郭曉娟，陳麗平，2，呂芹，杜瑞娟，2，羅琴，張陽，卞華，2，韓立，2

南陽理工學院1張仲景國醫(yī)學院，2河南省張仲景方藥與免疫調節(jié)重點實驗室，河南 南陽 473004；3南陽醫(yī)學高等?？茖W校中醫(yī)系，河南 南陽473061

卵巢癌發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者確診即為中晚期，且已存在局部或遠處轉移，因此在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率最高，5年生存率約為46%［1］。與原發(fā)病灶相比，卵巢癌轉移后，腫瘤細胞大多對常規(guī)化療不敏感，產(chǎn)生耐藥性，往往進一步促進卵巢癌的發(fā)展。上皮間質轉化（EMT）在卵巢癌轉移中具有重要作用，是一個動態(tài)和可逆的過程。EMT使具有極性的上皮細胞轉化為具有移行能力的間質細胞，是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵啟動步驟［2］。EMT過程中，上皮表型E-鈣粘蛋白（CDH1）缺失或表達下調，間質表型N-鈣黏蛋白（CDH2）表達上調。研究表明，核因子κB（NF-κB）通路激活可抑制CDH1表達，使細胞極性喪失，遷移能力增強，導致腫瘤轉移和耐藥［3］。抑制NF-κB可活化半胱氨酸蛋白酶-3（caspase 3）誘導凋亡，抑制腫瘤耐藥和轉移［4］。因此，靶向NF-κB是抑制腫瘤轉移和耐藥的有效治療策略之一。

桂枝茯苓膠囊（GFC）是在張仲景《金匱要略》所載經(jīng)方桂枝茯苓丸基礎上采用現(xiàn)代工藝制備而成，由桂枝、茯苓、牡丹皮（去心）、赤芍、桃仁（去皮尖）組成，諸藥合用共奏消瘕散結、活血化瘀功效。桂枝茯苓丸與臨床常用的化療方案聯(lián)合用藥治療卵巢癌，其療效優(yōu)于單用化療方案治療，并可降低患者血清癌抗原125（CA125）水平［5-7］，而NF-κB在CA125生成過程中發(fā)揮了重要作用［8］。此外，桂枝茯苓丸在人皮膚惡性黑色素瘤細胞中可下調EMT相關的TPT1-AS1［9］，在S180小鼠轉移瘤模型中抑制EMT相關的細胞黏附分子CD44的表達［10］，提示該方具有潛在的EMT抑制作用，但相關機制研究并不深入。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用桂枝茯苓丸制備的含藥血清可通過誘導磷酸酶和張力蛋白類似物（PTEN）表達逆轉卵巢癌耐藥［11］，而PTEN上調與抑制CD44表達直接相關［12］。然而，GFC是否靶向NF-κB影響卵巢癌的遷移尚不明確。本研究旨在探討GFC抑制卵巢癌轉移的作用，明確其靶向NF-κB 調控CDH1、CDH2和caspase 3的可能機制，為該方治療卵巢癌轉移提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 雌性SPF Wistar大鼠60只，6～8周齡，體質量220±20 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙江）2019-0001。所有動物實驗操作和飼養(yǎng)均遵循實驗動物福利及倫理要求（南理工動倫審[2020]004）。人卵巢癌順鉑耐藥性SKOV3/DDP細胞購自浙江美森細胞科技有限公司，編號：CTCC-0118-NY。

1.1.2 藥物與試劑 桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，0.31 g/粒）；NF-κB 抑制劑SN50（MedChemExpresss，純度99.91%）?？俁NA提取試劑盒（山東思科捷生物技術有限公司）；RevertAid 第一鏈cDNA Synthesis 試劑盒（Thermo Fisher）；QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒（QIAGEN）；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD）；Minute ?Total Protein Extraction Kit（Invent Biotechnologies）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo Fisher）；速溶快速封閉顆粒、ECL化學發(fā)光試劑盒[密碼子（中國）生物科技公司]；胎牛血清、1640培養(yǎng)基（浙江美森細胞科技有限公司）；重組CDH1兔單抗、重組CDH2兔單抗和重組NF-kB p65兔單抗（Abcam）；caspase 3 兔多克隆抗體（Affinity Biosciences）；HRP標記羊抗兔二抗（KPL）；HRP標記GAPDH 鼠單抗（PROTEINTECH）；TruePrepTMDNA Library Prep Kit V2 試劑盒（Vazyme，TD501）。

1.1.3 儀器 ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀（賽默飛世爾公司）；FACSCelesta流式細胞儀（BD）；Tanon-5200凝膠化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能公司）；Synergy H1全功能酶標儀（BioTek），Illumina Novaseq 6000 測序儀（Illumina）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將60只Wistar大鼠隨機分為空白血清組（-）、GFC低（+）、中（++）、高（+++）劑量組，15只/組。桂枝茯苓膠囊內容物用溫水混懸后，根據(jù)臨床用藥劑量，以及人和動物給藥劑量換算后［13］，低、中、高劑量組分別按4、8、16 g·kg-1·d-1劑量，空白組給以等量生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d，各組分別于末次灌胃給藥60 min后，采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，0.3 mL/100 g。股動脈采血，室溫靜置2 h離心，分離含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 劃痕實驗 SKOV3/DDP細胞置于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)在含10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U·mL-1的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，每3～4 d胰蛋白酶消化傳代1 次。取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細胞，接種于6孔板，待過夜后細胞覆蓋率達到90%，利用無菌200 μL槍頭劃痕，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入培養(yǎng)基和不同藥物。實驗分組：空白血清組（-）、GFC低（+）、中（++）、高（+++）劑量組、18 μmol/L SN50組。根據(jù)文獻和前期實驗結果［11,14］，空白血清和含藥血清各組的血清比例均為10%，SN50組加入空白血清比例亦為10%。分別于給藥后0 h、24 h，顯微鏡拍照觀察，采用ImageJ分析各組圖片，比較劃痕愈合情況。

1.2.3 細胞凋亡分析 取SKOV3/DDP細胞接種于6孔板，細胞貼壁后分組同上。各組培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，PBS洗滌細胞。按照凋亡檢測試劑盒說明書處理后，采用流式細胞儀（BD FACSCelesta）檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 RT-qPCR分析 取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細胞，接種于12孔板，細胞貼壁后分組同上。各組細胞加藥孵育48 h后，按照總RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用熒光定量PCR 儀（ABI ViiA7）擴增各目的基因，引物序列如下：CDH1：(F)CGAGAGCTACACGTTCACGG，(R)GGGTGTCG AGGGAAAAATAGG，產(chǎn)物長度119 bp；CDH2：(F)TGCGGTACAGTGTAACTGGG，(R)GAAACCGGG CTATCTGCTCG，產(chǎn)物長度123 bp；NF-κB：(F)CTGGC CTTTGAGTGCATCAC，(R)CGCTAACAACAATGT CCACCT，產(chǎn)物長度104 bp；caspase 3：(F)AGAACT GGACTGTGGCATTG，(R)CTTGTCGGCATACTGT TTCA，產(chǎn)物長度190 bp；GAPDH：(F)ACAACTTTG GTATCGTGGAAGG，(R)GCCATCACGCCACAGTT TC，產(chǎn)物長度101 bp。采用2-△△Ct法計算各藥物處理組CDH1、CDH2和NF-κB mRNA相對于對照組表達量的變化，其中ΔΔCt=（Ct 目標基因-CtGAPDH）處理組-（Ct目標基因-CtGAPDH）對照組。

1.2.5 Western blot分析 SKOV3/DDP細胞處理和分組同上，各組細胞孵育48 h后，棄去培養(yǎng)基。蛋白裂解液裂解細胞，測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳后轉至PVDF膜，Kemix快速封閉液封閉，加入CDH1、CDH2、NF-κB、caspase 3蛋白一抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入對應HRP標記兔二抗室溫孵育2 h，在Tanon 5200凝膠成像分析系統(tǒng)中進行化學發(fā)光顯影。HRP直標GAPDH鼠單抗直接孵育2 h，化學發(fā)光檢測內參GAPDH 條帶。Image J軟件分析成像蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值計算各條帶相對比值，以各藥物處理組相對比值除以空白對照組相對比值計算蛋白相對表達量。

1.2.6 ATAC-seq測序 基于前述分析結果將SKOV3/DDP細胞分為空白血清組（-）和GFC中劑量含藥血清組（++）。各組細胞以1×104接種于6孔板，待細胞貼壁后加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，離心去上清后裂解（裂解液組成：10 mmol/L Tris·Cl（pH 7.4），10 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl2，0.1%(v/v)Igepal CA-630），根據(jù)TruePrepTMDNA Library Prep Kit V2試劑盒說明書建庫，采用Illumina PE150 測序策略進行基于轉座酶的染色質可及性高通量測序（ATAC-seq）。比較兩組樣品間ATAC-seq數(shù)據(jù)，檢測出信號值存在顯著差異的區(qū)域，即染色質差異開放區(qū)域（DAR），包括全部DAR（All DAR）、增強DAR（Gain DAR）和減弱DAR（Loss DAR）。DAR結果以人hg38為參考基因組，采用整合基因組瀏覽器（IGV）1.6.0版進行可視化分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用Graphpad 9.0軟件，對多個樣本均數(shù)比較進行單因素方差分析，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 含藥血清對SKOV3/DDP細胞遷移的影響

與空白對照組相比，GFC各劑量含藥血清均能明顯抑制SKOV3/DDP細胞遷移，且抑制作用逐漸增強（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量含藥血清組對遷移的抑制作用與SN50組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1、2）。

圖1 各組細胞遷移變化Fig. 1 Scratch assay for assessing cell migration changes in each group(Original magnification:×40).

圖2 各組細胞遷移率變化Fig. 2 Migration rates of the cells in each group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs blank sera group;ΔΔP＜0.01 vs SN50 group.

2.2 含藥血清對SKOV3/DDP細胞凋亡的影響

與空白血清組相比，PE標記Annexin V早期凋亡細胞比例隨著GFC含藥血清劑量增加而增強（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量含藥血清組誘導凋亡作用與SN50組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3、4）。

圖3 各組細胞凋亡變化Fig. 3 Flow cytometry for analyzing apoptosis of the cells in each group.A:Blank sera group.B:Low-dose GFC group.C:Medium-dose GFC group.D:High-dose GFC group.E:SN50 group.

圖4 各組細胞早期凋亡率變化Fig. 4 Early apoptotic rates in each group.**P＜0.01 vs blank sera group;ΔΔP＜0.01 vs SN50 group.

2.3 含藥血清對CDH1、CDH2、caspase 3 和NF-κB mRNA表達的影響

與空白血清組相比，GFC含藥血清各組可明顯抑制SKOV3/DDP 中CDH2、NF-κB mRNA 表達，增加CDH1、caspase 3 mRNA表達，呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量含藥血清組對CDH2、NF-κB mRNA的抑制作用和對CDH1、caspase 3 mRNA 的誘導作用與SN50組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 各組細胞CDH1、CDH2、caspase 3 和NF-κB mRNA相對表達變化Fig. 5 Changes in relative expressions of CDH1,CDH2,caspase 3 and NF-κB mRNA in each group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs blank sera group;ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01 vs SN50 group.

2.4 含藥血清對CDH1、CDH2、caspase 3和NF-κB蛋白表達的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，GFC含藥血清各組可明顯抑制NF-κB、CDH2蛋白表達，增加CDH1、caspase 3蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量含藥血清組對CDH2、NF-κB 蛋白的抑制作用和對caspase 3蛋白的誘導作用與SN50 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但對CDH1 蛋白的誘導作用弱于SN50組（P＜0.01，圖6、7）。

圖6 各組細胞CDH1、CDH2、caspase 3 和NFκB蛋白表達變化Fig. 6 Changes in expressions of CDH1,CDH2,caspase 3 and NF-κB proteins in each group.

圖7 各組細胞CDH1、CDH2、caspase 3 和NF-κB 蛋白相對表達變化Fig. 7 Changes in relative expression of CDH1,CDH2,caspase 3 and NF-κB proteins in each group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs blank sera group;ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01 vs SN50 group.

2.5 含藥血清對染色質開放區(qū)域CDH1、CDH2、caspase 3和NF-κB的影響

ATAC-seq測序后，分析空白血清與GFC（++）含藥血清的DAR。結果發(fā)現(xiàn)，含藥血清可減弱染色質開放區(qū)域NF-κB和CDH2基因信號，增強CDH1基因信號，但對caspase 3無影響（圖8）。

圖8 桂枝茯苓膠囊含藥血清對染色質開放區(qū)域CDH1、CDH2、caspase 3 和NF-κB 基因的影響Fig. 8 Effect of GFC-medicated sera on CDH1,CDH2,caspase 3 and NF-κB genes in the open areas of the chromatin.A:Peaks for DAR in all enrichment regions byATAC-seq.B:Peaks for DAR in specific enrichment regions byATAC-seq.

3 討論

在臨床實踐中，中藥復方與常用化療方案聯(lián)合應用于卵巢癌治療，在抑制腫瘤轉移、減輕化療副作用、提高患者生存質量及5 年生存率等方面取得了一定的療效［15,16］。桂枝茯苓丸已有兩千多年的應用歷史，安全性和療效較好。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GFC含藥血清逆轉卵巢癌耐藥和轉移的作用除了與誘導PTEN表達有關外，還與抑制PI3K/AKT通路，抑制MYC和表皮生長因子受體（EGFR）表達，減少染色體外DNA（ecDNA）數(shù)量有關［17,18］。ecDNA是細胞有絲分裂中期從染色體上脫落下來的環(huán)狀DNA分子，與腫瘤進展、耐藥和轉移等亦密切相關，ecDNA中MYC、EGFR等是擴增頻率最高的幾種基因［19］。此外，桂枝茯苓丸通過靶向轉錄激活因子3（STAT3）信號通路抑制卵巢癌進展［20］，在臨床應用中顯著降低卵巢癌患者血清CA125水平［7］。因此，桂枝茯苓丸抗卵巢癌的作用是一個多靶點、多通路的調控過程。

NF-κB是EMT的上游因子之一，在腫瘤轉移、耐藥和調控凋亡中具有重要作用，對多個靶點和通路均具有調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，膠質母細胞瘤中CDH2和抑制CDH1表達的轉錄因子鋅指E盒結合同源盒1（ZEB1），在化療過程中隨著厄羅替尼給藥和撤藥而呈動態(tài)變化［21］，提示ZEB1、CDH1、CDH2等在化療相關EMT的過程中發(fā)揮重要作用。此外，CD44通過STAT3/AKT/NF-κB信號通路促進卵巢癌轉移和耐藥［22］。在STAT3活化的腫瘤中，CDH1通過結合和泛素化降解STAT3，抑制腫瘤轉移［23］。研究證實，在晚期高分化重度卵巢癌患者腹水中，CDH2/CDH1比例顯著增高，而CDH1表達水平與CA125關系密切［24］。同樣，卵巢癌患者血清CA125與caspase 3水平呈負相關［25］。研究表明，NF-κB可能是調控上述靶點的關鍵。NF-κB可以通過直接調節(jié)CDH1和CDH2的表達而影響細胞間粘附和細胞極性，調控腫瘤EMT，介導化療藥物對腫瘤細胞的敏感性［26］。NF-κB通過與黏蛋白16（MUC16）啟動子結合，促使MUC16 高表達，MUC16 的胞外片段進而形成CA125，而MUC16的C端促進EMT表型形成［8］。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了NF-κB 對卵巢癌患者CA125、caspase 3、CDH1和CDH2的調控作用，結合桂枝茯苓丸的多靶點調控作用，這些發(fā)現(xiàn)為桂枝茯苓丸靶向NF-κB 調控EMT相關靶點提供了理論支撐。

為了證明GFC調控NF-κB抑制卵巢癌轉移的作用，本實驗以NF-κB抑制劑SN50為陽性對照。SN50抑制NF-κB可激活EMT的抑制劑CDH1，活化caspase 3，誘導凋亡，抑制EMT和轉移［3,27］。本研究發(fā)現(xiàn)，GFC含藥血清可明顯抑制耐藥性卵巢癌SKOV3/DDP細胞的遷移和誘導凋亡，抑制NF-κB、CDH2表達，誘導CDH1、caspase 3表達，提示GFC含藥血清抑制卵巢癌轉移的作用與調控這些因子表達有關。這些發(fā)現(xiàn)解釋了臨床患者中桂枝茯苓丸降低血清CA125水平的潛在機制，與臨床病例中CA125、caspase 3、CDH1和CDH2的變化趨勢相吻合，印證了靶向NF-κB調控這些因子對卵巢癌患者的治療意義，然而尚需在動物實驗和臨床實驗中進一步證實。為了證明GFC在DNA層面對EMT相關因子的調控作用，采用ATAC-seq技術通過Tn5轉座酶切割DNA，經(jīng)過PCR擴增獲得測序文庫并測序，獲得染色體在某個特定的時空條件下染色質所有的開放區(qū)域［28］。GFC含藥血清處理后，ATAC-seq檢測到染色質開放區(qū)域NF-κB、CDH2減弱，CDH1增強，提示含藥血清對這些基因表達的影響可能與其調控染色質開放區(qū)域有關。而ATAC-seq 檢測未發(fā)現(xiàn)染色質開放區(qū)域caspase 3的信息，提示caspase 3的DNA序列在染色質區(qū)域可能為非開放狀態(tài)，含藥血清對其表達調控可能是通過轉錄或轉錄后調控實現(xiàn)。ATAC-seq技術早期用于分析腫瘤等疾病的染色質的開放性和染色質結構的動態(tài)變化，確定與染色質開放區(qū)域結合的轉錄因子、增強子等，有利于闡明疾病的作用機制。但對藥物干預后染色質開放區(qū)域基因改變的研究相對較少，將此技術與中醫(yī)藥研究相結合，探討中藥對整個基因組或特定基因表達的影響，有助于對中藥的療效機制有更全面的認識。

本研究為GFC調控NF-κB抑制EMT，用于卵巢癌轉移的臨床治療提供了實驗基礎，同時為抗NF-κB治療藥物的臨床開發(fā)提供了一種潛在的新策略。然而，GFC靶向NF-κB的其他潛在調控機制仍有待進一步研究。