吳錦萍 李鵬飛綜述 張春兵, ，#審校

Toll樣受體對缺血性腦卒中的作用及中醫(yī)藥干預(yù)*

吳錦萍1李鵬飛2綜述 張春兵1, 2，#審校

Toll樣受體(TLRs)通過與相應(yīng)配體結(jié)合，通過介導(dǎo)多種信號通路在缺血性腦卒中的病理生理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。本文綜述近年國內(nèi)外有關(guān)TLRs對缺血性腦卒中的作用及中醫(yī)藥干預(yù)對腦缺血保護(hù)的研究進(jìn)展。

Toll樣受體；缺血性腦卒中；中醫(yī)藥

腦卒中(Stroke)又稱腦中風(fēng)或急性腦血管意外，是一組急性起病，以局灶性彌漫性腦功能缺失為特征的腦血管病[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中約占腦血管病的87%[2]，其中約75%由于血栓栓塞腦血管，使腦血流量減少，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，引起神經(jīng)細(xì)胞功能改變，甚至神經(jīng)細(xì)胞壞死[3]。

研究[4]表明，缺血性腦卒中損傷是一個多環(huán)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)過程，主要涉及興奮性氨基酸神經(jīng)毒性作用、氧化應(yīng)激作用、鈣離子超載、免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。腦缺血后，受損腦組織啟動固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎性細(xì)胞活化和炎性介質(zhì)釋放[5-7]，誘導(dǎo)缺血區(qū)炎癥反應(yīng)。黏附分子家族如整合素、選擇素、免疫球蛋白超家族等介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等外周白細(xì)胞遷移并浸潤于受損腦組織，促進(jìn)炎性介質(zhì)如促炎因子白介素(Interleukin，IL)家族、腫瘤壞死因子(Tumor Necross Factor，TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)、一氧化氮(Nitric Oxide, NO)、活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)等的釋放，這些炎性介質(zhì)能破壞血腦屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)結(jié)構(gòu)，加重缺血腦組織損傷，促進(jìn)炎性細(xì)胞活化與浸潤，級聯(lián)放大炎癥損傷。

Toll樣受體(Toll-Like Receptors, TLRs)作為進(jìn)化上保守的分子家族，能夠直接識別病原體感染及組織損傷，進(jìn)而啟動免疫應(yīng)答。TLRs不僅在免疫細(xì)胞，也在一些非免疫細(xì)胞如神經(jīng)元上表達(dá)，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，如腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞的活化均需要TLRs信號通路的啟動。因此，近年來對TLRs參與缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的觀察與研究不斷增加和深化。中醫(yī)藥作為臨床治療缺血性腦卒中的重要方法，可多途徑、多靶點(diǎn)干預(yù)TLRs信號通路，抑制缺血性腦卒中炎癥損傷，已成為臨床研究的重要課題。

1 TLRs結(jié)構(gòu)及其配體

1.1 TLRs的結(jié)構(gòu)

TLRs是一類模式識別受體(Pattern Recognition Receptors, PRRs)，因與果蠅體內(nèi)Toll蛋白有高度同源性而得名。目前在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)10種TLRs(TLR1-10)[8]，TLR11-13只存在于鼠科動物體內(nèi)，其功能尚未明確[9]。TLRs為Ⅰ類跨膜蛋白受體，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三部分組成。胞內(nèi)區(qū)是由約200個氨基酸組成的高度保守區(qū)域，其C端與人IL-1受體家族胞質(zhì)區(qū)高度同源，因而被稱為TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1 Receptor Homologous Region)，TIR結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)下游信號通路；LRS N端胞外區(qū)形似馬蹄，富含亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich Repeat, LRR)，約含550-980個氨基酸；跨膜區(qū)主要由半胱氨酸組成。

1.2 TLRs的相應(yīng)配體

TLRs主要通過識別外源性與內(nèi)源性配體啟動免疫應(yīng)答。外源性配體是分布在病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等病原體上的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated Molecular Paterns,PAMPs)，均直接或間接來源于病原體[10]。TLR2與TLR1、TLR6組成異二聚體，分別識別組成細(xì)菌胞壁的三酰脂蛋白和二酰脂蛋白；TLR3可識別宿主細(xì)胞內(nèi)RNA病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA(Double Strands RNA，dsRNA)；TLR4主要識別革蘭陰性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)；TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白；TLR7、TLR8均可識別單鏈RNA(Single Strands RNA，ssRNA)；TLR9可與細(xì)菌和病毒內(nèi)的非甲基化嘌呤磷酸嘧啶DNA(Cytosine-phosphate-guanine Containing DNA，CPG DNA)結(jié)合，激活下游信號通路；TLR10可識別流感病毒[11]。

損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated Molecular Patterns，DAMPs)是機(jī)體在應(yīng)激、損傷和細(xì)胞非凋亡性死亡等情況下釋放的內(nèi)源性分子。TLRs識別DAMPs后，可介導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)組織損傷和修復(fù)[12]。TLRs可識別的內(nèi)源性分子即內(nèi)源性配體主要包括蛋白分子、脂肪酸分子、脂蛋白、核酸以及蛋白核酸復(fù)合物。透明質(zhì)酸、高遷移率族蛋白(High Mobility Group Box-1，HMGB1)、熱休克蛋白60(Heat Shock Protein 60，HSP60)、HSP90可激活TLR2和TLR4。另外，TLR4還能特異性識別表面活性蛋白A、纖維蛋白原、纖維連接蛋白A等。TLR3、7、8、9主要識別dsRNA、ssRNA、DNA等核酸分子[13]。

2 TLRs介導(dǎo)的信號通路

TLRs介導(dǎo)的信號通路主要是髓樣分化分子88 (Myeloid Differentiation Factors88，MyD88)依賴信號通路和TIR受體功能區(qū)接頭介導(dǎo)的干擾素-β(TIR Domain-containing Adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依賴信號通路,如圖1[14]。

圖1 TLR1-9信號通路

2.1 MyD88依賴信號通路

TLRs識別相應(yīng)配體后，引起胞內(nèi)域TIR結(jié)構(gòu)域二聚體化，招募具有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子，如MyD88、TRIF、TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related ,Adaptor Molecule，TRAM)等。研究發(fā)現(xiàn)除TLR3不依賴于MyD88信號通路介導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之外，其余TLRs均通過MyD88依賴通路向下游介導(dǎo)核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of Activated B-cells，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)產(chǎn)生炎性因子[15]。MyD88可被TIR受體結(jié)構(gòu)域的適配蛋白(TIR Domain-containing Adaptor Protein, TIRAP)招募到TLR2、4、5、6中，而TLR7、8、9可不需要中間接頭分子，直接招募，并且兩者下游信號通路也不同。MyD88被TIRAP招募后，死亡結(jié)構(gòu)域與IL-1受體相關(guān)激酶4(Interleukin-1 Receptor Associated Kinase 4，IRAK4)的死亡結(jié)構(gòu)相互作用，誘導(dǎo)IL-1受體相關(guān)激酶1(Interleukin-1 Receptor Associated Kinase，IRAK1)自主磷酸化。IRAK1磷酸化可導(dǎo)致TNF受體相關(guān)因子6(Tumor Necrosis Factor Receptor-associated Factor6，TRAF6)和E2泛激素蛋白連接酶活化。轉(zhuǎn)化生長因子-β活化酶(Transforming Growth Factor-β Activated Kinase，TAK-1)和TAK結(jié)合蛋白(TAK Binding Proteins，TABs)相互作用形成復(fù)合體的活化需要TRAF6誘導(dǎo)?；罨腡AK-1和TAB復(fù)合體可向下激活MAPKp38、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Extracelluar Signal-regulated Kinase1/2，ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2(C-Jun NH2-terminal Kinase，JNK1/2)三條級聯(lián)通路，同時還可磷酸化IkB (NF-κB抑制酶) 并使之發(fā)生降解，導(dǎo)致NF-κB核移位，啟動炎性因子的轉(zhuǎn)錄。位于核內(nèi)體的TLR7、8、9直接招募MyD88后，刺激TRAF6活化干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon Regulatory Factors7，IRF7)表達(dá)，介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

2.2 TRIF依賴信號通路

TLR4通過TRIF與TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related Adaptor Molecule,TRAM)相互作用，而TLR3不需要中間接頭蛋白，直接作用于TRIF進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TRAF3 N端機(jī)構(gòu)與TRIF相互結(jié)合后被活化，活化的TRAF3作用于TRAF聯(lián)合NF-κB激酶 (TRAF Joint NF-κB Kinase，TANK) 結(jié)合激酶l (TANK-binding Kinase l，TBKl)/IκB激酶i (IκB Kinase i，IκKi) 復(fù)合體，誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon Regulatory Factors 3，IRF3)磷酸化并且核內(nèi)移。活化的IRF3可誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN-β和炎性因子的表達(dá)。TLR4信號通路較為復(fù)雜，除了介導(dǎo)TRIF/IRF3信號通路外，還可介導(dǎo)TRIF延遲活化TRAF6，延遲下游MAPK和NF-κB信號傳導(dǎo)[16]。

3 TLRs對缺血性腦損傷的作用

3.1 TLRs在腦組織中的表達(dá)

TLRs廣泛分布于腦組織中，參與腦組織炎癥損傷。研究[17]發(fā)現(xiàn)TLRs主要分布在抗原提呈細(xì)胞如B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，識別相應(yīng)配體后啟動固有免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)。也有研究證實，TLRs還可表達(dá)于內(nèi)源性免疫細(xì)胞。Hanke等[18]認(rèn)為TLR1-TLR9在人腦實質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，TLR2、TLR3和TLR9在星形膠質(zhì)細(xì)胞上也有表達(dá)。此外，神經(jīng)元細(xì)胞、少突細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞也可表達(dá)TLRs；神經(jīng)元細(xì)胞可表達(dá)TLR2、3、4、8和9；在外界刺激時TLR2、4、9可高表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞；少突細(xì)胞也可少量表達(dá)TLR2、TLR3[19]。因此，TLR可表達(dá)在外周及中樞神經(jīng)的多種免疫細(xì)胞及實質(zhì)細(xì)胞上，發(fā)揮重要功能。

3.2 TLRs對缺血性腦損傷的作用

目前，國內(nèi)外對TLRs及其配體介導(dǎo)缺血性腦損傷機(jī)制的研究逐漸深入，但是對于TLRs在缺血性腦卒中損傷機(jī)制中的作用仍然存在爭議。目前研究較多的是TLR2、TLR3、TLR4、TLR9在腦缺血炎癥損傷中的作用，本文主要介紹TLR2和TLR4。

3.2.1 TLR2與腦缺血：Ziegler等[20]進(jìn)行了如下研究，采用腦缺血再灌注小鼠模型，與野生型C57B1/6小鼠相比，TLR2缺陷小鼠炎性細(xì)胞CD11b表達(dá)及缺血側(cè)神經(jīng)元損傷顯著減少；而阻斷TLR2抗體治療組與對照治療組腦缺血后梗死面積的減少無顯著性差異，但是前者能降低炎性細(xì)胞表達(dá)和減輕神經(jīng)元損傷。說明TLR2可介導(dǎo)炎癥信號通路，加重腦缺血后炎癥損傷。缺血性腦卒中體內(nèi)實驗[21]發(fā)現(xiàn)，TLR2缺陷小鼠體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖能力顯著降低，炎性細(xì)胞CD45/CD11b數(shù)量顯著減少。TLR2敲除小鼠腦缺血再灌注后梗死面積和死亡率顯著減少，可能與敲除TLR2無法活化P13K/Akt信號通路，缺血腦損傷減輕有關(guān)[22]。

3.2.2 TLR4與腦缺血： 很多實驗研究證實TLR4有介導(dǎo)缺血性腦卒中損傷作用。Suzuki等[23]發(fā)現(xiàn)實驗小鼠腦室內(nèi)注射TLRs信號抑制劑瑞沙托維可阻斷TLR4下游信號傳導(dǎo)。在體內(nèi)、體外阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的實驗表明，阻斷TLR4能抑制TNFα、IL-1β、iNOS等炎性因子的表達(dá)[24]。因此，阻斷TLR4抗體可誘導(dǎo)腦缺血耐受，保護(hù)神經(jīng)功能。Gao 等[25]觀察了腦缺血再灌注模型小鼠TLR4抗體阻斷不同時間腦組織MyD88的表達(dá)，結(jié)果顯示，TLR4可能通過MyD88依賴途徑介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷。 Hua 等[26]報道TRIF基因敲除小鼠的NF-κB活性、腦梗死面積和神經(jīng)功能評分與野生型小鼠無顯著性差別，提示TLR4可不依賴于TRIF信號，直接完成MyD88/NF-κB信號傳導(dǎo)。Brea 等[27]觀察了110例缺血性腦卒中患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)其與TLR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果顯示，TLR4參與缺血性腦卒中的病理過程。

3.2.3 其他TLRs與腦缺血： 除TLR2、TLR4以外，其余TLRs在缺血性腦卒中損傷中的作用仍未明確。Tang等[28]在體內(nèi)體外實驗中發(fā)現(xiàn)TLR8可能參與且加重缺血性腦卒中患者的腦組織損傷。Brea等[29]發(fā)現(xiàn)TLR7、8的表達(dá)與腦卒中患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而TLR3和TLR9的表達(dá)與腦卒中預(yù)后無關(guān)。Hyakkoku等[30]也發(fā)現(xiàn)TLR3、TLR9與缺血性腦卒中腦組織損傷無明顯關(guān)聯(lián)。

3.3 TLRs配體預(yù)處理在腦缺血中的作用

腦缺血耐受機(jī)制已經(jīng)成為缺血性腦卒中臨床和實驗研究的重點(diǎn)，也為臨床治療提供新的途徑[31]。TLRs配體預(yù)處理作為腦缺血耐受機(jī)制之一，可誘導(dǎo)缺血耐受，保護(hù)缺血后腦組織損傷。

有研究表明，制備腦缺血再灌注小鼠模型前12h注射TLR2外源性配體三酰脂肽(Pam3CysSerLys4，Pam3CSK4)，可使實驗組小鼠腦梗死面積、神經(jīng)功能評分、腦組織水腫較對照組顯著改善，死亡率降低[32]。Chen 等[33]報告TLR2配體預(yù)處理可促進(jìn)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低NF-κB活性，增加HSP27、HSP70、B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell Lymphoma，Bcl2)蛋白表達(dá)，從而有效保護(hù)腦組織損傷。

Marsh等[34]通過體內(nèi)、體外實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血前給予TLR4外源性配體脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可活化TRIF/IRF3信號通路，產(chǎn)生抗炎因子IFNβ，抑制腦缺血炎癥反應(yīng)對腦組織的損傷。Vartanian等[35]采用LPS預(yù)處理的實驗結(jié)果與前述相似，共同機(jī)制為LPS預(yù)處理活化TLR4后，NF-κB活性受到抑制，改變了TLR4信號通路方向，激活了IFN基因表達(dá)信號通路，因而拮抗腦缺血后炎癥損傷。

Leung等[36]在TNF和Ⅰ型IFN同源受體(IFNAR)缺陷小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，TLR7配體預(yù)處理可介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用，這種介導(dǎo)作用依賴于IFNAR產(chǎn)生抗炎因子IFN。Lu等[37]發(fā)現(xiàn)通過合成的TLR9外源性配體含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(Oligodexoxyuncleotides Containing A CpG-motif，CpG-ODN)預(yù)處理可誘導(dǎo)缺血性腦損傷耐受，減少腦梗死面積和神經(jīng)功能損害，降低腦缺血再灌注損傷。

而在缺血性腦卒中發(fā)生以后注射人工合成的TLR3配體聚肌胞苷( Polyinosinic :Polycytidylic Acid，Poly I :C )，則可通過TRIF依賴性途徑增加抗炎因子IFNβ表達(dá)水平，延遲TLR4/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少促炎因子TNFα、IL-1β mRNA表達(dá)，減少腦梗死面積，改善腦水腫和神經(jīng)功能[38]。

4 中醫(yī)藥對腦卒中TLRs信號通路的干預(yù)作用

中醫(yī)資源豐富，經(jīng)濟(jì)安全，可以有效預(yù)防和治療缺血性腦卒中。中醫(yī)藥干預(yù)腦卒中炎癥損傷的TLRs信號通路成為近年研究熱點(diǎn)，主要包括中藥單體、復(fù)方制劑、針灸等中醫(yī)藥干預(yù)方式。

4.1 中藥單體

劉荷蘭等[39]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可以抑制大鼠腦組織中TLR4和NF-κB基因的表達(dá)，抑制TLR4/NF-κB信號通路的傳導(dǎo)，下調(diào)炎癥基因的表達(dá)，進(jìn)而減輕缺血性腦卒中炎癥損傷。胡黃連苷Ⅱ亦可干預(yù)TLR信號通路，有效改善腦缺血后神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞壞死[40]。黃芩苷具有清熱、燥濕、解毒功效，可抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號中重要分子TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)，減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低腦組織損傷[41]。

4.2 復(fù)方制劑

補(bǔ)陽還五湯已經(jīng)廣泛應(yīng)用于氣虛血瘀型中風(fēng)患者的治療。周賽男等[42]的實驗結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯干預(yù)組TLR4蛋白和其mRNA濃度均低于卒中模型組，表明補(bǔ)陽還五湯是通過干預(yù)TLR4信號通路從而減少腦缺血炎癥反應(yīng)。腦塞脈方是以四顧湯為基礎(chǔ)研制成的中藥復(fù)方制劑，主要用于治療血管閉塞性脈管炎。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后大鼠經(jīng)腦塞脈方治療后，大鼠血清HMGB1、TNFα、IL-1β含量和海馬區(qū)NF-κB mRNA表達(dá)水平較模型組明顯降低，表明腦塞脈方具有顯著神經(jīng)保護(hù)作用[43]。

4.3 針灸

電針刺激腦卒中模型小鼠后發(fā)現(xiàn)受損腦組織中谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸含量和NF-κB水平顯著降低，表明電針治療可以合理調(diào)控腦缺血再灌注損傷的炎癥信號傳導(dǎo)[44]。眼針療法對腦缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，其機(jī)制為眼針治療可使MyD88蛋白的含量顯著減少，從而抑制其下游NF-κB信號通路的活化，減少炎性因子對腦組織的損傷[45]。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，TLRs在缺血性腦卒中損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。TLRs像一把“雙刃劍”，一方面介導(dǎo)炎癥信號通路釋放炎性因子，促進(jìn)腦卒中；另一方面TLRs配體預(yù)處理能保護(hù)缺血腦組織神經(jīng)功能。這為臨床治療缺血性腦卒中提供了新的理論依據(jù)。目前的研究大多集中在TLR2和TLR4，而對其它TLRs缺乏全面認(rèn)識，而且對于MyD88依賴和非依賴途徑及其它信號通路活化的精密調(diào)控機(jī)制也知之甚少。中醫(yī)藥干預(yù)缺血性腦卒中TLRs通路的研究已經(jīng)起步，寄望后續(xù)研究能進(jìn)一步為中醫(yī)藥作用提供新的理論依據(jù)和臨床經(jīng)驗。

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本文第一作者簡介：

吳錦萍(1989-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥治療腦缺血再灌注損傷

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1005-1740(2015)02-0066-05