付朝泓綜述 李 艷審校

BCR-ABL融合基因檢測在CML診斷及治療中的應用進展

付朝泓綜述 李 艷*審校

BCR-ABL融合基因是慢性粒細胞白血病(CML)的特異性腫瘤標志物，在CML的診斷和治療監(jiān)測中有重要作用。費城陽性(Ph+)染色體細胞或BCR-ABL融合基因數(shù)量的變化是評估CML的重要手段，臨床常用檢測方法有常規(guī)染色體分析、熒光原位雜交(FISH)和熒光定量PCR。常規(guī)染色體檢測用于CML初始治療獲得完全細胞學緩解(CCyR)的評價；FISH較常規(guī)染色體檢測更敏感且能可視化觀測Ph+染色體細胞；熒光定量PCR更加利于CML微小殘留病監(jiān)測。這些技術方法正在不斷滿足輔助診斷CML的臨床要求及進一步提升CML療效監(jiān)測和微小殘留病診斷水平。

BCR/ABL融合基因；慢性粒細胞白血病；診斷；治療監(jiān)測

慢性粒細胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML)是一種惡性骨髓增殖性疾病，占所有成人白血病的15%-20%[1,2]，主要特征是成熟和未成熟粒細胞的克隆性表達[1]。90%-95%的CML患者都能檢測到費城(Philadelphia, Ph)染色體和BCR-ABL融合基因[3]。在Ph染色體形成過程中，9號染色體長臂3區(qū)4帶(9q34)前癌基因c-ABL的3'端與22號染色體長臂1區(qū)1帶(22q11)斷裂點簇集區(qū)(Breakpoint Cluster Region，BCR)基因的5'端融合，在22號染色體上形成BCR-ABL融合基因，同時在9號染色體上形成無致病性的ABL-BCR融合基因[3]。BCR-ABL融合基因ABL激酶區(qū)的結(jié)構改變[3]，可過度激活膜受體酪氨酸蛋白激酶(Ras-Raf-MAPK)信號通路、膜受體磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT-mTOR)信號通路以及膜受體JAK激酶與信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(JAK-STAT)信號通路，上調(diào)白血病細胞的增殖和存活數(shù)量(圖1)，成為CML患者骨髓增生難以控制的主要原因[1,3]。

圖1 BCR-ABL融合基因的形成及致病通路[4]

目前檢測BCR-ABL融合基因或Ph+染色體的方法包括逆轉(zhuǎn)錄后直接測序法、Southen Blot、Western Blot、逆轉(zhuǎn)錄后普通PCR、常規(guī)染色體檢測、熒光原位雜交技術(FISH)以及以PCR技術為基礎的熒光定量PCR等。逆轉(zhuǎn)錄后直接測序法是檢測BCR-ABL融合基因最直接的方法，但是成本高、檢測時間長，常規(guī)應用于臨床受到一定限制。逆轉(zhuǎn)錄后普通PCR和Western Blot敏感性較低，Southern Blot需要使用放射性同位素，常應用于動物實驗。常規(guī)染色體檢測是最基礎的臨床輔助診斷CML的方法，三代FISH是常規(guī)染色體檢測的進步，尤其第三代FISH在Ph+染色體隱匿核型、變異核型、基因序列缺失的檢測中有一定優(yōu)勢，但是這兩種方法都不易檢測到CML患者治療后Ph+細胞殘留[5]，因此需要更敏感的熒光定量PCR進行分析，以利于對CML患者治療后微小殘留病的分子監(jiān)測。本文對上述常規(guī)染色體、FISH和熒光定量PCR檢測在CML診斷和治療監(jiān)測中的應用進展綜述如下。

1 常規(guī)染色體檢測在CML診斷及治療監(jiān)測中的應用

1.1 對CML的診斷作用

常規(guī)染色體檢測是通過染色體顯帶技術對分裂中期細胞染色體進行觀察并與正常染色體進行比對后對疾病進行診斷的一種方法。由于CML患者生存期從幾個月到十幾年，染色體會出現(xiàn)假二倍體、數(shù)量改變等異常核型。Muvarak等[6]認為BCR-ABL融合基因陽性CML患者有多種類型的基因不穩(wěn)定性，如DNA缺失、嵌入等，導致Ph染色體以外的染色體改變，且這種不穩(wěn)定性基因在異常造血干細胞內(nèi)的克隆先于Ph染色體發(fā)生，同時認為 BCR/ABL 基因還能促進這種遺傳不穩(wěn)定性。因此，常規(guī)染色體核型分析對CML患者診斷和分型等有重要作用。

1.2 對CML的治療監(jiān)測作用

常規(guī)染色體方法從細胞層面，將CML治療情況進行評價，依據(jù)Ph+分裂中期細胞所占比例將其分為少量細胞學緩解(35%-90%)、部分細胞學緩解(1%-34%)和完全細胞學緩解(Complete Cytogenetic Response, CCyR)(0%)，方法是在培養(yǎng)的CML骨髓細胞中觀測至少20個分裂中期細胞來計數(shù)最低Ph+細胞的數(shù)量，至少應檢測到一個Ph+細胞，即檢測下限為5%(1/20)[7]。CCyR是酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)治療中的首要目標和具有顯著預后價值的指標，臨床研究證實，CML患者通過TKI治療6個月后出現(xiàn)CCyR可判斷治療有效[8]；NCCN(National Comprehensive Cancer Network)指南[7]提出，TKI首次治療3個月，常規(guī)染色體檢測達到CCyR，也可視為治療有效。有數(shù)據(jù)表明，CML患者在急性加重期或急變危相期治療12個月后達到CCyR，提示患者預后較好[8]。

2 FISH在CML診斷及治療監(jiān)測中的應用

2.1 對CML的診斷作用

FISH是應用分子探針對至少200個分裂核細胞進行最低BCR-ABL融合基因陽性細胞檢測，至少應檢測到一個陽性細胞，即檢測下限為0.5%(1/200)，該方法對CML微小殘留病診斷有臨床應用價值[9]。FISH技術根據(jù)探針設計的發(fā)展進程分為第一代FISH、第二代FISH和第三代FISH。第一代FISH應用雙色信號融合探針技術來分析分裂中期和間期細胞的BCR-ABL融合基因，用紅色熒光標記ABL探針，用綠色熒光標記BCR探針，雜交染色后，在正常染色體，探針會與22號染色體ABL基因和9號染色體BCR基因結(jié)合，分別產(chǎn)生一個紅色和一個綠色信號；而在Ph+染色體，探針會使22號Ph+染色體ABL-BCR融合基因同時產(chǎn)生紅、綠雙色信號(雙色濾過后成為黃色)。FISH的優(yōu)勢在于實現(xiàn)單個細胞BCR-ABL融合基因的可視化，因此對CML的診斷比常規(guī)染色體檢測敏感性更高[10]。但由于平面視角的可重疊性，第一代FISH可出現(xiàn)假陽性及假陰性結(jié)果，從而限制了其對CML微小殘留病的診斷作用[11]。第二代FISH可避免這些假性結(jié)果，從而在CML殘留病中得到了應用。第三代FISH與第二代FISH的不同在于可根據(jù)對CML診斷目的不同而設計探針位置和熒光顏色，對Ph+染色體隱匿核型、變異核型、基因序列缺失的診斷有明顯優(yōu)勢。不過，F(xiàn)ISH無法發(fā)現(xiàn)CML進展期發(fā)生了改變的非Ph+染色體，必須結(jié)合常規(guī)染色體檢測對早期CML進行診斷。

2.2 對CML的治療監(jiān)測作用

第二代FISH的探針設計是利用650kb ABL大型探針聯(lián)合300kb BCR探針形成BCR-ABL雙色額外信號探針(ES)，Ph+染色體細胞上有2個黃色融合信號：一個在22號Ph染色體BCR-ABL融合基因上，另一個在9號染色體ABL-BCR融合基因上，可避免正常細胞假陽性和Ph+細胞假陰性結(jié)果，從而精確地從正常細胞中區(qū)分出Ph+細胞。第二代FISH對CML治療監(jiān)測價值在于對Ph+細胞總量的定量檢測及BCR-ABL融合基因精確檢測更準確，對TKI耐藥監(jiān)測中也得到很好的應用[12]。第二代FISH還能鑒定隱匿性5’-ABL缺失的Ph+慢性髓細胞白血病。

第三代FISH根據(jù)探針設計形成了三倍探針技術，應用不同顏色探針來分別標記5’-精氨酸合酶(ASS)和ABL，再聯(lián)合300kb BCR探針來檢測ABL及BCR-ABL融合基因中的重要缺失；或利用單獨顏色探針聯(lián)合300kb BCR探針跨越雙位點來檢測Ph+細胞，也可以用來監(jiān)測CML治療[13]。隨著更多顏色熒光染料的應用，一種多色FISH技術在白血病及相關腫瘤的診斷和治療中得到應用。多色FISH應用5種熒光染料，通過組合標記，使用全染色體涂染探針，結(jié)合特殊的濾色片及數(shù)字化成像技術，經(jīng)過熒光顯微鏡及專業(yè)化計算機分析系統(tǒng)，能準確分離和確認所有熒光標記的染色體，在白血病復雜核型研究方面得到了很好的應用，如對白血病細胞遺傳學演化特點、相互易位機制以及對微小殘留病細胞系的特點研究等[14]。

3 熒光定量PCR在ABL突變和CML微小殘留病療效監(jiān)測中的應用

3.1 ABL耐藥突變分析

在CML患者應用TKI治療期間，應用BCR-ABL 熒光定量PCR進行分子監(jiān)測，既能評價療效，又能發(fā)現(xiàn)TKI耐藥突變。體外耐藥試驗發(fā)現(xiàn)伊馬替尼(Imatinib)高頻率耐藥突變位點包括Y253H、E255K、T315I和F359C/V，低頻率突變位點包括M244V、L248V、G250E[15]，隨著TKI應用越來越廣泛，除了泛耐藥T315I突變外，其它ABL激酶區(qū)耐藥突變由二代TKI如尼洛替尼(Nilotinib)、坦桑替尼(Dasatinib)或布蘇替尼(Blsutinib)治療所引起[16]。T315I泛耐藥突變CML患者采用三代TKI泊松替尼(Ponatinib)療效較好[17-19]。

ABL激酶區(qū)TKI耐藥突變表現(xiàn)為BCR-ABL RNA水平升高，細胞異?？寺20]。Baccarani等[21]針對治療失敗病例、TKI效果欠佳病例、BCR-ABL RNA水平上升病例進行了耐藥分析，結(jié)果表明CML患者的臨床結(jié)局與ABL激酶區(qū)突變相關。在對治療失敗病例的分析中發(fā)現(xiàn)，ABL激酶區(qū)突變與疾病晚期、老年及治療12個月未獲得CCyR高度相關[21,22]。通過BCR-ABL熒光定量PCR監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，TKI耐藥突變常常是后天獲得性耐藥突變，而非原發(fā)性耐藥突變[23]。但BCR-ABL 熒光定量PCR監(jiān)測方法存在如下問題：一是BCR-ABL 熒光定量PCR敏感性較高，所監(jiān)測的BCR-ABL RNA高水平表達不一定都能真實反映耐藥克隆；另一方面，BCR-ABL 熒光定量PCR監(jiān)測在CML白血病細胞總數(shù)較低時檢測到的突變不能確定是暫時的或是非病理性的，因而無法確定患者是否需要改變治療方案[21,22]。所以，針對該方法檢測出來的突變結(jié)果應由臨床專家來解讀。

對于BCR-ABL熒光定量PCR監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的BCR-ABL RNA水平升高是否需要進行測序分析，應根據(jù)臨床治療情況而定。NCCN推薦對BCR-ABL RNA水平升高5-10倍的病例進行測序分析，特別是沒有獲得首要分子效應(Major Molecular Response,MMR)的CML患者[7]。但需特別指出的是，BCR-ABL RNA水平升高10倍者的測序分析可能缺乏敏感性，例如轉(zhuǎn)錄水平從0.0001%升高到0.001%，雖然升高了10倍，但測序分析也檢測不到突變結(jié)果。另外，熒光定量PCR監(jiān)測中，較低量級的BCR-ABL RNA水平上升可能丟失很多突變結(jié)果。Radich等[24]的研究表明，在低MMR水平中應用BCR-ABL 熒光定量PCR檢測時，因為BCR-ABL RNA只有很小幅度的升高，如從0.01%增加到0.02%，雖然只增加了一倍，而未能進行ABL激酶區(qū)的測序分析；當然也可以懷疑這種升高可能是實驗室檢測不精確引起的，如在1-3個月內(nèi)重復檢測就會出現(xiàn)這種現(xiàn)象[25]。故而會漏掉一些耐藥突變病例。

3.2 CML微小殘留病的治療監(jiān)測

白血病微小殘留病是指在白血病經(jīng)治療獲得CCyR后或骨髓移植治療后，體內(nèi)仍殘留有少量白血病細胞的狀態(tài)。此時，常規(guī)染色體檢測已難以檢出白血病細胞，但實際上患者骨髓內(nèi)的白血病細胞還存在，這些殘存的細胞即成為白血病復發(fā)的根源。

CML患者經(jīng)TKI治療后三個月是否達到CCyR，其體內(nèi)殘留的白血病細胞可用FISH進行檢測，但NCCN沒有將FISH作為TKI治療的敏感性監(jiān)測方法，特別是中期Ph+細胞在5%-10%之間的患者[7]。熒光定量PCR為NCCN所推薦，對CML微小殘留病有很高的評估價值。有研究表明，用熒光定量PCR檢測殘留白血病細胞總量水平能準確定義CCyR水平[26]。BCR-ABL 熒光定量PCR敏感性達到了0.001%-0.0001%，相當于在100 000-1 000 000個正常細胞中發(fā)現(xiàn)一個表達BCR-ABL RNA的細胞，因而能直接定量BCR-ABL RNA水平[24,26]。

熒光定量PCR檢測樣本包括外周血和骨髓，外周血抽取便利，監(jiān)測結(jié)果和臨床治療效果具有一致性[24]。NCCN指南推薦CML患者達到CCyR后應該每三個月進行一次BCR-ABL 熒光定量PCR檢測，用來監(jiān)測殘留白血病細胞有否上升、下降或處于穩(wěn)定狀態(tài)[26]。Marin等[27]對達到CCyR后患者每三個月應用熒光定量PCR檢測一次BCR-ABL RNA水平，發(fā)現(xiàn)BCR-ABL RNA水平和TKI長期治療相關，即TKI治療時間越長，BCR-ABL RNA水平越低。因此在已經(jīng)獲得CCyR的患者中應用BCR-ABL 熒光定量PCR進行早期復發(fā)監(jiān)測有很重要的積極意義。國際干擾素隨機研究實驗(IRIS)[27]對CML患者外周血進行的監(jiān)測顯示，BCR-ABL 熒光定量PCR可預測CCyR的穩(wěn)定性。該實驗對象為應用Imatinib治療達到CCyR后的CML患者，其BCR-ALB RNA水平較治療前下降大于1 000倍且有較長的無進展生存期(Progression-free Survival,PFS)，因此將CML患者經(jīng)治療達到CCyR后，BCR-ABL RNA水平降低1 000倍以上定義為達到CCyR的MMR，并作為治療的目標。還有研究指出，若CML患者的BCR-ABL RNA水平為陰性(不能檢測到BCR-ABL RNA表達)即為完全分子效應(Complete Molecular Response, CMR)，獲得CMR的患者比只獲得MMR的患者具有更長的PFS[26,28]，可作為CML治療的新目標。

3.3 熒光定量PCR國際標準

盡管BCR-ABL RNA檢測在TKI治療中具有很高的價值，但由于各個獨立實驗室所用PCR技術各有不同，實驗結(jié)果無法進行比較，因此對臨床治療監(jiān)測和不同研究數(shù)據(jù)的分析和結(jié)論造成一定的困擾。BCR-ABL RNA水平國際標準(IS)的建立解決了這個問題。由三個IRIS檢測的30個預處理樣本BCR-ABL RNA水平被專家確認為100% IS[28]。同時還為不同實驗室設定了轉(zhuǎn)換因子(Conversion Factor, CF)，以校正不同條件的實驗操作，如不同的參考基因、PCR引物、提取方法及熒光定量PCR中逆轉(zhuǎn)錄應用等所造成的檢測結(jié)果差異。IS和CF的作用已經(jīng)在不同實驗室MMR檢測中得到了很好的應用[29]。

BCR-ABL 熒光定量PCR的標準參考材料已由CML專業(yè)實驗室通過WHO國際基因參考組織合成[30]。該參考材料為凍干混合物，由白血病細胞系K562和HL60組成，參考基因是BCR、ABL或β-葡萄糖醛酸苷酶基因(GUSB)，經(jīng)過IS實驗室測試，這種材料在37℃以下至少穩(wěn)定10個月。這種標準化參考材料需要組織培養(yǎng)，資源寶貴，其最佳利用方式是應用其調(diào)整和驗證二級參考試劑。根據(jù)BCR-ABL熒光定量PCR國際標準，一些專業(yè)實驗室已經(jīng)研發(fā)了二級參考試劑，商業(yè)試劑公司也在商品試劑盒中應用了二級參考試劑，大多數(shù)常規(guī)實驗室可以應用BCR-ABL RNA二級參考試劑進行檢測，并能快速形成國際標準化報告。

4 結(jié)語

綜上所述，BCR-ABL融合基因的應用檢測對CML診斷和治療監(jiān)測有重要臨床作用，針對CML不同階段選擇不同方法進行輔助診斷和治療監(jiān)測，豐富了個體化醫(yī)療內(nèi)容，尤其是BCR-ABL熒光定量PCR，可作為治療監(jiān)測的標準。CML進展期患者、Imatinib治療無效患者、imatinib治療有效但BCR-ABL RNA水平升高患者進行ABL激酶區(qū)TKI耐藥突變的分子監(jiān)測，對阻止疾病進展和評估預后有積極臨床意義。

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本文作者簡介：

付朝泓(1978-)，男，漢族，碩士，主管技師，研究方向：臨床分子診斷

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糖基化載脂蛋白A-I水平與2型糖尿病患者的冠狀動脈斑塊進展相關

本刊編委，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科蒲里津教授等在《Diabetes Care》(2013，36(5)：1 312-1 320，1區(qū)，IF=7.78)發(fā)表了題為“Glycation of apoprotein A-I is associated with coronary artery plaque progression in type 2 diabetic patients”的研究論文，主要內(nèi)容如下：

1 研究背景和目的：高密度脂蛋白(HDL)通過促進巨噬細胞內(nèi)的膽固醇流出和運輸，即膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(RCT)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化功能。這種RCT效率取決于卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的激活，使細胞和脂蛋白源性的膽固醇酯化，形成濃度梯度，將游離膽固醇轉(zhuǎn)運到HDL。其中載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-I) 激活LCAT是RCT的關鍵步驟。載脂蛋白的糖氧化修飾可改變其結(jié)構、構象和功能，從而損害其激活LCAT的能力，因此可能與HDL功能不全及2型糖尿病(T2DM)患者并發(fā)冠心病(CAD)有關。本研究探討糖基化apoA-I水平是否與T2DM患者的CAD及斑塊進展有關。

2 方法： 連續(xù)入選272例T2DM患者，其中無明顯冠狀動脈病變(管腔直徑狹窄<30%)者82例(I組)，顯著CAD患者(管腔直徑狹窄≥70%)190例(II組)，同時選擇136例健康受試者為對照組。超速離心全血獲得HDL,采用SDS-PAGE電泳分離apoA-I,免疫印跡分析apoA-I糖基化水平(以條帶的相對密度表示) 。通過直接測量血清內(nèi)源性未酯化膽固醇減少量分析LCAT活性，分析比較各組糖基化apoA-I水平及LCAT活性差異。在1年隨訪中，對II組患者進行了定量冠脈造影(QCA，n=159)和血管內(nèi)超聲顯像(IVUS，n=127)檢查，分析冠狀動脈評分、冠狀動脈狹窄累積評分和斑塊容積百分比變化以評估冠狀動脈斑塊進展情況。

3 結(jié)果：apoA-I糖基化水平從對照組(1.35±0.41)、I組(5.50±1.40)到II組(10.12±4.76)明顯增加(P<0.01)，LCAT活性從對照組(0.30±0.04μmol/ml·h)、I組(0.25±0.04μmol/ml·h)到II組(0.20±0.03μmol/ml·h)逐步下降(P<0.01)。在1年隨訪中，QCA發(fā)現(xiàn)159例患者中有45例發(fā)生斑塊進展，IVUS發(fā)現(xiàn)127例患者中有38例發(fā)生斑塊進展, QCA及IVUS斑塊進展者的apoA-I糖基化水平(12.80±5.11)及(11.86±3.88)分別明顯高于無斑塊進展者(8.91±4.10)及(7.69±3.04)(P均<0.01)，而LCAT活性(0.196±0.022μmol/ml·h)及(0.198±0.025μmol/ml·h)明顯低于無斑塊進展者(0.224±0.030μmol/ml·h)及(0.221±0.028μmol/ml·h)(P均<0.01)。apoA-I糖基化水平與冠狀動脈評分的變化、冠狀動脈狹窄累積評分和斑塊容積百分比變化均呈正相關(r分別為0.529、0.661、0.618，P均<0.01)。Logistic回歸分析表明apoA-I糖基化水平是T2DM患者發(fā)生CAD (OR 2.39 ，95%CI 1.62-3.52,P<0.01)和斑塊進展(OR 1.32，95%CI 1.17-1.48,P<0.01)風險的獨立預測因素。

4 結(jié)論： apoA-I糖基化水平與T2DM患者冠狀動脈疾病及冠脈斑塊進展相關。

武漢大學人民醫(yī)院，武漢 430060;*通迅作者：E-mail:yanlitf1120@163.com

本文2014-12-23收到，2015-03-10修回

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