠質(zhì)瘢痕被認為是脊髓損傷后軸突再生和功能恢復的主要障礙［5-6］。本實驗發(fā)現(xiàn)BMP4 的拮抗劑——Noggin 可有效地抑制BMP4 對反應性星形膠質(zhì)細胞的促增殖作用，因此，降低BMP4 的水平或BMP4 的抑制劑也可能成為未來抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而促進髓鞘再生的新的研究方向。

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