吳秀華，范應(yīng)靜，葉永濃，李萍，朱青安，陳澤森，李博，王文，鄭磊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，2脊柱骨科，廣東 廣州 510515；3廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州511400

生酮飲食（KD）是一種高脂肪、充足蛋白質(zhì)和極低碳水化合物的配方飲食方案，它模仿機(jī)體禁食狀態(tài)時(shí)的代謝來誘導(dǎo)酮體的產(chǎn)生，可提高血液中β-羥丁酸水平［1］。近年來KD治療在神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌和代謝性疾病、心臟疾病、炎癥性疾病以及腫瘤中取得了一定成效［2］。然而其不良反應(yīng)如尿液改變、骨密度降低、神經(jīng)病變、心血管疾病和腎結(jié)石的發(fā)生等引起關(guān)注［3,4］。早在1979年報(bào)道，KD療法與骨質(zhì)疏松相關(guān)［5］，KD治療難治性癲癇時(shí)，患者骨礦物質(zhì)含量進(jìn)行性丟失［6］，這些臨床研究提示，KD治療癲癇患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)不僅來之癲癇發(fā)作，而且因骨密度（BMD）降低而增加骨折風(fēng)險(xiǎn)［7］；兒童正處于生長(zhǎng)階段，KD用于治療兒童耐藥性癲癇尤其要關(guān)注其對(duì)骨骼的負(fù)面影響。我們針對(duì)KD對(duì)骨代謝的影響進(jìn)行研究，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)KD降低了松質(zhì)骨的骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁的連接程度，減少皮質(zhì)骨的橫截面積，降低骨力學(xué)強(qiáng)度，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)疏松的程度接近經(jīng)典去勢(shì)模型；且KD小鼠的骨髓腔中成骨細(xì)胞減少，破骨細(xì)胞增多［8,9］。骨髓中細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞。骨髓細(xì)胞可產(chǎn)生可溶性因子進(jìn)行細(xì)胞間通訊，形成骨髓微環(huán)境［10］，任何骨髓微環(huán)境的干擾都可能導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)的破壞［11］。我們前期根據(jù)高脂飲食及熱量限制飲食的文獻(xiàn)報(bào)道總結(jié)了KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因，骨髓微環(huán)境改變是其中原因之一［12］，但具體機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序可對(duì)特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有mRNA進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)參考基因組，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)mRNA序列、豐度、基因結(jié)構(gòu)和新轉(zhuǎn)錄本等的分析，探尋差異表達(dá)基因及信號(hào)通路，已在疾病機(jī)制探討、疾病分型、疾病生物標(biāo)志物研究等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用［13］，但未見轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的研究報(bào)道。

本研究通過提取KD小鼠骨髓細(xì)胞的RNA，行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序和生物信息學(xué)的分析，篩選與正常飲食組的差異基因及相關(guān)通路，并進(jìn)一步通過RT-qPCR驗(yàn)證差異基因，為探究KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為預(yù)防KD引起骨質(zhì)疏松提供思路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型與分組

16只8周齡，體質(zhì)量16～18 g的雌性C57BL/6J小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供（倫理編號(hào)為：NFYY-2021-0969），隨機(jī)分為生酮飲食（KD）組和正常飲食（Sham）組，每組8 只。KD 組小鼠喂養(yǎng)生酮飼料（Zeneca），其碳水化合物與脂肪的比例為1：3；Sham組給予普通飼料喂養(yǎng)，所有動(dòng)物均喂養(yǎng)3個(gè)月。

普通飼料購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每100 g普通飼料熱量為1338 kJ，含蛋白質(zhì)14.5 g，脂肪4 g，碳水化合物55.5 g，膳食纖維4.5 g，鈣720 mg，磷600 mg，維生素D 2.5 μg；每100 g 生酮飼料熱量為2804 kJ，含蛋白質(zhì)18.2 g，脂肪65.1 g，碳水化合物2.7 g，膳食纖維7.4 g，鈣500 mg，磷300 mg，維生素D 2.5 μg。

1.2 體質(zhì)量、血糖和血酮監(jiān)測(cè)

每14 d（2周）每組隨機(jī)選取6只小鼠測(cè)量其體質(zhì)量，每次每組選取3只小鼠通過剪尾采血，并用血糖儀（JPS-5怡成）、血酮儀（MeterT-1 Sentest Inc.）測(cè)量血糖和血酮。

1.3 骨微結(jié)構(gòu)分析

喂養(yǎng)3個(gè)月后，用異氟烷氣體麻醉過量麻醉使小鼠安樂死。取小鼠雙側(cè)股骨，左側(cè)用于提取骨髓細(xì)胞中的RNA，行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)。右側(cè)股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，用于骨微結(jié)構(gòu)分析。

將獲取的小鼠右側(cè)股骨垂直放入Micro-CT 標(biāo)本杯中，行Micro-CT（μ80，瑞士Scanco）掃描分析。預(yù)掃完畢后，選擇股骨遠(yuǎn)端1/3的區(qū)域進(jìn)行掃描。設(shè)置掃描參數(shù)：電壓為55 kV，電流為145 μA，層厚為12 μm。掃描完畢選取圖層中沒有股骨髁的層面，數(shù)100層進(jìn)行松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)分析，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁間隙（Tb.Sp）、各向異性程度（DA）、骨小梁連接密度（Conn.D）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）、骨密度（BMD of TV）、骨組織密度（BMD of BV）等參數(shù)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

提取小鼠股骨骨髓細(xì)胞總RNA并進(jìn)行濃度、純度及完整性檢測(cè)，質(zhì)檢滿足要求后，RNA樣本質(zhì)檢結(jié)果見表1。遵照試劑盒（TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit）說明書進(jìn)行操作。純化提取總RNA中的信使RNA（mRNA）并打斷mRNA成為200-300 bp片段。進(jìn)一步合成第一鏈cDNA及第二鏈cDNA，構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)。對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)補(bǔ)平，在3’端加個(gè)A，再在鏈接酶的作用下加上測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段的選擇，去除多余的接頭序列，PCR擴(kuò)增富集文庫(kù)片段，文庫(kù)大小在300～400 bp。檢測(cè)文庫(kù)大小（Agilent2100 Bioanalyzer），熒光定量檢測(cè)文庫(kù)總濃度（Quantifluor-ST fluorometer，Promega；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，Invitrogen），qPCR 定量檢測(cè)有效文庫(kù)濃度（Thermo Scientific StepOnePlus Real-Time PCR Systems），根據(jù)文庫(kù)的有效濃度、文庫(kù)需要得到的數(shù)據(jù)量，將含有不同index序列的文庫(kù)按比例進(jìn)行混合?；旌衔膸?kù)統(tǒng)一稀釋到2 nmol/L，通過堿變性，形成單鏈文庫(kù)。Illumina HiSeq平臺(tái)上機(jī)測(cè)序，以單鏈文庫(kù)為模板進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增、測(cè)序引物退火、邊合成邊測(cè)序。樣本處理、上機(jī)測(cè)序及生物信息分析由南京派森諾基因科技有限公司完成。

表1 RNA樣本質(zhì)檢表Tab.1 Quality check table for RNAsamples

1.5 生物信息分析

采用Excel軟件t檢驗(yàn)對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄組學(xué)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行P值計(jì)算，再按照倍數(shù)變化值的計(jì)算公式計(jì)算，過濾掉接頭以及低質(zhì)量序列并篩選出P＜0.05且log2FC絕對(duì)值＞1的基因。在DAVID網(wǎng)站進(jìn)行基因本體（GO）富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按RNAiso Plus（Takara）說明書提取總RNA，檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞RNA濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增兩步法對(duì)DEGs法進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將目的基因擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)內(nèi)參校正后，以空白組的目的基因擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照，2-△△Ct法比較不同樣品間mRNA的表達(dá)量差異。引物信息見表2。

表2 逆轉(zhuǎn)錄PCR 引物序列Tab.2 Primer sequences for reverse transcription PCR

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，不同時(shí)間點(diǎn)兩組動(dòng)物體質(zhì)量、血糖、酮體水平變化采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行評(píng)價(jià)，兩組間骨結(jié)構(gòu)參數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的體質(zhì)量、血糖、血酮結(jié)果

兩組小鼠在2周、4周、6周、8周、10周和12周測(cè)量的體質(zhì)量、血糖水平、血酮水平如圖1所示，兩組間體質(zhì)量、血糖水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組間血酮體水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 生酮飲食和正常飲食小鼠的體質(zhì)量、血糖、血酮水平Fig. 1 Body weight(A),blood glucose(B)and blood ketone(C)of the mice in the Sham and KD groups.*P＜0.05 vs Sham group.

2.2 小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)

Micro-CT的2D和3D圖可見，KD小鼠松質(zhì)骨的骨小梁間隙變大，骨小梁數(shù)量減少，骨密度降低（圖2）。

圖2 遠(yuǎn)端股骨骨松質(zhì)Micro-CT 圖Fig. 2 Micro-CT images of the distal femurs of the two groups.

KD 組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨體積分?jǐn)?shù)（P=0.0039）、骨小梁數(shù)量（P=0.0001）、骨小梁連接密度（P=0.0021）、骨密度（P=0.0050）低于Sham組，且骨小梁分離度升高（P=0.0158），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的骨小梁厚度（P=0.8895）、骨小梁結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（P=0.5306）、骨組織密度（P=0.9927）沒有明顯差異（表3）。

表3 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.3 Structural parameters of the cancellous bone in the distal femur in the two group mice

2.3 DEGs分析

采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)Sham組和KD組的基因表達(dá)進(jìn)行了分析比較，測(cè)量基因總數(shù)16 667 個(gè)。以差異倍數(shù)log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如圖3A所示，共有165個(gè)差異基因，其中91個(gè)基因上調(diào)，74個(gè)基因下調(diào)，按Pval值大小排序，前20位差異基因如圖3B所示。篩選KD對(duì)比Sham小鼠差異基因Padj＜0.05且FC＞2的基因作為進(jìn)一步研究的基因，共篩得5個(gè)差異基因，分別為Acot1、Mpig6b、Gp9、Ppbp、Slc2a9（表4）。

圖3 Sham組與KD組顯著差異基因表達(dá)分布及前20位基因聚類圖Fig. 3 Distribution of the significantly differentially expressed genes(A)and cluster map of the top 20 differential genes (B) between Sham and KD groups.In A,the gray dashed line represents the threshold line of the differential gene screening criteria,the blue dot represents the down-regulated gene with significant difference,the red dot represents the up-regulated gene with significant difference,and the gray dot represents the non-significant differential gene.

表4 生酮飲食對(duì)比正常飲食小鼠顯著差異基因Tab.4 Significantly differentially expressed genes in ketogenic diet group compared with normal diet group

2.4 GO富集分析

以log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因進(jìn)行GO富集分析，分析結(jié)果顯示，KD治療組相比Sham組的差異基因主要富集在黏膜的免疫反應(yīng)、器官和組織特異性免疫反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)、對(duì)外界刺激的反應(yīng)等生物過程（圖4）。細(xì)胞組分的富集結(jié)果顯示，差異基因主要分布在細(xì)胞外區(qū)部分、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)、纖維膠原三聚體、帶狀膠原纖維等部位。

圖4 Sham組和KD組差異基因GO功能富集的氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of GO functional enrichment of the differential genes between Sham and KD groups.The color and size of the bubbles indicate the size of the P value of each item and the number of differential genes that the item contains,respectively.

2.5 KEGG Pathway分析

對(duì)log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選的差異表達(dá)基因結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖5所示，差異基因主要參與了人類疾病、機(jī)體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程等。在環(huán)境信息處理信號(hào)通路中，Apelin信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體互作通路、MAPK信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用通路的富集程度和差異基因數(shù)均較高，尤以Apelin信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體互作通路最明顯。

圖5 Sham組與KD組差異基因的KEGG Pathway分析Fig. 5 KEGG pathway analysis of the different genes between Sham and KD groups.

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證顯著差異基因表達(dá)

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，為了進(jìn)一步驗(yàn)證和明確KD組相較于Sham組基因表達(dá)差異，篩選Padj＜0.05且FC＞2的顯著上調(diào)差異基因，采用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，各基因均明顯上調(diào)，Acot1上調(diào)倍數(shù)為2.49±0.665（P=0.01），Mpig6b上調(diào)2.58±0.474倍（P=0.02），Gp9上調(diào)1.58±0.199倍（P=0.01），Ppbp上調(diào)2.59±0.611倍（P＜0.01），Slc2a9上調(diào)1.45±0.162倍（P=0.00），其中上調(diào)倍數(shù)最明顯的基因?yàn)锳cot1、Mpig6b和Ppbp（圖6）。

圖6 KD組關(guān)鍵基因驗(yàn)證結(jié)果Fig. 6 Verification the differentially expressed genes in KD-fed mice using RT-PCR (Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01 vs Sham group.

3 討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析KD小鼠骨髓細(xì)胞的差異基因及通路富集，發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞的Acot1、Mpig6b、Gp9、Ppbp、Slc2a9基因顯著上調(diào)，Apelin 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體互作通路、MAPK信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用通路的富集程度和差異基因數(shù)均較高，前三者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集程度顯著。進(jìn)一步RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明KD小鼠骨髓細(xì)胞上調(diào)最明顯的基因?yàn)锳cot1、Mpig6b和Ppbp。

?；o酶A硫酯酶1（Acot1）作為一種胞質(zhì)酶，位于細(xì)胞質(zhì)中，啟用?；o酶A水解酶活性，參與酰基輔酶A代謝過程、長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過程和非長(zhǎng)鏈的脂肪酸代謝過程。已有研究表明，在禁食期間Acot1 調(diào)節(jié)PPARα（過氧化物酶體增殖物激活受體）耦合脂肪酸通量與氧化能力，且Acot1敲低能降低PPARa基因的表達(dá)，Acot1 過表達(dá)會(huì)驅(qū)動(dòng)PPARα活性［14］。PPARα是PPAR三種亞型之一，PPAR另一亞型PPAR-γ能介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化，減少了骨形成［15］，PPARα在骨代謝中的報(bào)道比較少。有學(xué)者推測(cè)PPARα的激活參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化以及骨代謝，抑制氧化應(yīng)激緩解骨質(zhì)疏松［16］。本研究骨髓細(xì)胞中Acot1基因顯著上調(diào)，Acot1上調(diào)可能促進(jìn)PPARα活性，但是否導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，需要進(jìn)一步研究。

Mpig6b在人和小鼠中具有直系同源生理作用，調(diào)節(jié)血小板的產(chǎn)生和功能，鼠中Mpig6b位點(diǎn)的缺失可導(dǎo)致大血小板減少和骨髓纖維化［17］。另有文獻(xiàn)［18］報(bào)道，Mpig6b基因缺乏的雌性小鼠從8周齡開始出現(xiàn)股骨皮質(zhì)骨厚度增加，骨髓面積減少，到16周齡時(shí)髓腔被骨小梁阻塞；Mpig6b缺乏雄性小鼠僅在骨干近端的髓腔發(fā)育少量的骨小梁，并且在16周時(shí)表現(xiàn)出骨體積分?jǐn)?shù)和小梁厚度的暫時(shí)降低。由此可見Mpig6b基因與骨代謝相關(guān)，Mpig6b基因缺乏導(dǎo)致骨硬化，那么其過表達(dá)可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Mpig6b基因上調(diào)，我們推測(cè)Mpig6b基因上調(diào)可能是KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松機(jī)制之一，需要進(jìn)一步研究。

Ppbp（CXCL7）編碼的蛋白質(zhì)是一種血小板衍生的生長(zhǎng)因子，屬于CXC趨化因子家族，是中性粒細(xì)胞的引誘劑和激活劑，能刺激各種細(xì)胞過程。Ppbp作為一種趨化因子，被鑒定為一種新的MMP-13底物和破骨細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)因子［19］。有文獻(xiàn)報(bào)道，RANKL和M-CSF存在下用阻斷抗體處理RAW264.7細(xì)胞和小鼠BMC，阻斷SDF-1，CXCL7和CX3CL1，強(qiáng)烈抑制小鼠BMC中的TRAP活性，表明Ppbp趨化因子是從小鼠BMC分泌的，并且與破骨形成有關(guān)［20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KD小鼠Ppbp（CXCL7）基因上調(diào)，這可能促進(jìn)了破骨細(xì)胞的形成及分化，從而導(dǎo)致骨吸收能力增加，破壞了骨平衡。

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)差異基因在Apelin信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體互作通路等信號(hào)通路富集高。Apelin是一種參與骨穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源性脂肪因子，Apelin-13激活了BMSCs中的線粒體自噬，改善氧化應(yīng)激，恢復(fù)成骨功能［21］。PI3K-Akt通路是經(jīng)典的骨代謝通路之一，由杜仲組成的混合物清氏丸通過PI3KAkt通路和ATM通路抑制鐵死亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有治療作用［22］。也有研究表明鎘通過P2X7/PI3K/AKT通路介導(dǎo)了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化［23］，引起骨質(zhì)疏松。ECM受體互作通路涉及一系列生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、增殖和凋亡，ECM受體互作通路與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)［24］，此外，有研究報(bào)道了ECM受體互作通路調(diào)節(jié)人MSC的成骨分化［25］。由此可見，以上三條通路可能是KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵通路，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，雖然差異基因在MAPK信號(hào)通路富集不如前三條通路高，已有研究表明，MAPK信號(hào)通路可以通過激活多種骨標(biāo)志物的表達(dá)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化［26］，MAPKs及其下游轉(zhuǎn)錄因子如ERK1/2、p38和JNK已被發(fā)現(xiàn)與其他諸如堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白等多種成骨細(xì)胞表型標(biāo)記物協(xié)同激活［27］。MAPK通路也可能是KD治療導(dǎo)致的骨生成和骨吸收不平衡進(jìn)而形成骨質(zhì)疏松的通路。

本研究有幾個(gè)局限性，首先，我們僅使用雌性小鼠作為研究對(duì)象，雖然骨髓細(xì)胞中的雌激素水平有限，然而雌激素的干擾可能無法完全排除。如果能同時(shí)研究雄性小鼠和雌性小鼠在KD代謝中骨髓細(xì)胞基因的改變更加嚴(yán)謹(jǐn)。其次，本研究只用RT-qPCR驗(yàn)證差異基因，后續(xù)研究我們將用KD不同代謝產(chǎn)物干預(yù)骨相關(guān)細(xì)胞，并驗(yàn)證其差異基因及蛋白表達(dá)，深入研究KD引起骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制，為KD引起骨質(zhì)疏松提供預(yù)防思路。

綜上所述，本研究表明KD小鼠導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的差異基因在多個(gè)細(xì)胞外組分與信號(hào)通路中富集，其中Acot1、Mpig6b、Ppbp為差異顯著基因，可能在KD引起的骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。通路富集中以Apelin信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體互作信號(hào)通路富集程度顯著。本研究為KD引起骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為預(yù)防KD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松提供思路。