李洪濤，鄧宇，王添樂，黃克勇，于傳沛，陳朝俊

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2連山縣小三江鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，廣東 清遠(yuǎn) 513224；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病科，廣東 廣州510800

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是大多數(shù)心肌梗死、卒中以及致殘性外周動(dòng)脈疾病的誘因，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。內(nèi)皮細(xì)胞炎癥是AS始動(dòng)因素和推動(dòng)因素，表現(xiàn)為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）沉積、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及血管壁上斑塊的形成和堆積［2］。細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的由消皮素D（GSDMD）介導(dǎo)的一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式［3］，與AS病理過程關(guān)系密切［4］，而核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活下游的caspase家族是導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑［5］，其分子機(jī)制之一為caspase-1 激活，切割GSDMD使細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞破裂并釋放IL-1β等炎癥因子［6］，引發(fā)AS并促進(jìn)其發(fā)展。NF-κB是一個(gè)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族，也是已知的NLRP3主要激活因素，可提高NLRP3的mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的合成，并推動(dòng)其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［7］，NF-κB1（p50）是NF-κB家族的主要成員之一。相關(guān)研究表明，ox-LDL可通過NF-κB信號(hào)通路，激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致caspase-1前體被活化并促進(jìn)IL-1β分泌［8］，引發(fā)細(xì)胞焦亡，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AS的發(fā)生和進(jìn)展。

AS可歸屬于中醫(yī)“脈痹”、“胸痹”、“中風(fēng)”等范疇［9］，以元?dú)馓澨摓楸?，病邪?nèi)生為標(biāo)。元?dú)馓澨?，運(yùn)轉(zhuǎn)無力而氣機(jī)壅滯，氣虛無法助血運(yùn)，則血停而為瘀，形成“氣虛-氣滯-血瘀”的病理過程，而血脈不通、停而為瘀是AS核心病機(jī)，“瘀久化熱，醞釀成毒”形成的“瘀毒互結(jié)”是AS產(chǎn)生及斑塊破裂的關(guān)鍵［10］。廣東省名中醫(yī)陳朝俊教授針對(duì)AS“因虛而滯，因滯而瘀”特點(diǎn)所研制的中成藥“參七脈心通膠囊”具有良好的抗AS作用［11］，前期研究表明其作用機(jī)制可能與干預(yù)NF-κB有關(guān)［12］。丹參是其主要藥物組成之一［13］，味苦能泄，性寒能除熱，具有“活血，祛瘀，涼血”等作用［14］，《重慶堂隨筆》謂之“降而行血，血熱而滯者宜之”［15］，《本草匯言》亦稱其“善治血分，去滯生新”［16］，切中AS“瘀久化熱，瘀毒互結(jié)”的關(guān)鍵病機(jī)。丹參及其制劑現(xiàn)已在抗AS、抗腫瘤及治療腦卒中、冠心病、心絞痛等方面廣泛應(yīng)用［17］。丹參新醌乙是丹參二萜醌類有效成分［18］，已有研究表明該類成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用［19］，而相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)丹參新醌乙對(duì)NF-κB通路具有抑制作用［20］，但其下游反應(yīng)涉及的相關(guān)因子及機(jī)制尚不明確。此外，國(guó)內(nèi)外尚缺乏關(guān)于丹參新醌乙抗AS及其作用機(jī)制的相關(guān)研究?；诖耍狙芯繑M從NF-κB/NLRP3信號(hào)通路入手，探討丹參新醌乙對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響并從體外水平分析其抗AS的可能機(jī)制，以期為藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），由廣州合創(chuàng)生物提供。

丹參新醌乙（Biopurify）；ox-LDL（翊圣生物）；胎牛血清、Ham's F-12K（Kaighn's）培養(yǎng)基、PBS磷酸鉀緩沖液、青鏈霉素（Hyclone）；肝素（北京索萊寶）；牛內(nèi)皮細(xì)胞促分裂劑（ECGS Bovine）（Adooq）；總RNA抽提試劑（Trizol）（Invitrogen）；引物由上海生工定制合成；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（Takara）；極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK-8溶液(碧云天)；LDH測(cè)試盒（南京建成）；Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)(1∶4000)、Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(1∶5000)(southern biotec)；peroxidase-Rabbit Anti-Goat IgG (1∶3000)、peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG(1∶2000)(武漢博士德)；Anti-beta-Actin antibody (1∶10000)、Anti-NLRP3 antibody(1∶1000)、Anti-IL-1β antibody(1∶1000)、Anti-NFκB p105/p50 antibody(1∶1000)(Bioss)；蛋白marker(Thermo)；Anti-cleaved N-terminal GSDMD antibody(1∶1000) (Abcam)；Anti-Cleaved caspase-1 antibody(1∶1000)(Cell Signaling)；GSDMD 抗 體-N-terminal(Affinity)。

1.2 儀器

潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰）；低速離心機(jī)（中科中佳）；倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；分析天平（德國(guó)賽多利斯）；控溫磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀（Bio-Rad）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA）；旋渦混合器（海門其林貝爾）；電熱恒溫水槽（上海一恒）；Real Time PCR儀（ABI）；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、電泳儀、半干轉(zhuǎn)移電泳槽、顯影儀（上海天能）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海天美）；核酸蛋白檢測(cè)儀（上海嘉鵬）。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)

取出復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸掉舊培養(yǎng)液，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入trypsin-EDTA溶液（1 mL/25 cm2，2 mL/75 cm2），吹打散細(xì)胞，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，然后離心收集細(xì)胞。以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，補(bǔ)足3n（n為傳代瓶數(shù)）mL培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)條件為5%CO2、飽和濕度、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱。

1.4 CCK-8法篩選最佳藥物濃度及作用時(shí)間

用DMSO 溶解藥物，配成5 mg/mL母液，微孔過濾，-20 ℃長(zhǎng)期保存，加藥時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，消化細(xì)胞后吹打散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，分到96孔板，1×104/孔，待細(xì)胞貼壁后，分為處理組（分別加入50、100、500、1000、2000ng/mL丹參新醌乙）和對(duì)照組（一組不進(jìn)行處理，另一組加入DMSO），恒溫37℃，5%CO2培養(yǎng)24、48、72 h，收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞按1∶10比例加入CCK-8溶液，孵育2 h后，酶標(biāo)儀讀板，CCK-8檢測(cè)讀取A450nm數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示不同濃度丹參新醌乙對(duì)HUVECs 處理48 h有微弱的增殖抑制作用，處理72 h后增殖抑制有較明顯的增強(qiáng)并有一定劑量效應(yīng)；而處理24 h的分組中，不同濃度丹參新醌乙對(duì)細(xì)胞無明顯的增殖抑制作用，故選擇100 ng/mL，處理24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。同時(shí)設(shè)置以DMSO處理的HUVECs作對(duì)照。

1.5 造模與分組

取HUVECs分為4組；正常組，ox-LDL組、二甲基亞砜（DMSO）組和丹參新醌乙組。干預(yù)方式如下：正常組為HUVECs加入10%胎牛血清，ox-LDL組在正常組基礎(chǔ)上加入100 μg/mL（濃度選擇參考既往相關(guān)研究［21］的結(jié)果）的ox-LDL構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，DMSO組在ox-LDL組基礎(chǔ)上加入0.1%濃度藥物溶劑DMSO，丹參新醌乙組在ox-LDL組基礎(chǔ)上分別加入用DMSO溶解的100 ng/mL濃度丹參新醌乙，置于條件為37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 微板法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）水平 取HUVECs在6孔板接種2×105/孔，在條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，分別按上述各組干預(yù)方式進(jìn)行處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6.2 qRT-PCR 法檢測(cè)NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA表達(dá) 按每個(gè)培養(yǎng)皿5×107個(gè)將HUVECs接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，分別按上述各組干預(yù)方式進(jìn)行處理，培養(yǎng)24 h后，按照總RNA 抽提試劑Trizol 說明書操作，提取各組細(xì)胞總RNA，按照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Primer 3.0設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物序列見表1，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對(duì)無非特異性擴(kuò)增，進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，反應(yīng)參數(shù)參考TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進(jìn)行，RT-PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線應(yīng)用ABI VII a7 Real-Time PCR System 的操作方法進(jìn)行，對(duì)NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的基因進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR各基因所用引物序列及產(chǎn)物片段Tab.1 Primer sequences for RT-PCR and the product length

1.6.3 Western blot 檢測(cè)NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N的蛋白表達(dá) 在6孔板上接種HUVECs，待覆蓋率達(dá)到80%～90%時(shí)對(duì)各組進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)并培養(yǎng)24 h，后取樣品1000 r/min離心10 min，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，再1000 r/min 離心5 min 后棄上清，PBS 洗滌，1000 r/min離心5 min后吸去PBS溶液，加入提取緩沖液以4 ℃輕搖15 min，收集裂解液以14 000 r/min離心15 min后取上清，以BCA法測(cè)量蛋白濃度。按2∶1加入上樣緩沖液充分混合，煮沸變性5 min，凍存?zhèn)溆茫瑓⒄照f明書進(jìn)行SDS-PAGE電泳（80 V恒壓50 min，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部），將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉1 h，封閉結(jié)束后以TBST洗膜3次，每次5 min，1∶1000稀釋比例一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗稀釋液37 ℃孵育1 h，洗膜，蒸餾水漂洗膜2 min，棄去液體，共洗3次，后將雜交膜置于一透明塑料板上，用干移液器將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，使反應(yīng)持續(xù)5 min，濾紙吸去膜表面多余底物溶液，放至暗盒，最后進(jìn)行顯影。

1.6.4 免疫熒光法觀察GSDMD表達(dá) 在24孔板上按2×104/孔接種HUVECs，同上方法處理后，吸除廢液，PBS 洗滌2次，通透，封閉。加入一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min。標(biāo)記二抗（GSDMD抗體-Nterminal，以1∶200 比例稀釋），37 ℃孵育1 h，PBS 洗3次，每次5 min。滴入DAPI，孵育15 min，PBS漂洗后加入防熒光淬滅劑，封片，最后用熒光顯微鏡獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間Western blot灰度值統(tǒng)計(jì)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，其余兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組LDH水平比較

與正常組比較，ox-LDL組、DMSO組LDH濃度水平明顯增加（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組LDH濃度水平顯著下降（P＜0.05，圖1）。

圖1 LDH濃度比較Fig. 1 Comparison of lactate dehydrogenase concentration in the supernatant of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)among the groups.A:Standard curve of sodium pyruvate.B:Comparison of lactate dehydrogenase concentration.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

2.2 NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA 表達(dá)比較（圖2）

圖2 各組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA表達(dá)水平比較Fig. 2 Comparison of NF-κB1,NLRP3,GSDMD and IL-1β mRNA expression levels among the groups.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

與正常組比較，ox-LDL 組、DMSO 組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA 水平均有顯著上調(diào)（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA水平均有顯著下調(diào)（P＜0.01）。

2.3 NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達(dá)水平比較

Western Blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達(dá)差異，對(duì)各蛋白平均灰度值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果（圖3）顯示：與正常組比較，ox-LDL 組、DMSO 組NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖3 NLRP3、GSDMD-N、caspase-1、IL-1β、NF-κB1蛋白表達(dá)水平比較Fig. 3 Protein expression levels in each group. A:Western blot of NLRP3,GSDMD-N,caspase-1,IL-1β and NF-κB1 proteins. B: Relative expressions of these proteins.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

2.4 細(xì)胞免疫熒光及GSDMD表達(dá)

經(jīng)ox-LDL處理后，GSDMD表達(dá)水平明顯上升，免疫熒光圖片表明ox-LDL處理的GSDMD有侵犯細(xì)胞質(zhì)的表現(xiàn)，且有明顯入核蛋白出現(xiàn)。而經(jīng)丹參新醌乙處理后，GSDMD整體表達(dá)水平明顯下降，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)下降，提示丹參新醌乙可有效限制GSDMD的表達(dá)，減輕細(xì)胞形態(tài)破壞（圖4）。

圖4 GSDMD表達(dá)和定位的免疫熒光染色Fig. 4 Immunofluorescence staining for observing gaselermin D (GSDMD) expression and localization (Original magnification:×400).

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AS發(fā)生的始動(dòng)因素，而炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用，促炎因子的產(chǎn)生加劇AS的進(jìn)程，導(dǎo)致斑塊增厚、破裂、積聚、血栓形成，從而引起急性心腦血管疾?。?2］。在這一過程中，ox-LDL通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放單核細(xì)胞趨化蛋白-1促進(jìn)單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮黏附，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的生成使促炎相關(guān)基因表達(dá)增加并加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷［23］。GSDMD是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白，其受到活化后可分解成N端（GSDMD-N）和C端（GSDMD-C)，GSDMD-N可與細(xì)胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合，發(fā)生多聚化并在細(xì)胞質(zhì)膜上形成孔洞，細(xì)胞質(zhì)膜遭受破壞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［24］。我們使用ox-LDL對(duì)HUVECs進(jìn)行處理，以LDH作為HUVECs損害的標(biāo)志產(chǎn)物［25］，并以免疫熒光標(biāo)記及觀察，結(jié)果表明ox-LDL處理可導(dǎo)致HUVECs損傷，且GSDMD在細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)并具有入核表現(xiàn)，與上述結(jié)論一致。而經(jīng)過丹參新醌乙處理后HUVECs損傷明顯減少，且能抑制GSDMD表達(dá)，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在細(xì)胞免疫、炎癥、焦亡等過程起著至關(guān)重要的作用［26］，其家族成員NF-κB1在通常情況下被前體蛋白p105隔離而穩(wěn)定在細(xì)胞質(zhì)中。穩(wěn)定結(jié)構(gòu)破壞后，NF-κB1可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，使NF-κB信號(hào)通路活化［27］。無活性的NLPR3受到引爆或啟動(dòng)信號(hào)的激活而發(fā)生寡聚化，繼而組裝成NLPR3炎癥小體［28］，同時(shí)觸發(fā)procaspase-1向caspase-1的轉(zhuǎn)化以及成熟IL-1β的分泌［29,30］，裂解GSDMD并將其切割成GSDMD-N和GSDMD-C，成熟的IL-1β等可通過GSDMD-N形成的跨膜孔隙釋放到胞外并造成炎癥惡化［31］，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生。本研究中，經(jīng)ox-LDL處理后NF-κB1的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高，證實(shí)了ox-LDL能破壞其與前體蛋白組成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，NLPR3表達(dá)提高，且表明NF-κB 信號(hào)具有活化NLPR3 促進(jìn)NLPR3炎癥小體生成的作用。NF-κB/NLPR3通路激活后，損傷的HUVECs中caspase-1、IL-1β、GSDMD-N表達(dá)均明顯升高，表明ox-LDL可誘發(fā)NF-κB/NLPR3活化后引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞焦亡。經(jīng)丹參新醌乙處理后，NF-κB1表達(dá)作用被抑制，GSDMD表達(dá)下降，質(zhì)膜成孔及入核表現(xiàn)抑制，細(xì)胞完整性得到保護(hù)，提示丹參新醌乙具有保護(hù)NF-κB穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及抑制GSDMD表達(dá)的作用，且通過阻止NF-κB/NLPR3信號(hào)通路的激活，抑制NLPR3活化，干預(yù)NLPR3炎癥小體的形成，抑制GSDMD裂解，阻止后續(xù)級(jí)聯(lián)事件的發(fā)生，從而抑制細(xì)胞焦亡反應(yīng)。

相關(guān)研究表明，NF-κB信號(hào)通路激活導(dǎo)致血管壁損傷是斑塊形成的重要原因［32］，NLRP3的活化及NLRP3炎癥小體的合成促使炎癥發(fā)生和加劇是影響AS發(fā)生和發(fā)展的重要因素［33］，而通過降低caspase-1的水平，減少IL-1β的生成，可以抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減緩AS的發(fā)展［34,35］。本研究中，丹參新醌乙組處理后，NF-κB1、NLPR3 及后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物caspase-1、IL-1β、GSDMD-N的表達(dá)均受到抑制，提示丹參新醌乙可通過干預(yù)NFκB/NLRP3通路發(fā)揮抗AS作用。此外，本研究設(shè)置藥物溶劑DMSO組作為對(duì)照，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)結(jié)論不受藥物溶劑DMSO影響。

中醫(yī)藥雖無AS之病名，但由于其可辨證不辨病的獨(dú)特診治方式，在數(shù)千年臨床實(shí)踐中留下了寶貴的抗AS經(jīng)驗(yàn)。AS的形成是以氣虛為始動(dòng)因素，無力推動(dòng)津血運(yùn)行從而形成痰瘀，痰瘀膠結(jié)于脈壁，在時(shí)間推移下醞釀成毒從而使脈壁損害［36］。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥或制劑在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝及腸道微生物等方面發(fā)揮積極的抗AS作用［37］，表明中藥成分在該領(lǐng)域具有深入研究的價(jià)值和廣闊的前景，而丹參是其中的代表之一。張凈生采用丹參生脈飲治療冠心病取得顯著療效，其有效成分丹參酮、丹參素被證實(shí)能調(diào)節(jié)血脂并抑制炎癥［38］。目前丹參酮ⅡA、丹酚酸B等有效成分均被證實(shí)具有調(diào)節(jié)信號(hào)通路、抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用［39,40］，提示了丹參“活血化瘀”的作用可能干預(yù)以“瘀”為主要病機(jī)的AS，我們選取了既往鮮有報(bào)道的二萜醌類成分丹參新醌乙作為研究藥物，證實(shí)了其具有可靠的改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用，可能為活血化瘀類藥物成分抗AS研究提供依據(jù)。

綜上，丹參新醌乙對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB/NLRP3信號(hào)通路，下調(diào)caspase-1、IL-1β、GSDMD-N的表達(dá)，減輕其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)。提示丹參新醌乙具有較好的藥用價(jià)值，有望作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)劑進(jìn)行開發(fā)和利用，其抗HUVECs損傷作用可能為抗AS藥物的研發(fā)及其相關(guān)臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐。然而，NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡反應(yīng)極其復(fù)雜，本研究未能明確其中是否涉及其他反應(yīng)，尚需在后續(xù)研究中深入探討。