張 蒙，張?jiān)丛?，牛?mèng)竹，朱悅，童詩(shī)逸，寇現(xiàn)娟

1武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430079；2運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430079

帕金森?。≒D）是一種錐體外系功能障礙的中樞神經(jīng)退行性疾病，常見于中老年人群，70～79歲最易發(fā)病，85歲以上老年人患病率高達(dá)3%～5%［1］。PD的病理改變主要是患者腦內(nèi)多巴胺（DA）神經(jīng)元呈慢性進(jìn)行性喪失，造成大腦黑質(zhì)-紋狀體投射系統(tǒng)中DA和乙酰膽堿濃度失衡，最終引起相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)功能障礙［2］。最新研究表明，壞死性凋亡是一種由炎癥性胱天蛋白酶Caspase誘導(dǎo)的壞死性和炎癥性的細(xì)胞促炎程序性死亡方式，它與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的神經(jīng)炎癥密切相關(guān)［3］。自噬通過自噬小體對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面作用重大。已有研究表明，自噬缺陷或不足會(huì)誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而引發(fā)AD、PD等神經(jīng)退行性疾?。?］。雙氫楊梅素（DHM）是一種從葡萄屬植物中提取的多酚羥基雙氫黃酮醇類化合物，其抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用對(duì)神經(jīng)退行性疾病療效顯著［5］。已有研究表明，DHM可改善高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)二型糖尿病大鼠的PD樣病理改變，減少病理蛋白α-syn的聚集［6］。體外研究也表明，DHM可有效減少PD細(xì)胞模型中α-syn的異常集聚，抑制炎癥，改善PD 病理進(jìn)程［5］。此外，DHM 還具有拮抗高糖誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡［7］、抑制肝損傷細(xì)胞模型細(xì)胞焦亡的作用［8］。雖然研究證明了DHM具備抑炎、抗凋亡等功效，但在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）/丙磺舒（probenecid）（MPTP/p）誘導(dǎo)的慢性PD小鼠模型中，DHM是否是通過激活細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡和壞死性凋亡未見研究報(bào)道。因此，本文通過建立慢性MPTP/p誘導(dǎo)PD小鼠模型，旨在觀察8周DHM干預(yù)對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能障礙的影響及其分子機(jī)制，以期為DHM新藥的開發(fā)以及PD未來的治療方向提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡健康雄性C57BL/6小鼠60只（動(dòng)物質(zhì)量合格編號(hào)：NO.42010200005621），購(gòu)于三峽大學(xué)[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012]。按照最佳飼養(yǎng)空間（每籠2～4只）將小鼠隨機(jī)分籠，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物SPF級(jí)飼料及墊料，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，濕度55%～63%，12 h光照/12 h黑暗，定期更換墊料，保證所有小鼠可自由飲食。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照1995年神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物使用政策和人類神經(jīng)科學(xué)研究進(jìn)行，由武漢體育學(xué)院動(dòng)物管理倫理委員會(huì)監(jiān)督（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：S0087-20210628-01）。

1.2 動(dòng)物分組及處理

1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為4 組（n=15）：對(duì)照組（Control）、模型組（PD）、DHM干預(yù)組（PD+DHM）、NEC-1抑制劑組（PD+NEC-1）。PD模型的制備：PD組、PD+DHM組、PD+NEC-1組小鼠腹腔注射MPTP（25 mg·kg-1·d-1）聯(lián)合丙磺舒（250 mg·kg-1·d-1），兩種藥物間隔1 h，2次/周，共5周。密切觀察小鼠在造模期間的精神狀態(tài)及行為學(xué)改變，并采取相應(yīng)的保暖措施。此外，PD+NEC-1組小鼠進(jìn)行腹腔注射NEC-1抑制劑，給藥量為6.25 mg·kg-1·d-1，2 d/周，共5周。造模成功后，PD+DHM組小鼠進(jìn)行8周DHM灌胃處理，給藥量為100 mg·kg-1·d-1，5d/周，共8周。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Bv-2細(xì)胞株來自于廣西醫(yī)科大學(xué)，用含10%FBS的DMEM進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，至細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后開始實(shí)驗(yàn)。采用MPP+激活Bv-2小膠質(zhì)細(xì)胞造模。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（Control）、單純DHM干預(yù)組（Control+6.25 μg/mL）、模型組（MPP+）、不同濃度DHM干預(yù)組（3.25、6.5、12.5 μg/mL）、3-MA 抑制劑組（3-MA）。先將MPP+或3-MA自噬抑制劑溶解在DMEM中配制成儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。造模干預(yù)：500 μmol/L的MPP+刺激Bv-2細(xì)胞24 h；DHM低/中/高濃度干預(yù)：MPP+刺激后，不同濃度的DHM分別處理22 h；3-MA自噬抑制劑干預(yù)：10 mmol/L的3-MA處理細(xì)胞24 h。Western blot檢測(cè)干預(yù)后Bv-2細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)；PI染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 主要試劑及儀器

主要試劑及儀器如：MPTP、MPP+（Sigma）；丙磺舒、NEC-1、3-MA（MCE）；DHM（ALB）；LDH 試劑盒（南京建成）；組織固定液（武漢賽維爾生物）；ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑（中國(guó)賽默飛）；IL-1β試劑盒（依科賽）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）；胰蛋白酶、青鏈霉素和PBS（塞維爾）；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PI壞死染色試劑盒（碧云天）；Rotor-Rod轉(zhuǎn)棒儀（北京尤比愛生物）；樣品處理系統(tǒng)（上海凈信科技）；小型冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf）；超聲細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物）；超敏熒光及化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔）；酶標(biāo)儀（上海Thermo）；電泳儀（北京六一儀器廠）；轉(zhuǎn)膜儀（海天能科技）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 Rota-Rod Test轉(zhuǎn)棒試驗(yàn) 采用轉(zhuǎn)棒儀進(jìn)行運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)方案包括3 d訓(xùn)練（3～25 r/min，5 min）和1 d測(cè)試（5～35 r/min，5 min），運(yùn)動(dòng)方案參考文獻(xiàn)并做適當(dāng)改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)開始前，先讓小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上適應(yīng)60 s。啟動(dòng)后，電腦開始自動(dòng)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，當(dāng)小鼠跌落，紅外線感應(yīng)后轉(zhuǎn)棒儀停止轉(zhuǎn)動(dòng)，此轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)為該小鼠的轉(zhuǎn)棒潛伏期Time on rotarod（s），5次/d，每次間隔30 min，取平均值。每組小鼠訓(xùn)練結(jié)束后均對(duì)轉(zhuǎn)棒儀進(jìn)行酒精擦拭，去除小鼠氣味，避免對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)產(chǎn)生干擾。

1.5.2 蛋白免疫印跡分析（Western blotting）干預(yù)后將小鼠脫頸、剪頭、取腦，取出兩側(cè)紋狀體組織置于抗凝EP管中，置-80 ℃冰箱待測(cè)；稱取適量紋狀體組織勻漿后，制作膠板進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先以45 V恒壓電泳30 min，后調(diào)至85 V恒壓。以330 mA恒定電流轉(zhuǎn)PVDF 膜75 min；脫脂奶粉中常溫封閉70 min；洗膜（6 min×4次），4 ℃孵育一抗10 h，洗膜，常溫孵育二抗90 min，洗膜。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑將目的條帶置于超敏熒光及化學(xué)發(fā)光儀中曝光，后續(xù)進(jìn)行蛋白統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)指標(biāo)：TH(ab75875)；Iba-1(ab178846)；GFAP(#D1F4Q)；NLRP3(GB11300)；Cleaved-Caspase1(AF4005)；Caspase1(5418/Asp2)；Caspase8(GB11594)；TNF-α(A0277)；IL-1β(26048-1)；IL-18(ES10872)；IL-6(GB11117)；IL-4(ER1706-55)；p-RIPK1(AP1230)；RIPK1(17519-1-AP)；p-RIPK3(AP1260)；RIPK3(A5431)；p62(GB11690)；MLKL(AP1260)；ULK1(GB11580)；Beclin1(66665-1)；LC3 Ⅰ (#12741)；GSDMD-N(HA721144)；GAPDH(Proteintech)；二抗鼠/兔（塞維爾）。

1.5.3 免疫熒光染色 每組隨機(jī)選取3只小鼠取其全腦，用一次性針頭在其表面扎孔后放入灌有通用型組織固定液的離心管中，靜置貯存4 ℃冰箱待用。對(duì)黑質(zhì)組織進(jìn)行TH、GFAP、Iba-1免疫熒光染色，主要操作步驟：將切片脫水分別放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ溶液中各15 min，再分別放入無水乙醇Ⅰ和Ⅱ溶液中5 min，最后再經(jīng)由85%和75%的酒精脫水5 min，用蒸餾水洗。把切片放在pH=8.0的EDTA抗原修復(fù)緩沖液，先用中火燒8 min到沸騰，熄火停止8 min，再改成中低火燒7 min；自然冷卻降溫，放入pH=7.4的PBS中，洗滌4 min，共3次；甩出PBS滴入BSA，封閉30 min。把封閉液洗掉后加一抗，4 ℃冰箱過夜；PBS 甩干加二抗，在溫箱內(nèi)避光保存45 min；PBS甩干圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光靜置10 min；PBS洗后甩干加入自發(fā)熒光淬滅劑，5 min后用流動(dòng)的水沖洗2倍的時(shí)間；甩干后把切片封片，鏡檢拍照。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，次日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。眼球取血后將收集好血液常溫靜置2 h，分離出血清（4 ℃，1500 r/min，15 min），置-80 ℃冰箱待用；體外定量檢測(cè)小鼠血清中IL-1β的濃度。主要步驟為：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液和待檢樣品分別加入反應(yīng)孔中，100 μL/孔；用封板膜封板，37 ℃保溫箱里放60～120 min左右；撕掉封板膜，手動(dòng)洗板；倒掉液體加入洗液，倒扣拍干，重復(fù)3～6遍；加同體積生物素化抗體；之后溫育、洗滌，加同體積酶結(jié)合物工作液，再溫育（避光靜置30 min）、洗滌；加入同體積的TMB底物，37 ℃避光15～35 min；加入同體積的2 mol/L硫酸，當(dāng)顏色變?yōu)辄S色即可。打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，測(cè)定吸光度A490nm。

1.5.5 LDH 酶活性測(cè)定 收集組織，使用乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠紋狀體內(nèi)LDH的酶活性。一切操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.6 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 在紋狀體樣本中加入Trizol，經(jīng)氯仿、異丙醇體系提取組織總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成對(duì)應(yīng)的cDNA，完成RT-PCR的檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Image J、Graphpad Prism 8.0作圖，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。單因素方差分析用于多組間比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 DHM干預(yù)改善MPTP/p引起的小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙及神經(jīng)毒性

行為學(xué)結(jié)果顯示：與Control對(duì)照組相比，PD組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯下降（P＜0.001）。而較PD組相比，DHM干預(yù)后明顯延長(zhǎng)小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間（P=0.0049，圖1B）。TH是大腦DA能神經(jīng)元分泌的一種神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的前體。實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)紋狀體內(nèi)TH和α-syn的表達(dá)（圖1C），與Control相比，PD組TH蛋白水平顯著下降（P＜0.001），α-syn的表達(dá)顯著上升（P=0.0484）。而PD+DHM組TH的表達(dá)較PD組顯著增加（P=0.0023），病理蛋白α-syn的水平顯著下降（P＜0.001）。此外，免疫熒光檢測(cè)小鼠黑質(zhì)中TH陽(yáng)性DA能神經(jīng)元的數(shù)量的表達(dá)情況（圖1D）：Control組小鼠黑質(zhì)組織內(nèi)TH 陽(yáng)性細(xì)胞多而稠密，TH 紅色熒光強(qiáng)度較為顯著，分布也較為均勻。與對(duì)照組組小鼠相比，模型組小鼠黑質(zhì)組織內(nèi)TH陽(yáng)性數(shù)量大量減少（P=0.001），紅色熒光強(qiáng)度明顯較弱（P＜0.001）。而DHM干預(yù)后小鼠黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多（P=0.0085），TH熒光亮度也明顯增強(qiáng)（P=0.0127）。

圖1 DHM干預(yù)改善慢性MPTP/p引起的小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙及TH的降低Fig.1 DHM ameliorates motor dysfunction and loss of TH in MPTP/p-induced PD mice.A:Flow chart of interventions in the experimental. B: Time on rotarod. C: Expression of TH and α-syn in the striatum of the mice (with GAPDH as the loading control).D:Immunofluorescence staining of TH in the substantia nigra of the mice(Original magnification: ×100).Data are expressed as Mean±SD and analyzed using one-way ANOVA.#P＜0.05,###P＜0.001 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs PD.

2.2 DHM干預(yù)降低MPTP/p誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥

采用Western blot和免疫熒光染色對(duì)黑質(zhì)和紋狀體進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組相比，PD組小鼠紋狀體內(nèi)GFAP（P＜0.001）和Iba-1（P=0.0148）的表達(dá)水平均明顯增加，存在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活。而DHM干預(yù)后小鼠紋狀體中GFAP（P=0.045）及Iba-1（P＜0.001，圖2A）的蛋白水平顯著下降。與Western blot結(jié)果相一致，免疫熒光染色結(jié)果表明（圖2B、C），在數(shù)量上，與Control組相比，MPTP/p處理后小鼠黑質(zhì)中GFAP和Iba-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.001），再次驗(yàn)證PD模型組小鼠存在小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活現(xiàn)象。且在細(xì)胞形態(tài)上，PD組小鼠黑質(zhì)中GFAP神經(jīng)元樹突分叉增加，陽(yáng)性熒光面積顯著下降（P＜0.001）。Iba-1小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體變大，細(xì)胞核大而彌散，神經(jīng)元的樹突消失。而DHM干預(yù)后，小鼠GFAP和Iba-1的數(shù)量顯著降低（P＜0.001），陽(yáng)性熒光面積顯著下降（P＜0.001），小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)也得到了改善，GFAP神經(jīng)元樹突分叉減少，Iba-1胞體腫脹縮小，樹突棘也增多。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明（圖2D），與對(duì)照組相比，PD組小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)促炎因子TNF-α、IL-6的mRNA水平均顯著升高（P＜0.001），DHM干預(yù)后顯著下降（P＜0.001）。此外，與Control組相比，TNF-α、IL-6的表達(dá)在PD組小鼠紋狀體內(nèi)也顯著增加（P＜0.001），而抗炎因子IL-4 的蛋白水平顯著降低（P＜0.001）。DHM 干預(yù)后TNF-α（P=0.0015）和IL-6（P＜0.001）的蛋白水平均顯著降低，IL-4的水平顯著增加（P＜0.001，圖2E）。

2.3 DHM抑制MPTP/p誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

采用Western blot和RT-PCR技術(shù)對(duì)小鼠紋狀體進(jìn)行檢測(cè)（圖3A、B），與對(duì)照組相比，PD組小鼠紋狀體內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3（P=0.0033）、Cleaved-Caspase1（P=0.0025）、IL-1β（P=0.0492）、IL-18（P＜0.001）的表達(dá)均顯著增加，GSDMD-N也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0886）。而DHM干預(yù)后小鼠紋狀體內(nèi)上述指標(biāo)的表達(dá)均顯著下降（P＜0.001）。同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示（圖3C），PD組小鼠血清中IL-1β的表達(dá)較對(duì)照組相比異常升高（P＜0.001），而DHM干預(yù)后IL-1β的水平較PD組顯著下降（P＜0.001）。

圖3 DHM干預(yù)減輕了MPTP/p誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡Fig.3 DHM ameliorates pyroptosis in PD mice.A,B:Expressions of NLRP3,cleaved caspase1/caspase1,GSDMD-N,IL-1β and IL-18 in the striatum of the mice. C: Expressions of IL-1β detected by ELISA.Data are presented as Mean±SD and analyzed using one-wayANOVA.#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Control;***P＜0.001 vs PD.

2.4 DHM干預(yù)抑制MPTP/p誘導(dǎo)的壞死性凋亡

與對(duì)照組相比，模型組小鼠存在運(yùn)動(dòng)功能障礙（P＜0.001），PD+NEC-1 處理可以顯著提高模型鼠的運(yùn)動(dòng)能力（P=0.0086，圖4A）。檢測(cè)小鼠紋狀體中LDH的釋放水平，相比Control組，模型組小鼠紋狀體內(nèi)LDH的水平明顯上升（P＜0.001），DHM 干預(yù)后顯著下降（P＜0.001，圖4B）。此外，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4C、D），與Control對(duì)照組相比，PD小鼠紋狀體內(nèi)壞死性凋亡p-RIPK1 和RIPK1 的表達(dá)均顯著增高（P＜0.001），p-RIPK3（P=0.994）、RIPK3（P=0.0743）和MLKL（P=0.0773）蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Caspase8的表達(dá)顯著下降（P＜0.001）。DHM干預(yù)后p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、MLKL的水平明顯降低（P＜0.001），Caspase8的表達(dá)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.8944）。同時(shí)，細(xì)胞PI染色結(jié)果表明，與Con 對(duì)照組相比，MPP+組壞死性凋亡PI 細(xì)胞數(shù)（P＜0.001）和PI陽(yáng)性熒光面積（P=0.0011）均顯著增高。3種不同劑量的DHM干預(yù)可不同程度的降低上述2項(xiàng)指標(biāo)，且6.5 μg/mL的效果最好（圖4E）。

圖4 DHM干預(yù)降低了由MPTP/p誘導(dǎo)的壞死性凋亡Fig.4 DHM treatment attenuates necroptosis in the striatum of PD mice. A: Time on rotarod. B: Expressions of LDH detected by ELISA.C,D:Expression of p-RIPK1,RIPK1,p-RIPK3,RIPK3,MLKL and Caspase8 in the striatum of the mice.E:Immunofluorescence staining of PI in Bv-2 cells(Scale bar:20 μm).Data are presented as Mean±SD and analyzed using one-way ANOVA.##P＜0.01,###P＜0.001 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs PD/MPP+.

2.5 DHM可改善受損自噬抑制細(xì)胞焦亡和壞死

與對(duì)照組相比，PD組ULK1和Beclin1的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.001），而自噬降解蛋白p62和LC3 Ⅰ的表達(dá)水平較高（P＜0.001）。而與PD模型組相比，PD+DHM組的ULK1和Beclin1的表達(dá)顯著上升（P＜0.001，圖5A），p62和LC3Ⅰ的表達(dá)顯著下降（P＜0.001）。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖5B、C）：與Con組相比，MPP+組自噬相關(guān)蛋白ULK1、Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ顯著下降（P＜0.001），p62顯著上升（P＜0.001）；焦亡和壞死刺激蛋白NLRP3（P＜0.001）、IL-1β（P＜0.001）、TNF-α（P=0.016）、IL-6（P＜0.001）的表達(dá)水平明顯升高。而與MPP+模型組相比，不同濃度的DHM均可不同程度的提高自噬蛋白ULK1、Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.001），降低p62的表達(dá)（P＜0.001）；同時(shí)NLRP3、IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001），且綜合比較，DHM劑量6.5 μg/mL的效果最好。此外，與DHM干預(yù)組相比，3-MA處理鈍化了DHM對(duì)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3（P=0.0652）、IL-1β（P＜0.001），以及壞死刺激蛋白TNF-α（P=0.0373）、IL-6（P=0.1070）的抑制效應(yīng)。

圖5 DHM可改善受損自噬抑制細(xì)胞焦亡和壞死Fig.5 DHM alleviates pyroptosis and necroptosis by promoting autophagy.A:Expressions of ULK1,Beclin1,LC3Ⅰand p62 in the striatum of the mice.B,C:Expressions of ULK1,Beclin1,LC3 Ⅱ/Ⅰ,p62,NLRP3,IL-1β,TNF-α and IL-6 in Bv-2 cells.Data are presented as Mean±SD and analyzed using one-way ANOVA.#P＜0.05,###P＜0.001 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs PD/MPP+.

3 討論

α-syn是PD的主要病理特征，可通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)致使DA能神經(jīng)元損傷［9］。DA神經(jīng)元可以分泌神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺，TH是多巴胺的合成限速酶。在PD早期就已出現(xiàn)黑質(zhì)DA神經(jīng)元丟失、紋狀體α-syn的增多及TH的減少，而阻止或延緩DA神經(jīng)元的丟失是有效治療PD的一種方式。既往研究發(fā)現(xiàn)，在眾多構(gòu)建PD模型的化學(xué)藥物中，MPTP/p的效果最佳［10］。在體內(nèi)MPTP被分解成MPP+，被DA 能神經(jīng)元攝取后可通過抑制胞內(nèi)線粒體呼吸鏈的形成及功能，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使神經(jīng)元損傷或死亡［11］。有研究表明急性MPTP處理（15 mg/kg，1次/2 h，4次/d）可損傷C57小鼠黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)中的DA能神經(jīng)元，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙的同時(shí)TH蛋白水平也顯著下降［12］。MPTP亞急性處理（25 mg·kg-1·d-1，5 d）同樣可誘導(dǎo)C57小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，降低紋狀體TH的表達(dá)［13］。由于慢性MPTP干預(yù)構(gòu)建PD模型所產(chǎn)生的癥狀與PD患者的臨床病理表現(xiàn)更為接近，因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們主要通過采用每周2次，為期5周的慢性干預(yù)方式構(gòu)建PD小鼠模型。運(yùn)動(dòng)行為學(xué)結(jié)果表明，PD小鼠較Control組存在明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙，黑質(zhì)和紋狀體組織內(nèi)α-syn表達(dá)增加的同時(shí)伴隨TH降低，表明PD小鼠模型存在DA能神經(jīng)元受損，慢性造模成功。

天然產(chǎn)物對(duì)PD、AD等腦神經(jīng)退行性疾病具有有效的神經(jīng)保護(hù)作用［14］。我們團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，在D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠腦衰老模型中，DHM可通過抑制miR-34a上調(diào)SIRT1和下調(diào)mTOR信號(hào)通路激活自噬，且與DHM高劑量組（200 mg/kg）相比，低劑量組（100 mg/kg）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗衰老作用［15］。此外，在D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌萎縮模型中，同樣是100 mg/kg的DHM給藥量可顯著降低細(xì)胞凋亡并促進(jìn)骨骼肌受損自噬的激活，表現(xiàn)出最佳的干預(yù)效果［16］。上述研究從側(cè)面體現(xiàn)出DHM的干預(yù)效果呈現(xiàn)非劑量-藥效依賴性，分析原因可能與其較差的血液吸收性，緩慢的清除途徑有關(guān)［17］。鑒于前期的研究基礎(chǔ)及藥效動(dòng)力學(xué)因素，本實(shí)驗(yàn)主要采用100 mg/kg作為本研究的藥物實(shí)驗(yàn)劑量。壞死性凋亡參與了腦神經(jīng)疾病的發(fā)生，而抑制壞死性凋亡可顯著改善慢性缺血性中風(fēng)小鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)炎性反應(yīng)［18］。因此，為了證明壞死性凋亡是否參與MPTP/p誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)功能障礙，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)置了壞死性凋亡抑制劑NEC-1作為模型組的陽(yáng)性對(duì)照，且行為學(xué)結(jié)果表明，NEC-1抑制劑組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力較PD組得到了顯著改善。值得一提的是，DHM干預(yù)對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響與陽(yáng)性對(duì)照NEC-1抑制劑組產(chǎn)生的保護(hù)作用相似。上述結(jié)果表明，DHM干預(yù)可顯著減輕因MPTP/p藥物毒性引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙，提高肢體協(xié)調(diào)性、恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力。Ren等［19］研究證實(shí)，DHM干預(yù)能有效促進(jìn)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型中TH蛋白的表達(dá)及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。同時(shí)，該效果與PD治療藥物左旋多巴（L-DOPA）陽(yáng)性對(duì)照組作用相似，8周DHM干預(yù)可顯著減少三苯氧胺誘導(dǎo)的PD小鼠模型中DA神經(jīng)元的死亡，改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙［20］。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能感知并響應(yīng)免疫細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。MPTP的毒性作用可激活MG，促進(jìn)小鼠黑質(zhì)組織Iba-1 和GFAP的表達(dá)［21］。有文獻(xiàn)證明在PD患者及動(dòng)物模型的黑質(zhì)-紋狀體中，存在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）的過度激活和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）可加劇DA能神經(jīng)元死亡［22,23］。由于DHM能較好的通過血腦屏障，其在抑制炎癥反應(yīng)方面具有顯著的療效［24］。已有研究表明，DHM對(duì)BAC-α-syn-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和MG介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)有較好的預(yù)防作用［5］。體外實(shí)驗(yàn)也表明，DHM可顯著減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)MES23.5細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［19］。因此，在本研究中，我們通過Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)DHM對(duì)PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和炎性介質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，PD 模型小鼠黑質(zhì)組織內(nèi)GFAP和Iba-1的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，而DHM干預(yù)后顯著降低，且對(duì)MG的抑制作用優(yōu)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，DHM還逆轉(zhuǎn)了PD小鼠紋狀體內(nèi)GFAP和Iba-1異常增高的蛋白表達(dá)。同時(shí)，通過結(jié)合RT-PCR證實(shí)DHM可從mRNA和蛋白水平全面抑制膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)，減少炎癥因子的侵潤(rùn)。MG中NLRP3炎癥小體及炎癥因子的釋放，也是引起DA能神經(jīng)元損傷的重要原因［25］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化可激活NLRP3炎癥小體，活化未成熟的Caspase1，切割GSDMD，使其成為具有成孔活性的GSDMD-N，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的完整性，引發(fā)細(xì)胞焦亡；同時(shí)釋放IL-1β和IL-18 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［26］。已有文獻(xiàn)證實(shí)MG 中NLRP3的激活可加重MPTP誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元丟失引起的運(yùn)動(dòng)功能障礙，而敲除NLRP3基因可保護(hù)DA能神經(jīng)元，改善運(yùn)動(dòng)功能［21,27］。我們的研究證實(shí)，DHM干預(yù)可顯著降低PD 小鼠紋狀體內(nèi)NLRP3、Cleaved-Caspase1/Caspase1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 的表達(dá)，抑制MPTP/p誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活及細(xì)胞焦亡，減少DA神經(jīng)元受損。此外，除了對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，DHM對(duì)血液循環(huán)系統(tǒng)中的IL-1β也有較好的抑制作用。

胞內(nèi)LDH酶的釋放水平是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PD小鼠紋狀體內(nèi)LDH的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，表明MPTP/p處理可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。而DHM可有效降低細(xì)胞毒性，降低LDH的表達(dá)抑制細(xì)胞壞死。壞死性凋亡激活的關(guān)鍵是形成活化的RIP1/RIP3/MLKL蛋白復(fù)合體，抑制RIP1則可抑制RIP1/RIP3/MLKL信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞壞死進(jìn)程［28］。已有研究證實(shí)，敲除壞死性凋亡基因RIP3/MLKL可有效減弱由MPTP 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［29］。有文獻(xiàn)表明，MPTP處理誘導(dǎo)小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的同時(shí)，體內(nèi)RIP1/RIP3/MLKL信號(hào)被激活并共定位于TH陽(yáng)性細(xì)胞，提示TH細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失與運(yùn)動(dòng)功能障礙有關(guān)［30］。為進(jìn)一步分析DHM是否是通過抑制壞死性凋亡改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙，我們檢測(cè)了壞死性凋亡的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPTP/p誘導(dǎo)的慢性PD小鼠紋狀體內(nèi)確實(shí)存在RIP1/RIP3/MLKL壞死性凋亡信號(hào)的異常激活，且與小鼠黑質(zhì)組織中TH陽(yáng)性細(xì)胞的丟失、紋狀體TH蛋白含量的下降、運(yùn)動(dòng)功能障礙呈正相關(guān)。而DHM干預(yù)后則顯著降低了PD小鼠壞死性凋亡信號(hào)，促進(jìn)TH的表達(dá)及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，表明DHM可明顯抑制MPTP/p誘導(dǎo)的壞死性凋亡，對(duì)炎癥-壞死性凋亡循環(huán)有一定的遏制作用。

自噬起始蛋白ULK1［31］、自噬泡關(guān)鍵蛋白Beclin1、參與自噬小體成熟與延伸的LC3［32］、自噬底物p62［33］等均是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白。已有研究證明DHM可通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Beclin1、LC3的表達(dá)，下調(diào)p62增加自噬小體數(shù)量，促進(jìn)自噬［34］。DHM還可通過加強(qiáng)p62與胞質(zhì)蛋白伴侶分子Keap-1的相互作用，促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生［35］。為了探究DHM改善MPTP/p焦亡和壞死性凋亡是否和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)，我們采用Western blot技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，MPTP/p誘導(dǎo)的PD小鼠存在明顯的自噬功能障礙，而DHM 處理可明顯上調(diào)PD 小鼠紋狀體內(nèi)ULK1 和Beclin1的表達(dá)，降低了LC3Ⅰ和p62的表達(dá)水平，表明DHM可逆轉(zhuǎn)MPTP/p誘導(dǎo)的自噬功能下降。此外，有研究表明自噬受限可激活NLRP3炎性小體加重MPTP誘導(dǎo)PD小鼠的DA能神經(jīng)元病變和炎癥反應(yīng)，而促進(jìn)自噬則可抑制NLRP3的激活進(jìn)而減輕炎癥［21］。同時(shí)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬水平也可增強(qiáng)抗炎作用［36］。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證自噬、焦亡和壞死性凋亡之間的關(guān)系，我們進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)探究自噬抑制劑3-MA對(duì)焦亡和壞死性凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MPP+可誘導(dǎo)Bv-2細(xì)胞出現(xiàn)自噬功能障礙和NLRP3炎癥小體的激活，DHM干預(yù)（3.25、6.5、12.5 μg/mL）可通過改善細(xì)胞受損自噬，抑制NLRP3 炎癥小體減輕細(xì)胞焦亡，且DHM 劑量6.5 μg/mL效果最好。而與DHM干預(yù)組相比，自噬抑制劑3-MA處理可鈍化DHM對(duì)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、IL-1β以及壞死趨化蛋白TNF-α、IL-6的抑制效應(yīng)，表明DHM有可能通過增強(qiáng)自噬抑制焦亡和壞死性凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究在PD動(dòng)物模型及細(xì)胞模型層面上驗(yàn)證，DHM干預(yù)可明顯改善MPTP/p誘導(dǎo)慢性PD小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力障礙，其機(jī)制可能與DHM激活自噬抑制細(xì)胞焦亡、壞死性凋亡降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。以上研究結(jié)果初步證實(shí)了DHM在MPTP/p誘導(dǎo)慢性PD動(dòng)物模型中的治療作用，但DHM介導(dǎo)的自噬激活調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。在未來的研究工作中，可利用自噬基因敲除鼠或自噬抑制劑/激動(dòng)劑體內(nèi)干預(yù)構(gòu)建PD 模型后深入探討DHM 在自噬缺陷或不同自噬條件下對(duì)PD的治療作用，為PD候選藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。