蘭玉，王凱風(fēng)，藍(lán)智賢，周何琪，孫劍

器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省病毒性肝炎研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科，廣東廣州510515

肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大原因，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康［1］。HCC是肝癌中最常見的類型，占所有病例的90%以上。盡管近幾十年來，HCC的治療已取得很大進(jìn)展，患者總生存期和生活質(zhì)量有所提高，但在大部分國家5年生存率仍不足30%［2,3］。因此，需要進(jìn)一步探索HCC的有效預(yù)防和治療手段。

紅葡萄酒是一種由葡萄釀制發(fā)酵而成的酒精飲料，含有大量活性化合物，同時(shí)含有13%左右被認(rèn)定為一級(jí)致癌物質(zhì)的酒精［4］。有證據(jù)顯示，在2020年全球所有新發(fā)癌癥病例中，有3.5%與過度飲酒和酗酒有關(guān)［5］，但是有流行病學(xué)研究表明，適度飲用紅酒與肺癌［6］、前列腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、非霍奇金淋巴瘤［9］等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，這可能與紅酒中含有的大量多酚類物質(zhì)的抑癌作用有關(guān)［10］。例如，紅酒中提取的白藜蘆醇［11］、類黃酮［12］、花青素［13］、沒食子酸［14］等均已被證實(shí)可通過相應(yīng)機(jī)制發(fā)揮對(duì)HCC的抑制作用。然而，有研究表明，由于不同多酚之間存在協(xié)同作用，相互提高生物利用度和生物效應(yīng)，多酚混合物的抑癌效果優(yōu)于單種多酚［15-17］。脫醇紅酒作為一種含有多種多酚但不含酒精的飲料，可能具有抑制HCC發(fā)生發(fā)展的作用，但是尚無研究報(bào)道證實(shí)。本研究的目的就是探索脫醇紅酒對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的影響，并通過RNA-seq探索其可能的機(jī)制，為HCC的預(yù)防和治療提供新策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 所有細(xì)胞株包括Huh7，HepG2 和SK-Hep-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括：①BALB/c-Nu小鼠，4周齡，雄性，體質(zhì)量15±2 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004）；②C57BL/6J 小鼠，2 周齡，雄性，體質(zhì)量8±2 g，購自廣東斯嘉景達(dá)生物科技有限公司（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0052）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過，并遵從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則。

1.1.2 主要試劑耗材 DMEM、PBS、胰蛋白酶（Gibco）；胎牛血清（ThermoFisher）；Cell Cycle Staining Kit、Annexin V-FITC/PI kit（Multi Sciences）；CCK-8 試劑盒（MCE）；二已基亞硝胺、四氯化碳（Sigma）；橄欖油（阿拉?。?；細(xì)胞培養(yǎng)皿、槍頭、注射器等（NEST）。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Labotect）；光學(xué)顯微鏡（Leica）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek）；生物安全柜、水平臺(tái)式離心機(jī)、-80 ℃超低溫冰箱（ThermoFisher）；真空冷凍干燥機(jī)（LaboGene）；InfluxTM流式細(xì)胞分選儀（BD Biosciences）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫醇紅酒制備 紅葡萄酒產(chǎn)自法國波爾多拉菲羅斯柴德酒莊（傳奇波爾多紅，Vol 13%）。制備方法：第1階段：將紅酒分裝至玻璃容器，密封后放入-80 ℃冰箱過夜使物料凍結(jié)；第2階段：運(yùn)行真空冷凍干燥機(jī)并預(yù)冷，待冷阱溫度降至-110 ℃時(shí)進(jìn)行下一步；第3階段：將已凍結(jié)紅酒迅速轉(zhuǎn)移至冷阱中防止其溶化，放入后旋緊氣孔，打開真空泵持續(xù)抽真空，在真空狀態(tài)（＜100 mTorr）下冷凍干燥12 h。脫醇脫水結(jié)束后密封冷凍保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將已脫水脫醇紅酒使用含10%血清的DEME溶液溶解至原體積使用，試劑盒檢測(cè)脫醇后酒精含量＜0.5%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞系均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃和5%CO2環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2000/孔的細(xì)胞密度鋪板至96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基。孵箱中培養(yǎng)8 h至細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組（Control）和實(shí)驗(yàn)組（DRW），每組5個(gè)重復(fù)孔。使用不同濃度脫醇紅酒溶液（0、5、10、25、50和100 μL/mL）培養(yǎng)48 h；使用含50 μL/mL 脫醇紅酒溶液的培養(yǎng)48和96 h。處理結(jié)束后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入10%CCK-8溶液各100 μL，孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值（A值）。細(xì)胞增殖抑制率（IR%）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對(duì)照組×100%。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以400個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板至12孔板培養(yǎng)，待貼壁后加入不同濃度脫醇紅酒（0、10、25和50 μL/mL）培養(yǎng)10 d左右。有適當(dāng)數(shù)量克隆形成時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)基并用PBS洗滌后，加入4%多聚甲醛固定20 min，再次PBS洗滌，隨后加入0.4%結(jié)晶紫染液染色20 min。染色完成后PBS洗凈染液并晾干，使用相機(jī)拍照。使用ImageJ 軟件對(duì)克隆形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.2.5 皮下異種移植腫瘤模型 選擇4周齡雄性BALB/c-nu 裸鼠18只，飼養(yǎng)于SPF 動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境2 d。將SK-Hep-1細(xì)胞以5×106/只的量接種至裸鼠右腹股溝處，接種時(shí)于皮下推注100 μL細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和實(shí)驗(yàn)組（DRW），n=9只。實(shí)驗(yàn)組每天灌胃給予脫醇紅酒300 μL，對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥28 d，每周測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑。腫瘤體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。

1.2.6 化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型 選擇12 d齡雄性C57BL/6J乳鼠，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境2 d。第14 d時(shí)腹腔注射二乙基亞硝胺（DEN，25 mg/kg）1次，第4周開始腹腔注射四氯化碳（CCL4，0.5 mL/kg，溶于橄欖油）每周1次至試驗(yàn)結(jié)束。第12周時(shí)將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=25）和實(shí)驗(yàn)組（DRW，n=12）并開始干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組每天灌胃給予脫醇紅酒300 μL，對(duì)照組給與等量生理鹽水。干預(yù)至第18周時(shí)，麻醉后采用頸椎脫臼法將小鼠處死，剖腹取出肝臟，測(cè)量并記錄肝臟腫瘤數(shù)量、最大腫瘤直徑和肝臟質(zhì)量。肝體比=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.7 RNA-seq 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組使用60 μL/mL的脫醇紅酒溶液處理，對(duì)照組不干預(yù)，培養(yǎng)48 h。使用Trizol試劑裂解細(xì)胞，以提取總RNA。委托深圳華大基因股份有限公司使用BGISEQ平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序服務(wù)，使用DESeq2對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。相關(guān)差異基因列表已公開至“國家生物信息中心國家生物信息中心OMIX 多元數(shù)據(jù)歸檔庫”（ID：OMIX004295，網(wǎng)址:https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/）。

1.2.8 基因集富集分析（GSEA）參照分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫（MsigDB）中的HALLMARK類別的基因集，對(duì)經(jīng)過篩選的差異基因（|log2FC|≥2，Q≤0.05）采用GSEA進(jìn)行基因集富集分析。將與對(duì)照組比較出現(xiàn)異常的基因集信號(hào)通路按照標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）值降序排列，結(jié)果中ES為富集分?jǐn)?shù)，NES為標(biāo)準(zhǔn)化后的富集分?jǐn)?shù)，NOMp-val為名義P值，是對(duì)ES的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，F(xiàn)DR p-val為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。當(dāng)NES 絕對(duì)值＞1，NOMp-val＜0.05 且FDRq-val＜0.25時(shí)，其通路下的基因集被認(rèn)為有意義。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù) 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，使用不同濃度脫醇紅酒溶液（0、75和150 μL/mL）培養(yǎng)48 h。分別使用Cell Cycle Staining試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒處理并收集所得的細(xì)胞，操作均按照標(biāo)準(zhǔn)化步驟進(jìn)行，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況使用FlowJo 7.6 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，采用R 3.6.0 進(jìn)行差異基因篩選，采用GSEA4.3.2 軟件進(jìn)行基因集富集分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫醇紅酒抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性

脫醇紅酒以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制Huh7和HepG2的增殖（圖1）。脫醇紅酒對(duì)兩種細(xì)胞的抑制具有劑量效應(yīng)，隨著劑量升高抑制率逐漸增大，對(duì)Huh7和HepG2的IC50分別為55.81和23.85 μL/mL。在固定濃度（50 μL/mL）下，脫醇紅酒對(duì)兩種細(xì)胞的抑制具有時(shí)間效應(yīng)，時(shí)間越久，細(xì)胞活力越弱。

圖1 DRW對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect on dealcoholized red wine(DRW)on proliferation of HCC cells.A:Inhibition rate and A valve of Huh7 cells. B: Inhibition rate and OD valve of HepG2 cells.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs DRW group.

2.2 脫醇紅酒抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力

脫醇紅酒以劑量依賴的方式抑制Huh7 和SKHep-1細(xì)胞的克隆形成能力，劑量越高克隆形成數(shù)量越少（圖2）。Huh7細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組（10、25和50 μL/mL）克隆形成數(shù)量相較于對(duì)照組均減少，其中25和50 μL/mL組顯著減少（P＜0.001，圖2B）；SK-Hep-1細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組（10、25和50 μL/mL）克隆形成數(shù)量相較于對(duì)照組均顯著減少（P＜0.001，圖2C）。

圖2 DRW對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成數(shù)量的影響Fig. 2 Effect of dealcoholized red wine (DRW) on clone formation of HCC cells. A: Gross observation of the colonies.B:Colony number of Huh7 cells.C:Colony number of Sk-Hep-1 cells.***P＜0.001 vs Control group.

2.3 脫醇紅酒抑制裸鼠異種移植腫瘤的生長(zhǎng)

脫醇紅酒的干預(yù)能夠抑制裸鼠皮下荷瘤的生長(zhǎng)，脫醇紅酒組的腫瘤生長(zhǎng)速度顯著慢于對(duì)照組（圖3）。第4周時(shí)兩組腫瘤大?。▓D3A），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤的體積（646.2±206.5 mm3）顯著小于對(duì)照組（360.7±164.3 mm3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 DRW抑制裸鼠皮下荷瘤的生長(zhǎng)Fig. 3 Dealcoholized red wine(DRW)inhibits subcutaneous HCC xenograft growth in nude mice.A:General observation of the tumors.B:Tumor growth curve of DRW and Control groups.*P＜0.05 vs DRW group.

2.4 脫醇紅酒抑制小鼠化學(xué)誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展

本實(shí)驗(yàn)采用DEN聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生，造模示意圖及兩組代表性肝臟腫瘤生長(zhǎng)情況（圖4A、B）。該模型結(jié)合了DEN誘導(dǎo)的DNA損傷和突變，及CCl4介導(dǎo)的炎癥和纖維化，最終導(dǎo)致小鼠肝臟腫瘤發(fā)生，與人類HCC的微環(huán)境具有一些共同特征［18］。結(jié)果顯示，脫醇紅酒顯著抑制小鼠肝臟腫瘤發(fā)生和發(fā)展，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組肝臟腫瘤數(shù)目（10.8±3.6）顯著少于對(duì)照組（18.2±5.9，P＜0.001，圖4C），最大腫瘤直徑（4.3±1.00 mm）顯著小于對(duì)照組（5.1±0.9 mm，P＜0.05，圖4D），肝體比（4.9±0.38）也顯著低于Control 組（5.45±0.48，P＜0.01，圖4E）。

圖4 DRW抑制化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展Fig. 4 DRW inhibits occurrence and progression of chemically induced HCC in mice.A:Experimental design of DEN/CCL4-induced mouse model.B:General view of HCC in the two groups.C-E:Tumor number,largest tumor diameter and liver/body ratio in the control group(n=25)and DRW group(n=12).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 脫醇紅酒對(duì)Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及通路的影響

對(duì)Huh7 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 共得到1112 個(gè)顯著差異基因（|log2FC|≥2，Q≤0.05），其中實(shí)驗(yàn)組上調(diào)478個(gè)，下調(diào)634 個(gè)?；蚣患治鼋Y(jié)果顯示，脫醇紅酒干預(yù)使細(xì)胞周期相關(guān)通路（包括E2F TARGETS、G2M CHECKPOINT 和MYC TARGETS 等基因集）顯著下調(diào)（表1），細(xì)胞凋亡通路（Apoptosis）顯著上調(diào)（表2）。

表1 DRW組下調(diào)信號(hào)通路Tab.1 Down-regulated signaling pathways in DRW group

表2 DRW組上調(diào)信號(hào)通路Tab.2 Up-regulated signaling pathways in DRW group

2.6 脫醇紅酒誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，脫醇紅酒能夠誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞的G1期阻滯，75 μL/mL和150 μL/mL組的G1期細(xì)胞占比[（60.5±0.63）%和（63.9±0.58）%]相比于對(duì)照組[（45.5±0.62）%]顯著增加（P＜0.001，圖5C）；同時(shí)脫醇紅酒也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，75 μL/mL和150 μL/mL組凋亡率[（46.5±1.4）%和（50.6±2.5）%]相比于對(duì)照組[（2.7±0.1）%]顯著增加（P＜0.001，圖5D）。

圖5 DRW誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡比例增加Fig. 5 DRW induces G1 phase arrest and apoptosis of Huh7 cells.A:Cell cycle distribution in DRW(75 and 150 μL/mL)and control groups.B:Flow cytometric analysis of cell apoptosis in DRW(75 and 150 μL/mL)and control groups. C: Percentage of cell population in G1,S and G2 phases in different groups. D: Cell apoptosis rates in different groups.***P＜0.001.

3 討論

HCC是一個(gè)全球性的嚴(yán)重健康問題，迫切需要我們探索新的預(yù)防和治療手段［19］。細(xì)胞周期和凋亡失調(diào)是所有腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一，也被認(rèn)為是HCC預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)［20,21］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒能夠抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，并初步探明其機(jī)制涉及脫醇紅酒誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡，這顯示了脫醇紅酒應(yīng)用于肝癌預(yù)防和治療的潛在價(jià)值。

脫醇紅酒的抗癌特性一直受到人們關(guān)注，并且在幾個(gè)靶器官中已被報(bào)道，如結(jié)腸癌、皮膚癌、神經(jīng)纖維瘤和骨肉瘤［22-25］，我們的研究結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)了脫醇紅酒能夠抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步擴(kuò)展了脫醇紅酒的應(yīng)用范圍。細(xì)胞增殖失控是癌癥早期發(fā)生和后期進(jìn)展中的核心要素，被認(rèn)為是肝癌發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)［26,27］。因此，尋找能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖的藥物是篩選抗腫瘤藥物的關(guān)鍵步驟。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒能夠以劑量和濃度依賴的方式抑制多種肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，這說明脫醇紅酒具備抗HCC的潛力。隨后，我們利用裸鼠皮下瘤和化學(xué)誘導(dǎo)肝癌小鼠模型對(duì)脫醇紅酒的抑癌作用做了進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，脫醇紅酒干預(yù)后，裸鼠腫瘤體積顯著減小，化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌的數(shù)量和大小也顯著低于對(duì)照組。這些結(jié)果均表明，脫醇紅酒具有很好的抑制HCC發(fā)生發(fā)展的作用。脫醇紅酒的抑癌作用有賴于其含有的多酚，既往已有大量研究顯示紅酒多酚具有抗癌活性［28-30］，如白藜蘆醇、類黃酮、兒茶素和花青素均已被證實(shí)具有抗肝癌作用［12,31-33］。并且，研究顯示多酚相互之間能夠通過抑制葡萄糖醛酸化和磷酸化而提高生物利用度，具有協(xié)同抗癌作用［34,35］。在使用脫醇紅酒的混合物時(shí)，可以更好地觀察到葡萄酒多酚的保護(hù)作用［36］。脫醇紅酒作為富含多酚等活性化合物的混合物，由于酒精脫除，既可避免攝入乙醇對(duì)人體健康的不良影響，又可一定程度上保持葡萄酒的風(fēng)味與化合物性質(zhì)的穩(wěn)定，并且制備方法簡(jiǎn)單成熟［37］，更具有進(jìn)一步開發(fā)為抗腫瘤藥物的應(yīng)用價(jià)值。

為了進(jìn)一步探究脫醇紅酒抑制HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，我們利用RNA-seq 對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行了mRNA 測(cè)序。GSEA分析發(fā)現(xiàn)，脫醇紅酒的干預(yù)能夠顯著下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)通路的基因集（包括E2F Targets、G2M Checkpoint和MYC Targets），同時(shí)顯著上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)通路基因（APOPTOSIS）。有研究顯示，E2F靶點(diǎn)和G2M檢查點(diǎn)相關(guān)基因在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)［38］。E2Fs是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，主要調(diào)控G1-S期細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄，E2F靶點(diǎn)基因的異常表達(dá)會(huì)激活致癌E2F的活性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制的增殖［39］。靶向細(xì)胞周期，包括影響E2F活性的細(xì)胞周期成分，被證明是癌癥治療的關(guān)鍵策略［40］。G2M檢查點(diǎn)也是抗腫瘤藥物開發(fā)的領(lǐng)域之一，許多靶向G2M 檢查點(diǎn)的小分子抑制劑能夠用于治療癌癥［41,42］。有研究顯示紅酒多酚共同作用能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡的方式協(xié)同保護(hù)結(jié)腸癌［17,43］。結(jié)合我們的結(jié)果，提示脫醇紅酒可能通過細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)通路基因的介導(dǎo)從而發(fā)揮抑癌作用。接下來，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)驗(yàn)證了脫醇紅酒對(duì)細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。結(jié)果顯示，脫醇紅酒能夠阻滯細(xì)胞周期從G1期到S期的過度，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與以上結(jié)果相符。這些結(jié)果提示脫醇紅酒可能通過細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)通路基因的介導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯和凋亡從而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。需要說明的是，脫醇紅酒作為多種活性化合物的混合物，其抑制HCC的機(jī)制可能是多方面、多靶點(diǎn)的［44］。我們的結(jié)果雖尚未闡明脫醇紅酒發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)，但為后續(xù)研究提供了一定的參考依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明脫醇紅酒能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡從而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果為HCC預(yù)防和治療提供了新思路和潛在手段，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步闡明其潛在機(jī)制和具體靶點(diǎn)以促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化。