張 健 劉彥明 管振祺 何鳳屏

甲狀腺毒癥患者單個核細胞Foxp3檢測分析

張 健 劉彥明 管振祺 何鳳屏*

目的：檢測分析彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves病)和亞急性甲狀腺炎患者單個核細胞叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)陽性率和血漿甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)濃度變化。方法：采用流式細胞分析技術分別檢測32例Graves病患者(Graves病組)、27例亞急性甲狀腺炎患者(亞甲炎組)及30例健康對照者(對照組)外周血單個核細胞Foxp3陽性率；化學發(fā)光法測定血漿TGAb、TPOAb水平，比較組間各指標的差異，并分析Graves病患者單個核細胞Foxp3陽性率與血漿TGAb、TPOAb水平的相關性。結果：Graves病組單個核細胞Foxp3陽性率顯著低于對照組和亞甲炎組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Graves病組TGAb、TPOAb水平均明顯高于對照組和亞甲炎組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Graves病患者單個核細胞Foxp3陽性率與血漿TGAb和TPOAb水平均呈負相關(r=-0.70、-0.63,P<0.05)。結論：Foxp3、TGAb、TPOAb檢測可為Graves病與亞急性甲狀腺炎的診斷和鑒別診斷提供實驗室依據(jù)。

甲狀腺毒癥；叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子3；甲狀腺球蛋白抗體；甲狀腺過氧化物酶抗體

初診甲狀腺疾病多以甲狀腺毒癥為其主要表現(xiàn)，臨床上常見彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves病)與甲亢期亞急性甲狀腺炎。近年來發(fā)現(xiàn)叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子3(Forkhead/Winged Helix Transcription Factor3,Foxp3)作為CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)的特征性轉錄分子，在諸多疾病包括甲狀腺疾病發(fā)病中起著關鍵的作用[1]。本文通過流式細胞分析技術檢測32例Graves病與27例甲亢期亞急性甲狀腺炎患者外周血單個核細胞Foxp3陽性率，同時采用電化學發(fā)光法測定血漿甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平，并分析Foxp3與TGAb和TPOAb的相關性，為臨床診斷甲狀腺毒癥提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例為2014-03—2014-11廣東省粵北人民醫(yī)院內分泌科門診或住院患者。Graves病32例(Graves病組)，其中男10例，女22例，年齡18-64歲，平均39.2±9.7歲，診斷依據(jù)：有高代謝癥臨床表現(xiàn)；心率加快，甲狀腺腫大，手震顫，甲狀腺相關眼病表現(xiàn)，脛前黏液水腫等體征；FT4和FT3水平升高，TSH水平降低；甲狀腺靜態(tài)顯像ECT核素掃描顯示放射性攝取功能增加。甲亢期亞急性甲狀腺炎27例(亞甲炎組)，男7例，女20例，年齡19-66歲，平均40.6±10.0歲，診斷依據(jù)：有頸部疼痛或甲狀腺部位壓痛；C反應蛋白或血沉水平升高；FT4和FT3增高，TSH水平降低；甲狀腺靜態(tài)顯像ECT核素掃描顯示放射性攝取功能減低，部分病例行細針穿刺活檢顯示可見大量多核巨細胞。所有病例半年內均未應用糖皮質激素等免疫抑制劑或增強劑及放射碘治療的初診病人，且排除其它甲狀腺疾病及糖尿病、腎病、結核病等其它內科疾病。選取同期于該院體檢中心體檢健康者30例作為對照組，男9例，女21例，年齡19-65歲，平均38.8±9.1歲。各疾病組和對照組間年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 主要儀器和試劑

流式細胞儀(美國BD公司，型號BD FACS Calibur)；電化學發(fā)光儀(瑞士Roche公司，型號E602)。藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人Foxp3單抗(美國eBioscience公司，批號E09963-300)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD4抗體、別藻青蛋白(APC)標記的鼠抗人CD25抗體(美國BD公司，批號20131013/20130806)，人淋巴細胞分離液(上海華精高科技有限公司，批號110504)，含固定劑、溶血劑和透膜劑的Perfix-P試劑盒(美國貝克曼公司，批號B08488)，TGAb、TPOAb、FT3、FT4檢測試劑(瑞士Roche公司，批號173976/175454/175509/175155)。

1.3 單個核細胞Foxp3陽性率測定

抽取2ml外周血置入EDTA-K2抗凝管內，經人淋巴細胞分離液提取單個核細胞，調整細胞密度為1×107/ml。取100μl細胞懸液加入100μl固定液中振蕩混勻，室溫孵育10min后加裂解液500μl,充分混勻后放入37℃水浴箱孵育15min，加入冷洗滌液1ml, 2 000r/min離心4min后棄上清,加入90%甲醇1ml于冰上破膜30min，2 000r/min離心5min棄上清，最后加入冷洗滌液100μl重懸細胞。胞內抗體可與膜表面抗體一起孵育染色, PE標記的鼠抗人Foxp3抗體、FITC標記的鼠抗人CD4抗體、APC標記的鼠抗人CD25抗體各20μl同時加入，孵育30min后洗滌、離心、棄上清液，加細胞重懸液500μl混勻。上流式細胞儀檢測，以CD4設門分析單個核細胞Foxp3陽性率。

1.4 FT3、FT4及TGAb、TPOAb測定

所有對象采集3ml靜脈血于肝素鋰抗凝試管中，離心分離血漿，排除溶血及高脂血標本，采用化學發(fā)光法，按常規(guī)操作，4h內完成檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組單個核細胞Foxp3陽性率、TGAb、TPOAb、FT3、FT4水平比較

各組各指標水平差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與對照組和亞甲炎組比較，Graves病組患者單個核細胞Foxp3陽性率明顯降低，血漿TGAb、TPOAb水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(與對照組比較：t=5.78、9.23、12.67；與亞甲炎組比較：t=4.81、6.59、12.18，P均<0.05)。對照組和亞甲炎組以上三指標差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.80、0.73、0.46，P均>0.05)。與對照組比較，Graves病組和亞甲炎組患者血漿FT3、FT4水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(Graves病組：t=10.65、7.54；亞甲炎組：t=5.73、6.02，P均<0.05)。Graves病組患者血漿FT3水平較亞甲炎組升高更明顯(t=4.50，P<0.05)，兩組間血漿FT4水平差異無統(tǒng)計學意義(t=1.24，P>0.05)。見表1。

表1 各組Foxp3、TGAb、TPOAb、FT3、FT4檢測結果比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與亞甲炎組比較，2)P<0.05

2.2 Graves病患者Foxp3陽性率與TGAb、TPOAb水平的相關性分析

Graves病患者單個核細胞Foxp3陽性率與血漿TGAb和TPOAb水平均呈負相關(r=-0.70、-0.63,P均<0.05)。

3 討 論

甲狀腺毒癥是指組織暴露于過量甲狀腺激素中發(fā)生的以高代謝癥候群為臨床表現(xiàn)的一組綜合癥。Graves病與亞急性甲狀腺炎同為常見的甲狀腺疾病，兩者都可因甲狀腺激素水平升高而表現(xiàn)為甲狀腺毒癥。Graves病原發(fā)于自身免疫過程紊亂，致甲狀腺激素過度產生而引起甲狀腺毒癥[2]；亞急性甲狀腺炎急性發(fā)作期因甲狀腺濾泡的完整性被破壞，濾泡內貯存的甲狀腺激素漏出使患者血循環(huán)中含量增多[3]。臨床上對這兩種不同原因甲狀腺疾病的鑒別診斷還未找到確切且簡單易行的方法。

本文檢測結果顯示，Graves病與亞急性甲狀腺炎患者血漿FT3、FT4水平都較對照組明顯增高，而Graves病組FT3水平升高更顯著，其原因可能是Graves病患者自身甲狀腺功能高于正常水平，T4向T3轉化增強致T3及FT3增高；而亞急性甲狀腺炎患者的甲狀腺功能低于正常。張紅梅等[4]根據(jù)這一特點，通過FT3/FT4比值探討了鑒別Graves病和亞急性甲狀腺炎的分界值，但不管采用何種界值，兩者始終存在重合，說明此鑒別方法雖然簡單易行，但特異性不強。丁正強等[5]采用甲狀腺攝碘率鑒別亞急性甲狀腺炎和Graves病，靈敏度高，特異性強，但該方法檢查時間長，且需內服放射性藥物，對于妊娠期患者更是被禁止，因此在大多數(shù)醫(yī)院并不作為常規(guī)檢查項目。

Graves病是一種器官特異性自身免疫性疾病，涉及多個環(huán)節(jié)，機制亦未完全闡明，有研究表明其可能與TGAb、TPOAb水平升高密切相關[6]。Foxp3特異且穩(wěn)定地表達于CD4+CD25+Treg細胞亞群,是其敏感標記，對CD4+CD25+Treg發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制作用具有重要影響，可能是Graves病發(fā)病機制中的一個重要因素[7,8]。亞急性甲狀腺炎患者多有上呼吸道感染史，一般認為與病毒感染有關；也有學者提出該病患者甲狀腺組織受炎癥破壞后釋放出自身抗原，可通過直接或間接方式激活輔助性T淋巴細胞，因此伴隨病毒事件的同時不排除自身免疫異常[9]。本文結果顯示，Graves病患者外周血單個核細胞Foxp3陽性率較對照組和亞甲炎組患者明顯降低，與錢偉等[10]研究結果一致。相關性分析顯示外周血單個核細胞Foxp3陽性率與血漿TGAb、TPOAb水平均呈負相關，提示Graves病患者外周血CD4+CD25+Tregs數(shù)量減少或者Treg功能受損，導致免疫耐受機制破壞，持續(xù)激活體內自身反應性T細胞對自身甲狀腺組織免疫應答，產生大量TGAb和TPOAb，使血漿水平較對照組顯著增高，與吳定昌等[11]研究結果基本一致。有關Foxp3與亞急性甲狀腺炎的研究少見相關報道，本文檢測結果顯示亞甲炎組患者單個核細胞Foxp3陽性率與對照組接近，同時外周血TGAb、TPOAb的水平亦與對照組無統(tǒng)計學差異，與汪亞麗[12]觀察到的結果相同，該結果有利于進一步補充其與Graves病的鑒別診斷方法。

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本文第一作者簡介：

張 健(1977-)，男，漢族，碩士，主管技師

1 王 榮, 張 健, 秦 秋，等. Foxp3在自身免疫性甲狀腺病患者外周血和病變組織中的表達[J]. 西安交通大學學報(醫(yī)學版),2012,33(1): 56-60.

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4 張紅梅, 祖力菲亞·沙吾提, 阿布力克木·吐爾地. 甲狀腺激素檢測在甲狀腺毒癥病因鑒別診斷中的臨床應用價值[J]. 標記免疫分析與臨床,2012,19(2): 82-85.

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12 汪亞麗. 2個項目檢測在甲狀腺功能診斷中的臨床價值[J]. 檢驗醫(yī)學與臨床,2013,10(10): 1 303-1 304.

汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗科，韶關 512026；*

，E-mail：fengphe@hotmail.com

本文2014-12-18收到，2015-02-17修回

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1005-1740(2015)02-0049-03