占雯婕，趙玲

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510006

甲狀腺毒癥是組織和循環(huán)中甲狀腺激素水平過高的總稱，分為與甲亢相關(guān)的甲狀腺毒癥和非甲亢相關(guān)的甲狀腺毒癥。在碘充足地區(qū)，非醫(yī)源性甲狀腺毒癥最常見的原因是格雷夫斯?。℅D），約占80%。目前認(rèn)為，GD發(fā)病風(fēng)險主要與遺傳因素有關(guān)，許多與GD風(fēng)險增加的相關(guān)基因與其他自身免疫性疾?。ㄈ鏣1DM）相關(guān)基因重疊［1］。在中國，臨床甲亢患病率0.78%、亞臨床甲亢0.44%、GD患病率0.53%。未經(jīng)治療的甲亢甚至亞臨床甲亢可導(dǎo)致心房顫動、卒中和其他心血管事件以及骨質(zhì)疏松癥和骨折的發(fā)生風(fēng)險增加［2］。T1DM是一種慢性自身免疫性疾病，以胰島素缺乏和高血糖為特征［3］，T1DM的患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，全球患病率為每萬人9.5例［4］。許多觀察性研究發(fā)現(xiàn)，T1DM和甲狀腺毒癥密切相關(guān)，印度的一項橫斷面研究顯示，130名GD患者中，3.1%伴有T1DM［5］；英國的一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，2791例GD患者種1.11%伴有T1DM［6］；一項1993年到2010年的前瞻性研究表示，在3209名白種人GD患者中，觀察到T1DM明顯高于對照組［7］。但是上述研究未能說明二者因果關(guān)系，且觀察性研究易受到反向因果關(guān)系和混雜因素干擾，從而使因果關(guān)系推斷受限。

孟德爾隨機化（MR）分析方法近年被廣泛用于流行病學(xué)的因果關(guān)系研究。MR研究的基本原理是配子形成中親代等位基因隨機分配給子代，相當(dāng)于對人群進行隨機分組，與隨機對照試驗類似［8］。由于遺傳變異出生時即固定并且伴隨一生，因此MR研究能最大限度減少反向因果關(guān)系［9］。將遺傳變異作為工具變量（IVs）對暴露因素與結(jié)局的因果關(guān)系進行推斷，能減少混雜因素的干擾［10］。

以往的T1DM和甲狀腺毒癥研究大多是基于觀察性的研究，容易受混雜因素或者反向因果關(guān)系的影響，而MR分析能最大限度避免二者干擾，但目前尚未有T1DM和甲狀腺毒癥的MR分析。本研究運用兩樣本MR方法，以單核苷酸多態(tài)性（SNPs）作為IVs，研究T1DM和甲狀腺毒癥之間的因果關(guān)系。由于甲狀腺激素過多會影響患者血糖控制、損傷胰島細(xì)胞功能以及降低胰島素敏感性［11］，因此明確二者關(guān)系，不僅有助于盡早發(fā)現(xiàn)并及時治療甲狀腺毒癥，減輕甲狀腺毒癥導(dǎo)致的危害，也有助于糖尿病患者更好地控制血糖。同時，本次研究為T1DM和甲狀腺毒癥之間的因果關(guān)系提供了統(tǒng)計學(xué)上的線索，為實驗研究和機制探索提供了理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究設(shè)計

本文利用T1DM作為暴露因素，與T1DM顯著相關(guān)的SNPs作為IVs，結(jié)局變量為甲狀腺毒癥。剔除離群值后，運用兩樣本MR分析的方法進行因果分析，并進異質(zhì)性檢驗和多效性檢驗，最后對結(jié)果的可靠性進行檢驗。

MR研究中的IVs需滿足三個核心假設(shè)：（1）IVs與暴露因素高度相關(guān)；（2）IVs僅通過暴露因素影響結(jié)局，不與結(jié)局直接相關(guān)；（3）IVs與“暴露-結(jié)局”關(guān)聯(lián)的混雜因素?zé)o關(guān)（圖1）。

圖1 兩樣本MR研究示意圖Fig. 1 Model of the two-sample Mendelian randomization(MR)analysis.

1.2 資料來源

通過https://gwas.mrcieu.ac.uk/網(wǎng)站分別獲取T1DM和甲狀腺毒癥的GWAS。其中T1DM數(shù)據(jù)來源于EBI GWAS 數(shù)據(jù)庫，甲狀腺毒癥數(shù)據(jù)來源于芬蘭FinnGen數(shù)據(jù)庫，以上數(shù)據(jù)人源均來自歐洲（表1）。

表1 兩樣本MR研究GWAS數(shù)據(jù)簡要信息Tab.1 Summary of the GWAS included in this two-sample MR study

1.3 IVs的篩選

依據(jù)MR的核心假設(shè)進行IVs篩選。以歐洲千人全基因組為參照，設(shè)置P＜5×10-8篩選與T1DM有顯著意義的SNPs，以滿足關(guān)聯(lián)性假設(shè)。使用R4.2.2 軟件的TwoSampleMR包進行clump計算，設(shè)置參數(shù)r2=0.001，kb=10 000，以排除連鎖不平衡的影響，保證SNPs之間相互獨立［12］。從甲狀腺毒癥的GWAS數(shù)據(jù)中提取上述與T1DM密切相關(guān)的SNPs，對兩者進行整理合并。利用MR-PRESSO進行離群值檢驗以去除水平多效性［13］，刪除離群值同時剔除與甲狀腺毒癥直接相關(guān)的SNPs（P＜5×10-8）［14］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

1.4.1 T1DM與甲狀腺毒癥的因果效應(yīng)估計 主要采用逆方差加權(quán)法（IVW）［15］進行MR分析，用MR-Egger回歸［17］、加權(quán)眾數(shù)法（WM）［17］和加權(quán)中位數(shù)法（WME）［18］進行補充。IVW主要用于因果關(guān)系估計，其估計值可視作結(jié)局中的IVs在暴露因素中加權(quán)線性回歸的斜率，且截距項視為0，當(dāng)所選SNPs都是有效的IVs時，IVW可以提供準(zhǔn)確的估計值［15］。MR-Egger法同樣以斜率作為因果效應(yīng)估計值，但是該法考慮截距項的存在，且其截距可用于評估IVs之間的多效性［16］。WM方法根據(jù)因果效應(yīng)的相似性將SNPs聚類為子集，進而估計具有最大數(shù)量SNPs的子集的因果效應(yīng)［17］。WME法在無效IVs高達一半時，仍能提供一致性的因果效應(yīng)估計值［18］。采用IVW和MR-Egger法對IVs進行Cochran Q和Rücker Q異質(zhì)性檢驗［19,20］。

1.4.2 可靠性評價

1.4.2.1 多效性檢測 多效性檢驗?zāi)壳捌毡椴捎肕REgger回歸的截距項來表示，當(dāng)該截距項接近于0時，表示不存在多效性，可認(rèn)為排他性假設(shè)成立［21,22］。

1.4.2.2 敏感性分析 采用逐個剔除檢驗進行敏感性分析［23］。該法逐一剔除SNPs后計算剩下SNPs的結(jié)果，若剔除某一SNPs后結(jié)果改變很大，說明該SNPs對結(jié)果影響很大。

1.4.3 弱IVs檢驗 分別計算單個SNPs的F值，對所選IVs進行弱IVs偏倚檢驗。F=β2exposure/SE2exposure，β為暴露的等位基因效應(yīng)值，SE為暴露的標(biāo)準(zhǔn)誤［24］。

上述方法均通過R4.2.2軟件的TwoSampleMR包實現(xiàn)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 篩選出的IVs

經(jīng)過相關(guān)性和去除連鎖不平衡篩選后，得到44個SNPs，合并整理并刪除缺失項后，得到37個SNPs，經(jīng)MR-PRESSO檢驗得到5個離群值，刪除離群值最終得到32個SNPs（表2）。

表2 MR分析SNPs信息表Tab.2 Basic information of the single nucleotide polymorphisms(SNPs)

2.2 兩樣本MR結(jié)果

IVW法結(jié)果顯示，OR值及95%CI均＞1，且P值＜0.05，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.077，95%CI：1.046～1.109，P=7.201×10-7），即說明整體人群中T1DM與甲狀腺毒癥具有正向的因果關(guān)系。MR-Egger 回歸、WM和WME 計算的T1DM 與甲狀腺毒癥之間的OR 值、95%CI和P值分別為（OR=1.076，95%CI：1.031～1.124，P=0.002）、（OR=1.082，95%CI：1.048～1.118，P=4.375×10-5）、（OR=1.090，95%CI：1.052～1.129，P=2.003×10-6）（圖2）。MR-Egger回歸、WM和WME與IVW所得效應(yīng)值及區(qū)間范圍趨于一致，P值均有統(tǒng)計學(xué)意義，四種算法得到的因果效應(yīng)方向一致（圖3），均顯示T1DM是甲狀腺毒癥的危險因素。

圖2 兩樣本MR結(jié)果森林圖Fig. 2 Forest plot of the two-sample MR analysis.

圖3 兩樣本MR結(jié)果散點圖Fig. 3 Scatter plot of the two-sample MR analysis.

2.3 異質(zhì)性檢驗

異質(zhì)性檢驗中，Cochran Q 檢驗和Rücker Q 檢驗結(jié)果分別為P=0.127和P=0.155，表明IVs間不存在異質(zhì)性。

2.4 可靠性評價

2.4.1 多效性檢測 MR-Egger 回歸的截距Eggerintercept=0.0004，P=0.965，表明因果效應(yīng)分析結(jié)果并未受到多效性干擾，可認(rèn)為排他性假設(shè)成立。

2.4.2 敏感性分析 經(jīng)逐個剔除檢驗，依次剔除單個SNPs，余下的31個SNPs分析結(jié)果與納入全部SNPs的IVW分析結(jié)果相近，且都在無效線右側(cè)（圖4），說明本次MR分析結(jié)果是穩(wěn)健的。漏斗圖顯示使用單一SNPs作為IVs時，代表因果關(guān)系效應(yīng)的點大致呈對稱分布，表示受潛在偏倚影響的可能性?。▓D5）。

圖5 兩樣本MR結(jié)果漏斗圖Fig. 5 Funnel plot of the two-sample MR analysis.

2.5 弱IVs檢驗

當(dāng)F＞10時，出現(xiàn)弱IVs的可能性比較小［25］。本次32個SNPs的F值范圍在30.540～1465.470，無弱IVs偏倚，進一步驗證了MR研究的關(guān)聯(lián)性假設(shè)（表2）。

3 討論

本次兩樣本MR分析驗證了T1DM與甲狀腺毒癥之間的關(guān)聯(lián)，IVW法、MR-Egger回歸、WM和WME四種方法分析顯示，T1DM與甲狀腺毒癥之間存在因果關(guān)系，且因果效應(yīng)保持穩(wěn)定。

一項12年全國范圍、基于人群（中國臺灣青少年和兒童）的回顧性隊列研究顯示，T1DM中甲狀腺毒癥的發(fā)生率顯著高于對照組，發(fā)病率比為6.95［26］。一項納入了761例東亞T1DM患者的前瞻性研究表明，4.1%的患者出現(xiàn)了GD［27］。美國一篇甲亢文章指出，甲狀腺毒癥的高危人群包括T1DM患者，并建議進行甲狀腺毒癥篩查［28］。

T1DM引起甲狀腺毒癥的機制很復(fù)雜，目前研究顯示與自身免疫和遺傳因素密切相關(guān)。GD和自身免疫性甲狀腺炎是自身免疫性甲狀腺疾?。ˋITD）的兩種主要臨床表現(xiàn)［29］。T1DM和AITD是兩種常見的自身免疫性內(nèi)分泌疾病，AITD常和其他自身免疫病相關(guān)，其中最常見的是T1DM［7,25］。雖然兩種疾病的發(fā)病機制存在差異，但流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，T1D和AITD在同一個體和家庭中存在聚集性，這表明這兩種疾病具有共同的遺傳基礎(chǔ)［4］。高達25%的青少年T1DM患者有甲狀腺相關(guān)抗體，長期隨訪顯示，30%的T1DM患者會發(fā)展為AITD［4］。美國糖尿病協(xié)會(ADA)也描述了T1DM患者中17%～30%的AITD患病率［29］。目前研究發(fā)現(xiàn)，某些HLAII類自身等位基因的攜帶，與最常見的自身免疫性疾病發(fā)病概率的增加存在關(guān)聯(lián)，經(jīng)遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實，少數(shù)基因同時具有患AITD 和T1DM 的風(fēng)險。HLA-dr3 是導(dǎo)致AITD 和T1DM 聯(lián)合易感性的主要HLA II類等位基因，HLA-dr有獨特的氨基酸特性，胰島肽和甲狀腺肽都能與之結(jié)合，并誘導(dǎo)甲狀腺和胰島特異性T 細(xì)胞反應(yīng)，從而在同一個體中觸發(fā)T1DM 和AITD［4］。除了HLA類基因外、CTLA-4、PTPN22、IL2Ra、VDR、TNF也被認(rèn)為是潛在的遺傳易感性位點［26］。然而不同人群對于基因易感性具有差異，如在阿拉伯和亞洲人群中，HLA易感等位基因與在歐洲和美國白種人人群中發(fā)現(xiàn)的不同，部分基因?qū)1DM和AITD的影響機制亦尚未闡明，未來還需要進一步研究。

由于甲狀腺毒癥會增強肝糖原異生，增加胰島素抵抗，使T1DM患者的血糖難以控制穩(wěn)定，甚至可能導(dǎo)致酮癥酸中毒，積極治療甲狀腺毒癥,抑制甲狀腺激素過多對T1DM患者糖代謝調(diào)節(jié)有重要意義。由于早期甲狀腺毒癥癥狀缺乏特異性，T1DM患者要及時進行相關(guān)檢查，以免漏診、誤診。甲狀腺毒癥的早發(fā)現(xiàn)早治療，也有助于降低其帶來的心血管事件及骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險。

本研究具有如下創(chuàng)新性：（1）以大樣本GWAS數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從遺傳學(xué)角度探討了T1DM與甲狀腺毒癥的因果關(guān)系，和以往的觀察性研究相比不易受混雜因素和反向因果關(guān)系干擾；（2）SNPs的篩選比較嚴(yán)格，對結(jié)局影響較大的SNPs進行了剔除，并運用了MR-PRESSO刪除了離群值；（3）采用了4種MR分析方法，運用2種方法進行異質(zhì)性檢驗、3種方法進行了可靠性評價，結(jié)果比較穩(wěn)健。

本次MR研究存在的局限性：（1）納入對象為歐洲人群，結(jié)論外推到其他人群中受限；（2）難以根據(jù)GWAS匯總數(shù)據(jù)按照性別、年齡、既往史進行分層分析；（3）本研究為統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，無法進一步探討其中機制。后續(xù)研究還需在不同人種之間展開，并對不同性別、年齡的人群開展進一步分層研究，以進一步探索T1DM對甲狀腺毒癥的影響。

綜上，本研究采用兩樣本MR方法，對T1DM和甲狀腺毒癥之間的因果關(guān)系進行探究，結(jié)果表明T1DM可能會增加甲狀腺毒癥的風(fēng)險。