李　然,賴鐘雄,賴呈純,方智振,林玉玲,劉生財,陳裕坤,張梓浩

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所,福州 350002)

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龍眼松散型胚性愈傷組織發(fā)生過程中相關(guān)蛋白的表達分析

李然,賴鐘雄*,賴呈純,方智振,林玉玲,劉生財,陳裕坤,張梓浩

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所,福州 350002)

摘要:以龍眼‘紅核子’品種(DimocarpuslonganLour.cv.Honghezi)松散型胚性愈傷組織(FEC)為材料,采用固相雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù),對其生長過程中相關(guān)蛋白的表達變化進行研究。結(jié)果表明:(1)龍眼FEC生長過程中,總蛋白點數(shù)在400～800之間,蛋白點數(shù)變化雖有升降起伏,但總體呈上升趨勢;蛋白質(zhì)pI集中在4～7之間;蛋白質(zhì)分子量在14～97 kD之間,表達量相對較高的是分子量在30～66 kD的蛋白質(zhì),且30～45 kD的蛋白點逐漸增多,45～66 kD的逐漸減少。(2)龍眼FEC生長過程中質(zhì)譜鑒定66個蛋白,其中28.79%為功能未知蛋白,30.30%涉及脅迫應答和抗氧化,10.61%涉及能量和糖代謝,10.61%涉及蛋白代謝和修復,6.06%涉及細胞骨架重構(gòu),4.55%蛋白是調(diào)控蛋白,3.03%是核酸代謝相關(guān)蛋白,而所占比例最少的為信號轉(zhuǎn)導與細胞凋亡相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白、脂類代謝相關(guān)蛋白,以及維生素代謝相關(guān)蛋白均為1.52%。(3)龍眼FEC生長過程中,脅迫反應/氧化還原相關(guān)蛋白(抗壞血酸類過氧化物酶R147、R158和HC21,芐基醚還原酶同系物TH6、谷胱甘肽過氧化酶以及過氧化物酶L26)表達高峰出現(xiàn)在前期10～20 d,而過氧化物酶4多在后期40～50 d表達;蛋白質(zhì)合成及修復的相關(guān)蛋白,只有蛋白質(zhì)異形體1在10～30 d表達量高,其他蛋白的表達高峰出現(xiàn)在前期10～20 d之間,能量與糖代謝相關(guān)酶在整個過程中都有較大量的表達。

關(guān)鍵詞:龍眼;松散型胚性愈傷組織;蛋白質(zhì)組;質(zhì)譜

龍眼((DimocarpuslonganLour.)胚胎發(fā)育狀況關(guān)系到成熟果實的食用和加工甚至坐果率,尤其是早期敗育的品種普遍存在嚴重的生理落果問題,直接影響到產(chǎn)量。植物體細胞胚在發(fā)生發(fā)育中與合子胚胎發(fā)育過程相似[1],因此,闡明龍眼體胚發(fā)生發(fā)育過程從基因到性狀表達的規(guī)律有著十分重要的意義,可為新品種選育、果核大小調(diào)控、果實品質(zhì)改善以及提高坐果率、增加產(chǎn)量提供理論依據(jù)[2]。已建立并長期保持的龍眼松散型胚性愈傷組織(friable embryogenic callus,FEC),具有很強的體細胞胚發(fā)生和植株再生能力,這在木本植物中是很少見的,是木本植物離體胚胎發(fā)生的模式植物之一[3-5]。龍眼FEC及其懸浮細胞系,是分離原生質(zhì)體的優(yōu)良材料,是用于基因工程育種的良好轉(zhuǎn)化體系,是細胞突變體篩選的高效試驗系統(tǒng),在快速繁殖苗木、制作人工種子等方面龍眼的胚性細胞系也是一種優(yōu)良體系[3]。前人研究表明,龍眼體細胞胚發(fā)生各時期的主要蛋白質(zhì)組分相似,體現(xiàn)了體胚蛋白質(zhì)組分的穩(wěn)定性,也說明這些蛋白質(zhì)是維持體胚細胞基礎代謝必需基因表達的產(chǎn)物[6]。因此找出胚性愈傷組織和胚狀體特異蛋白之間的聯(lián)系及功能,對于深入了解體胚發(fā)生機理有重要意義。通過對龍眼體細胞胚發(fā)生早期[7]、中期[8]和后期[9]蛋白質(zhì)組學以及相關(guān)分子生物學方面[10]的研究,發(fā)現(xiàn)龍眼體胚發(fā)生的整個過程是受內(nèi)外環(huán)境綜合影響,包括激素種類和濃度的調(diào)節(jié)、大分子物質(zhì)代謝與積累、氧化脅迫等,導致不同階段蛋白質(zhì)(包括酶)組分及含量的不同,與衰老有關(guān)的酶系統(tǒng),超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的三大重要酶系,隨機體衰老會大量積累。龍眼FEC高頻率體細胞胚發(fā)生和再生能力的保持,與其長期繼代保持過程中細胞活力的維持息息相關(guān)。因此利用蛋白質(zhì)組學方法研究龍眼FEC衰老過程中蛋白質(zhì)的功能,從蛋白質(zhì)水平上探討龍眼FEC生長和衰老機制,為龍眼FEC正常培養(yǎng)、長期繼代以及胚性保持提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

龍眼LC2細胞系的松散型胚性愈傷組織[3],于附加1.0 mg/L 2,4-D的MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),溫度(25±2) ℃,黑暗培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)10、20、30、40和50 d的FEC后作為試驗材料。第一向電泳采用Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng);第二向電泳采用Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)。蛋白質(zhì)組試驗所用試劑均為GE Healthcare生產(chǎn),其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)樣品的提取與定量龍眼FEC不同培養(yǎng)階段丙酮干粉制備和蛋白樣品的提取參照賴呈純等[11]的方法。提取的蛋白質(zhì)樣品參照Bradford[12]稍作改良的方法進行定量。

1.2.2蛋白質(zhì)樣品雙向電泳第一向等電聚焦(IEF)電泳和IPG膠條平衡,采用線性IPG膠條長度18 cm,pH為4～7,使用Ettan IPGphor Ⅲ(GE Healthcare),采用主動加樣水化。固相pH梯度凝膠第二向SDS-PAGE采用GE Healthcare公司生產(chǎn)的Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)進行,具體參數(shù)和操作方法見賴呈純等[7]和方智振等[8]的方法。

1.2.3龍眼胚性愈傷組織生長過程中相關(guān)蛋白的質(zhì)譜鑒定將選好的目的蛋白點,用解剖刀沿蛋白點染色邊緣切下,裝入1.5 mL EP管中,做好標記,交由上海復旦大學生物質(zhì)譜實驗室,用MALDI-TOF質(zhì)譜儀制備肽質(zhì)量指紋譜,鑒定蛋白具體操作參照賴呈純等[7]的方法。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜鑒定的龍眼相關(guān)蛋白點在雙向電泳凝膠上的分布及相關(guān)信息

龍眼FEC凝膠2-D圖譜分析后,選取蛋白表達量相對值超過0.3的74個差異表達蛋白進行質(zhì)譜鑒定,由于其中18個點在本實驗室其他研究[7-9]中已經(jīng)完成鑒定,本實驗不再重復。對剩下56個差異表達的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定,鑒定成功的有48個(圖1中綠色顯示,且在圖1和表1中用編號R表示),其蛋白匹配分數(shù)大于72,得到的數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果較為可靠。

2.2質(zhì)譜鑒定相關(guān)蛋白的功能分析

對龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中差異顯著的56個蛋白進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析,成功鑒定48個點(匹配分數(shù)≥72),成功率達到85.71%?？梢娎肕ALDI-MS方法鑒定蛋白質(zhì),尤其對于混合蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)相對分子質(zhì)量的精確測定有很大優(yōu)勢[13]。加上何園[9]和賴呈純等[7]已鑒定的18個蛋白(表2中編號分別為HC和L的蛋白點),龍眼FEC生長過程中已經(jīng)成功鑒定的點總共有66個,可以分為11個功能類群(表2),分別是脅迫應答和抗氧化相關(guān)蛋白、蛋白代謝和修復相關(guān)蛋白、能量和糖代謝相關(guān)蛋白、信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡相關(guān)蛋白、核酸代謝相關(guān)蛋白、細胞骨架的重構(gòu)相關(guān)蛋白、維生素代謝相關(guān)蛋白、脂類代謝相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白、調(diào)控蛋白以及功能未知蛋白。其中,在已知功能的蛋白中,比例最高的是脅迫應答和抗氧化相關(guān)蛋白,占30.30%,并且過氧化物酶數(shù)量最多,有12個;其次是蛋白代謝和修復相關(guān)蛋白以及能量和糖代謝相關(guān)蛋白,都有7個,分別都占10.61%;細胞骨架的重構(gòu)相關(guān)蛋白,所占比例是6.06%;調(diào)控蛋白共有3個,比例占到4.55%;核酸代謝相關(guān)蛋白有2個,占3.03%;占比例較少的為維生素代謝、氨基酸代謝、脂類代謝相關(guān)蛋白信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白,分別只有1個,各占1.52%。其余還有19個功能未知蛋白在數(shù)據(jù)庫中檢索不到得分大于72的結(jié)果,可能是目前像龍眼這樣的木本植物在分子方面的研究還很有限。在龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中參與氧自由基清除功能的酶占了功能已知蛋白的一半以上,可以推測在生長過程中不同階段,會有不同的酶出現(xiàn)維持細胞內(nèi)部的氧化脅迫壓力平衡,從而保證正常生長增值。

2.3龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中質(zhì)譜鑒定蛋白表達變化

2.3.1脅迫應答和抗氧化相關(guān)蛋白龍眼FEC生長過程中鑒定出的脅迫應答和抗氧化類相關(guān)蛋白共有20個,以過氧化物酶為主,其中芐基醚還原同系物TH6、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氧化還原蛋白各1個,抗壞血酸類過氧化物酶共5個,其余12個全部為過氧化物酶,其中兩個過氧化酶(HC19和L26)通過數(shù)據(jù)庫檢測是同一個蛋白(登錄號均為gi|218328),其他均為過氧化酶4。不同種類過氧化物酶表達量增加的階段也不同,表達量相對值超過0.3,前期(10～20 d)表達的主要有6個:抗壞血酸類過氧化物酶R147、R158和HC21,芐基醚還原酶同系物TH6,谷胱甘肽過氧化酶以及過氧化物酶L26。在培養(yǎng)10 d時主要是芐基醚還原酶同系物TH6和葉綠體抗壞血酸類過氧化物酶HC21,20 d時芐基醚還原酶同系物TH6的表達量雖然有所下降但仍然高于0.3,其余3種表達量由高到低依次是抗壞血酸類過氧化物酶R147、抗壞血酸類過氧化物酶R158、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化酶L26。到生長中期(30 d)6種酶的表達量都有所下降,而過氧化還原蛋白的表達量超過他們,過氧化物酶4 R248、R261、R264都有少量表達。在后期(40～50 d)大量表達的是全部的過氧化酶(過氧化酶4和過氧化酶HC19)以及2種抗壞血酸類過氧化物酶(R361和細胞質(zhì)抗壞血酸類過氧化物酶1),表達量最高的是過氧化物酶4 R248,谷胱甘肽過氧化酶和過氧化還原蛋白還有少量表達(表達量相對值小于0.2),到50 d時,部分過氧化物酶表達量下降或消失,但抗壞血酸類過氧化物酶R361表達量還很高(表3)?？梢?在龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程的不同階段,會有不同的抗氧化相關(guān)蛋白起主要作用,行使平衡氧脅迫環(huán)境及清除氧自由基的功能。

圖1　龍眼FEC質(zhì)譜鑒定的相關(guān)蛋白點在雙向電泳凝膠上分布

表2　質(zhì)譜鑒定蛋白分類

功能分類Functionalelassification數(shù)量Number比例Proportion/%蛋白編號Proteincode脅迫應答和抗氧化Stressresponseandantioxidant2030.30HC21、HC19、L26、R41、R147、R158、R160、R248、R261、R264、R265、R289、R291、R300、R305、R307、R336、R354、R361、R389蛋白代謝和修復Proteinmetabolismandrepair710.61HC40、R2、R18、R95、R150、R195、R42能量和糖代謝Energyandglucosemetabolism710.61HC8、L5、L70、R8、R149、R284、R315信號轉(zhuǎn)導與細胞凋亡Signaltransductionandcellapoptosis11.52L1細胞骨架的重構(gòu)Thereconstructionofthecytoskeleton46.06HC29、L12、R217、R244調(diào)控蛋白Regulatoryprotein34.55L7、L34、L49氨基酸代謝Aminoacidmetabolism11.52HC7脂類代謝Lipidmetabolism11.52HC18核酸代謝Nucleicacidmetabolism23.03R179、R215維生素代謝Vitaminsmetabolism11.52R216未知蛋白Unknownprotein1928.79HC1、HC11、HC24、R5、R52、R60、R65、R71、R73、R167、R169、R177、R189、R203、R252、R257、R265、R266、R312、R355

2.3.2蛋白代謝和修復相關(guān)蛋白龍眼FEC生長過程中共鑒定到蛋白代謝和修復相關(guān)酶7個。在生長前期,細胞分裂迅速,愈傷組織體積和重量生長也非常迅速,即前期(10～20 d)是龍眼FEC快速增殖期,因此,此時也很可能是蛋白質(zhì)大量合成并行使功能的主要時期。此時與蛋白質(zhì)合成及修復相關(guān)的蛋白就會大量表達,主要有4種,分別是二硫化物異構(gòu)酶、延伸因子類似蛋白、GTP結(jié)合蛋白和蛋白質(zhì)異形體1,且表達量最高的是二硫化物異構(gòu)酶,最低的是GTP結(jié)合蛋白。在培養(yǎng)20 d時,蛋白酶體β亞基7、10和α亞基也有表達,且蛋白表達相對值超過0.3。到生長30 d時,只有蛋白質(zhì)異形體1表達量升高,其余都降低或者消失。而到生長后期(40～50 d)各種蛋白合成及修復的相關(guān)酶已經(jīng)不表達或者很少,只有蛋白酶體α亞基和60s酸性核糖體蛋白還有少量表達,表達量百分含量低于0.3(圖2)。表明在龍眼FEC生長后期細胞漸漸衰老,生命力減弱。

2.3.3能量和糖代謝相關(guān)蛋白在龍眼松散型胚性愈傷組織生長的整個過程中,為各種生命活動提供能量是必不可少的,因此能量代謝一直貫穿于生長到衰老的整個過程中。不同的與能量和糖代謝相關(guān)的酶參與了不同的生理活動。已經(jīng)鑒定出的7種能量與糖代謝相關(guān)蛋白在龍眼FEC整個生長過程中表達量都很高,在培養(yǎng)10 d時RuBisCo大亞基結(jié)合蛋白β亞基和2個烯醇化酶的表達量很高,到培養(yǎng)20 d時磷酸甘油酸酯激酶和烯醇化酶HC8的表達量依然很高,最高達到1.0以上,到30 d時NAD-蘋果酸脫氫酶也表現(xiàn)出了相對高的表達量,到后期線粒體F1-ATP酶β亞基、烯醇化酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ表達量還是比較高,直到50 d時磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ還有大量表達(圖3)。

2.3.4核酸代謝相關(guān)蛋白龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程相關(guān)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果中,有兩個核酸代謝相關(guān)蛋白,這兩種蛋白的表達量趨勢基本相似,大量表達都集中在培養(yǎng)30 d時,且二磷酸核苷激酶的表達量最高,超過1.4,其次是轉(zhuǎn)錄輔助蛋白,在20和40 d時二磷酸核苷激酶也有表達?？赡茉诖穗A段有相關(guān)核酸蛋白的合成,而使核酸代謝相關(guān)蛋白大量表達(圖4)。

表3　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中脅迫應答和抗氧化類群蛋白表達變化模式

圖2　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中

2.3.5細胞骨架的重構(gòu)相關(guān)蛋白肌動蛋白和肌球蛋白以及微管蛋白都是細胞骨架的主要成分,為細胞質(zhì)流動、細胞器運動、物質(zhì)運輸、有絲分裂、胞質(zhì)分裂和細胞的頂端生長等提供所需的力。在龍眼FEC生長過程中,質(zhì)譜鑒定成功的蛋白包含肌動蛋白、Ⅱ類重鏈肌球蛋白、類肌球蛋白以及α-微管蛋白各1個,并且都是在培養(yǎng)30 d時有大量表達,且Ⅱ類重鏈肌球蛋白的表達更多?？赡芘c此時期細胞生理活動發(fā)生變化有關(guān)(圖5)。

圖3　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中

圖4　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中

圖5　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中

2.3.6調(diào)控蛋白龍眼FEC生長過程中共有3個調(diào)控蛋白,在賴呈純等[7]的研究中已鑒定出來,分別是α多肽類似蛋白3、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白,龍眼FEC生長過程中主要集中在20～30 d表達(圖6),表達量由高到低依次是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、α多肽類似蛋白3、肌動蛋白結(jié)合蛋白,且肌動蛋白結(jié)合蛋白開始表達的時間要比肌動蛋白表達的時間提前(圖5和圖6),可能肌動蛋白結(jié)合蛋白的主要作用是調(diào)控后續(xù)肌動蛋白等相關(guān)表達。

2.3.7信號轉(zhuǎn)導與氨基酸、維生素、脂類代謝相關(guān)蛋白龍眼FEC生長過程中質(zhì)譜鑒定到信號轉(zhuǎn)導與細胞凋亡相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白、維生素代謝相關(guān)蛋白和脂類代謝相關(guān)蛋白各有一個,分別為S-腺苷甲硫氨酸合成酶、雷帕霉素靶蛋白激酶、胞質(zhì)型的半胱氨酸合成酶7和煙草烯脂酰-ACP還原酶,并且除S-腺苷甲硫氨酸合成酶在30 d時有大量表達,其他主要都是在40 d時可以檢測到表達,雷帕霉素靶蛋白激酶在50 d時有少量表達(圖7) 。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是人體和其他生物體內(nèi)的主要甲基供體(它為體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、核糖核酸和維生素B12提供甲基),也是多胺代謝中的重要合成前體,其他代謝相關(guān)蛋白在后期表達可能是進入衰老階段時,主要靠這些酶來維持基礎代謝。

圖6　龍眼松散型胚性愈傷組織生長

圖7　龍眼松散型胚性愈傷組織生長過程中信號

3討論

3.1能量和糖代謝是龍眼松散型胚性愈傷組織生長的基礎

在龍眼FEC生長的整個過程中(培養(yǎng)0～50 d),質(zhì)譜鑒定成功的能量代謝相關(guān)蛋白共有7個,包括2個烯醇化酶,NAD-蘋果酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶、RuBisCO大亞基結(jié)合蛋白β亞基、線粒體F1-ATP酶β亞基各1個。NAD-蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶、三羧酸循環(huán)是依賴氧氣的供能方式。烯醇化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶都參與糖酵解,是糖酵解過程重要的幾個酶。糖酵解是在氧氣不足條件下,將葡萄糖或糖原分解為乳酸,并釋放少量ATP的過程。RuBisCO有雙重調(diào)節(jié)功能,在CO2濃度高時起羧化作用,而在O2濃度高時起加氧作用。ATP酶催化ATP轉(zhuǎn)化成ADP釋放能量是細胞生命活動最直接的能量來源。

龍眼FEC生長過程早期(10～20 d)表達的酶有烯醇化酶、NAD-蘋果酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶及RuBisCO大亞基結(jié)合蛋白β亞基。RuBisCO大亞基結(jié)合蛋白β亞基在10～30 d的表達量逐漸下降,可能是在早期細胞增值快,細胞活性高,呼吸作用強烈,在狹小的空間里氧氣會供應不足,RuBisCO可以適當平衡CO2/O2濃度,保證呼吸作用正常進行,并且由于氧氣缺乏,細胞主要以糖酵解-三羧酸循環(huán)方式供能,以促進快速生長。烯醇化酶催化從2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸的酶,兩種烯醇化酶HC8和L70分別在生長早期開始大量表達且分別在30 d和40 d時表達量最高,可能主要與其參與糖酵解過程有關(guān)。胞質(zhì)型磷酸甘油酸酯激酶(cytosolic phosphoglycerate kinase,PGK)幾乎存在于所有的生物中,并且高度保守[14]。其表達量在生長20 d時最高,在30 d之后逐漸下降,與其功能相關(guān),它也是參與糖酵解的重要酶,可以催化ATP和ADP之間的轉(zhuǎn)化,實現(xiàn)能量之間的傳遞。

磷酸丙糖異構(gòu)酶Ⅱ主要在后期(40～50 d)表達,并且呈上升趨勢,說明到后期可能由于氧氣的缺乏主要以糖酵解過程為主提供胚性愈傷組織生長發(fā)育所需要的能量消耗。ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶,是一類能催化三磷酸腺苷(ATP)水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的酶,并且釋放能量。在龍眼愈傷組織生長30 d時檢測到表達,且到40 d時,檢測到線粒體F1-ATP酶β亞基的大量表達。在龍眼體細胞胚發(fā)生過程中,也檢測到該酶轉(zhuǎn)錄水平的規(guī)律變化[15]。線粒體內(nèi)膜的內(nèi)表面有直徑為90埃的球狀顆粒一般被稱為偶聯(lián)因子1(F1),F1有ATP酶活力,缺失F1的線粒體內(nèi)膜制劑會失去氧化磷酸化能力,加入F1則可恢復此能力?？梢娋€粒體F1-ATP酶β亞基對構(gòu)成完整的ATP酶并保證其活力有重要意義。

3.2蛋白質(zhì)合成與修復是保證龍眼松散型胚性愈傷組織正常生長的物質(zhì)基礎

蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎,是機體細胞的重要組成部分。不同的結(jié)構(gòu)和性狀可以構(gòu)成功能不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以參與基因表達的調(diào)節(jié),以及細胞中氧化還原、電子傳遞、神經(jīng)傳遞乃至學習和記憶等多種生命活動的過程。尤其在生命活動旺盛的細胞中更需要蛋白質(zhì)的參與,所以蛋白質(zhì)的大量合成也多發(fā)生在細胞活力旺盛的細胞中。

龍眼FEC生長早期有多種蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶的表達,鑒定到的有7個,分別是二硫化物異構(gòu)酶、延伸因子類似蛋白、蛋白質(zhì)異形體1、蛋白酶體兩類亞基、酸性核糖蛋白。從整體表達趨勢來看以早期大量表達為主,后期也有蛋白酶體和酸性核糖蛋白的表達,但是表達量很少。在龍眼FEC生長到10 d時二硫化物異構(gòu)酶、延伸因子類似蛋白、蛋白質(zhì)異形體1、GTP結(jié)合蛋白都擁有最高表達量,除蛋白質(zhì)異形體1在40 d時降到最低點,其他都在30 d時表達量就降到最低。

GTP結(jié)合蛋白(GTP binding protein,G蛋白),與GTP或GDP結(jié)合的蛋白質(zhì),又叫鳥苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白(guanine nucleotide-binding regulatory protein),它參與細胞的多種生命活動,如細胞通訊、核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合、小泡運輸、蛋白質(zhì)合成等。在龍眼FEC生長早期鑒定到GTP結(jié)合蛋白的表達,推測與細胞快速增值時蛋白質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導等需要有關(guān)。龍眼FEC生長10～30 d都有不同程度表達量推定的蛋白質(zhì)異形體1(hypothetical protein isoform 1),且以10 d時表達量最高。蛋白質(zhì)異形體(protein isoform)是一些功能上相關(guān),而結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)形式。例如由同種mRNA前體經(jīng)可變剪接可以產(chǎn)生功能相關(guān)的不同蛋白質(zhì)。延伸因子(elongation factor,EF)是參與蛋白合成過程中肽鏈延伸的蛋白因子,在蛋白質(zhì)合成過程中,幫助進入的氨基酸殘基與肽鏈之間形成?；?使肽鏈得以延長。延伸因子類似蛋白(elongation factor-like prote)在龍眼胚性愈傷組織生長前期被發(fā)現(xiàn)有表達,可能與快速生長時蛋白質(zhì)的大量合成有關(guān)。二硫化物異構(gòu)酶(disulfide isomerase)是存在于真核生物細胞質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的一種酶,它可以催化形成或斷裂蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,以保證蛋白質(zhì)能迅速而準確地完成折疊。二硫化物異構(gòu)酶在蛋白質(zhì)折疊中扮演著重要角色[16]。

在龍眼FEC生長過程中發(fā)現(xiàn)了蛋白酶體的兩類亞基,蛋白酶體α亞基和β亞基7、10,都是在組織培養(yǎng)20 d時有大量的表達。蛋白酶體是存在于胞質(zhì)溶膠中的一類結(jié)構(gòu)和功能保守的蛋白酶解復合物,在真核生物和古菌中普遍存在的,蛋白酶體是細胞用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)和除去錯誤折疊蛋白質(zhì)的主要機制。經(jīng)過蛋白酶體的降解,蛋白質(zhì)被切割為約7～8個氨基酸的肽段;這些肽段可以被進一步降解為單個氨基酸分子,然后被用于合成新的蛋白質(zhì)。

從不同酶不同時間的表達可以看出10～20 d是龍眼FEC快速生長增值的階段,到30 d時表達量開始下降,可能是一個轉(zhuǎn)折期,后期表達量和酶的種類都減少,可能細胞的生長漸趨緩慢甚至停止。因此繼代培養(yǎng)或者用于做細胞培養(yǎng)時,龍眼FEC最晚取20 d時的材料。

3.3細胞骨架和調(diào)控蛋白是維持龍眼松散型胚性愈傷組織生命活動的重要物質(zhì)

在龍眼FEC生長旺盛的中期鑒定到4種與細胞骨架重構(gòu)相關(guān)的蛋白和3種調(diào)控相關(guān)蛋白,都在20～30 d有大量表達,之后便逐漸減少。此時表達的Ⅱ類重鏈肌球蛋白(myosin class Ⅱ heavy chain)、類肌球蛋白XIC(myosin-like protein XIC)、肌動蛋白、α-微管蛋白都是構(gòu)成細胞骨架系統(tǒng)的主要成分,在細胞運動、細胞分裂、受精作用、基因表達和信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換以及維持細胞形態(tài)等方面都具有重要作用。

而3種調(diào)控相關(guān)蛋白:新生多肽相關(guān)復合物α亞基類似蛋白3(Alpha-NAC-like protein 3)、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白及肌動蛋白結(jié)合蛋白均為賴呈純等[7]鑒定得到的。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物中作為核DNA的主要組分含量豐富,玉米49%～78%的基因組由逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子構(gòu)成[17]。小麥基因組68%是轉(zhuǎn)座子[18]。轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白則與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RNA、蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及包裝成適當?shù)男螤钜哉系交蚪M中有關(guān)[19]。肌動蛋白結(jié)合蛋白是一類調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合、成束或交聯(lián)的蛋白質(zhì),能將肌動蛋白絲與細胞漿和細胞膜的其他成分相連接[20],從而介導細胞形態(tài)的維持、細胞運動等眾多生物學功能[21]。

新生多肽相關(guān)復合物α亞基類似蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似的序列,且報道有催化加強c-Jun-mediated的轉(zhuǎn)錄的功能,在荔枝體胚發(fā)生初期[22]和龍眼體胚發(fā)生早期[7]都能檢測到它的大量表達,但目前的研究對其生物學功能尚不能完全解釋,推測其亞單位對基因的轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用[23]。

在龍眼FEC生長的旺盛時期,細胞骨架相關(guān)蛋白和調(diào)控蛋白的大量表達,對于細胞快速分裂,維持細胞形態(tài)以及運動等生命活動起到重要作用。

3.4從蛋白質(zhì)水平解釋龍眼松散型胚性愈傷組織的衰老機制

蛋白質(zhì)是一切生命活動的體現(xiàn)者。蛋白質(zhì)組是一個體系(包括細胞、亞細胞器、體液等)中的所有蛋白質(zhì),更能體現(xiàn)一個系統(tǒng)或組織的生命活動。從龍眼松散型胚性愈傷組織生長的不同階段表達的蛋白質(zhì)可以看出,主要是與細胞生長、分化、代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡和抗逆性等功能相關(guān),這充分反映了龍眼松散型胚性愈傷組織生長發(fā)育的生物學過程。

在成功鑒定的蛋白質(zhì)中,有占鑒定成功的總蛋白數(shù)30.30%的蛋白與脅迫應答和抗氧化相關(guān)。12個過氧化物酶,三類抗壞血酸過氧化物酶(共5個),谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氧化還原蛋白、芐基醚還原酶同系物TH6各1個。在龍眼FEC整個生長過程中的不同時期都有抗氧化相關(guān)酶的表達,在早期表達的有3個抗壞血酸過氧化物酶,芐基醚還原酶同系物TH6,可及時清除生理代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基,維持細胞內(nèi)氧化脅迫壓力平衡。芐基醚還原酶可以催化異黃酮類和木酚素的生物合成,芐基醚還原酶同系物TH6,是催化異黃酮類和木酚素生物合成還原酶類的同系物[24],異黃酮和木酚素不僅能促進心材的快速生長,并且在植物防御方面也起到很大作用[25]。該酶在胚性愈傷組織培養(yǎng)10 d時就被檢測到有大量表達,可能還與細胞生長及分化相關(guān)。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)是利用抗壞血酸(AsA)為電子供體清除H2O2的一類酶。在鑒定成功的酶中,有3類抗壞血酸過氧化物酶:除抗壞血酸過氧化物酶外還有細胞質(zhì)抗壞血酸類過氧化物酶1和類囊體結(jié)合抗壞血酸過氧化物酶,抗壞血酸過氧化物酶R147、R158和類囊體結(jié)合抗壞血酸過氧化物酶主要在前30 d內(nèi)有大量表達,而之后主要表達的是抗壞血酸過氧化物酶R361和細胞質(zhì)抗壞血酸類過氧化物酶1?？梢娫谡麄€培養(yǎng)過程中從10～50 d都有不同的APX表達以發(fā)揮主要作用。

在中期過氧化氧化還原蛋白和兩類抗壞血酸類過氧化物酶有少量表達,可能是細胞的生理狀態(tài)開始發(fā)生改變,生長速度有所降低,細胞活力也開始下降,對脅迫也開始有應答,因此在此階段表達的氧化脅迫酶種類和表達量都不高。而過氧化氧化還原蛋白(Prx)也是一種重要的氧自由基清除劑,研究證明寄生植物體內(nèi)該酶是清除過氧化氫(H2O2)最重要的酶。Sayed等[26]對曼森吸血蟲(Schistosomamansoni)Prx mRNAs的定量監(jiān)控表明,在整個生活周期中Prx都有不同程度的表達,尤其以成熟期表達量最高。推定的prx-1、prx-2、prx-3在龍眼FEC生長后期有表達,可能主要參與清除氧自由基。

到后期隨著細胞衰老的加劇,累積的氧自由基需要清除,表達出大量過氧化物酶4和兩個抗壞血酸過氧化物酶來行使抗氧化延緩衰老的生理機制。過氧化物酶(POD)是存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶。催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化,一般老化組織中活性較高,幼嫩組織中活性較弱。在龍眼FEC生長過程中共鑒定到12個過氧化物酶,也表現(xiàn)出在生長前期少量表達,主要集中在40～50 d時大量表達。這些過氧化物酶分別在不同的發(fā)育階段起主導作用,以保持細胞內(nèi)氧化脅迫壓力平衡。對龍眼FEC生長過程中脅迫應答與抗氧化以及其他相關(guān)蛋白的研究,可以作為解決龍眼FEC長期繼代過程中衰老問題的參考,為長期繼代保存延緩衰老提供思路。

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(編輯:宋亞珍)

Analysis of Protein Expression during Growth Processes

of Friable Embryogenic Callus(FEC) of Longan

LI Ran,LAI Zhongxiong*,LAI Chengchun,FANG Zhizhen,LIN Yuling,

LIU Shengcai,CHEN Yukun,ZHANG Zihao

(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Using friable embryogenic callus(FEC) ofDimocarpuslonganLour.cv.Honghezi as the material,we carried out the proteomic analysis of its growth processes by using the immobilized pH gradients two-dimensional electrophoresis technology and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF).The results showed that:(1)The total protein was from 400 to 800 during longan FEC development,and it showed a rising trend in general although its variation trend had in fluctuation.Isoelectric point of all proteins was distributed between 4 and 7.Molecular weight of proteins of FEC during the normal development in longan was within 14-97 kD.The protein expression quantity was at relatively high within 30-66 kD,but within 30-45 kD it showed a rising trend and within 45-66 kD it showed a reverse trend.(2)Sixty-six proteins related to longan FEC development were identified.28.79% of the proteins were unknown identity or function,30.30% of the proteins participated in stress response and anti-oxidation,10.61% of the proteins were involved in energy and carbohydrate metabolism,10.61% of the proteins belonged to protein synthesis related,6.06% of the proteins were structural proteins involved in cytoskeleton remodeling,4.55% of the proteins were regulatory proteins,3.03% of the proteins were enzymes involved in nucleic acid metabolism.Additionally,1.52% of the proteins were associated with signal transduction and PCD,1.52% of the proteins were related to amino acid metabolism,1.52% of the proteins were lipid metabolism-related protein,and 1.52% of the proteins attached themselves to vitamin metabolism.(3)In the early stage(10-20 d),the expression of redox proteins associated with FEC in longan(including ascorbate peroxidase R147,R158 and HC21,phenylcoumaran benzylic ether reductase homolog TH6,glutathione peroxidase and peroxidase L26) was high,while the expression of peroxidase 4 was in late stage(40-50 d).Protein synthesis-related proteins showed a expression peak within 20 d,besides protein isoform 1 within 30 d.Different energy-associated proteins expressed more abundantly during whole period.There were S-adenosylmethionine synthetase(the enzyme related to precursors of polyamine) and a large number of peroxidase expression at the later stage of longan FEC development.It explained that the polyamine has not only the function like peroxidase for scavenging active oxygen,but enhance the activities of antioxidant enzymes.

Key words:longan;friable embryogenic callus;proteome;mass spectrometry

中圖分類號:Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:李然(1984-),女,碩士,主要從事植物分子生物學研究。*通信作者:賴鐘雄,博士,研究員,主要從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究。E-mail:laizx01@163.com

基金項目:國家自然科學基金(31272149,31071787,31201614);福建省重大科技平臺建設(2008N2001)

收稿日期:2014-07-29;修改稿收到日期:2014-11-14

文章編號:1000-4025(2015)01-0107-11

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0107