鄧廣輝，賈慧，李允家，李俊杰，吳潮鋒，石皓，秦夢晨，趙嘉敏，劉暢，廖雨欣，高磊

1南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院消化內科，廣東 廣州510315

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是以脂質代謝紊亂為主要特征的一種代謝性疾病。在NAFLD的進展中，肝臟會發(fā)生一系列典型的組織病理學變化，從單純的脂肪性變到伴有或不伴有纖維化的脂肪性肝炎，并最終發(fā)展為肝硬化或肝癌［1,2］。近年來，其發(fā)病率逐年上升，成年人發(fā)病率達20%～33%，已成為我國第1大慢性肝?。?,4］。目前針對脂肪性肝病的治療藥物雖然有很多，但因其副作用多或療效有限，無法適用于所有人群，迄今為止還沒有藥物獲得美國食品及藥物管理局批準用于NAFLD［5］。目前的研究表明，部分肥胖者機體內不僅存在脂代謝紊亂的現(xiàn)象，還伴隨鐵離子異常累積的表現(xiàn)。這提示脂質代謝紊亂與鐵代謝紊亂密切相關［6］。已有研究［7］證明鐵過載會加劇NAFLD中的肝損傷程度，而減少鐵的攝入量可以有效緩解脂肪性肝病的進一步惡化。而過量的鐵離子通過芬頓反應生成大量的活性氧自由基（ROS），后者直接導致細胞DNA、脂質和蛋白質的損傷［8］。我們前期的研究也證實高脂飲食可誘導小鼠鐵離子代謝紊亂，加劇肝組織內鐵離子累積，而抑制鐵離子累積可部分緩解NAFLD的進展［9］。

二陳湯由半夏、陳皮、茯苓、甘草、烏梅、生姜組成，具有燥濕化痰、理氣和中功效。《古今名醫(yī)方論》：“二陳為治痰之妙劑，其于上下左右無所不宜”。臨床統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，二陳湯加減治療組總有效率為87%，高于對照組67%的有效率［10］。基礎研究表明二陳湯通過抑制脂質累積和炎癥反應，可有效緩解大鼠NAFLD的進展［11,12］。研究表明NAFLD 患者證型以肝郁脾虛證型最為普遍，占比32.3%，發(fā)病原因與主要癥狀均與脾臟密切相關［13］。然而，從鐵穩(wěn)態(tài)的角度探討二陳湯調控脾臟功能緩解NAFLD的研究仍舊缺乏。

綜上所述，結合傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學對于脾臟功能的理解和認識［14,15］，我們試圖從脾臟調控鐵離子代謝的角度探討二陳湯防治NAFLD的作用機制。因此，本研究采用高脂飲食誘導小鼠NAFLD模型，以多烯磷脂酰膽堿為陽性對照藥［16］，以不同劑量二陳湯為干預手段，深入探究二陳湯通過改善脾臟鐵穩(wěn)態(tài)調控NALFD進展的作用機制，為中藥防治疾病提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型C57BL/6J 小鼠36只，6～8 周齡，SPF級，體質量20±2 g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。動物合格證號：44007200 065781；許可證號：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，相對濕度50%～65%；每天更換墊料，給予充足飼料。該動物實驗方案由南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（倫理編號：L2020044）。

1.1.2 藥物及試劑 模型組飼料：高脂飼料，飼料代碼：TP 26305（熱量：4.5 kcal/g，熱量組成：脂肪42%，蛋白質14%，碳水化合物44%。膽固醇含量0.2%）；對照組飼料：低脂低糖飼料，飼料代碼：TP26362。均購買于南通特洛菲飼料科技有限公司。二陳湯（半夏15 g、橘紅15 g、茯苓9 g、炙甘草4.5 g、烏梅3 g、生姜3.5 g）的藥材均購買于安徽同化堂中藥飲片科技有限公司，經(jīng)南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院邵萌副研究員鑒定，均符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。多烯磷脂酰膽堿（PPC，易善復，賽諾菲北京制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20059010，9.12 mg/kg）作為陽性對照藥物，將其溶解于蒸餾水中備用。

抗體：鐵轉運蛋白（Fpn1，NOVUS），前列腺六跨膜上皮抗原3（Steap3，Abcam），轉鐵蛋白受體（TfR，Abcam），血紅素加氧酶1（HO-1，Abcam），GAPDH（CST），CD68（Abcam），CD163（proteintech），Ter-119（ThermoFisher），鐵蛋白輕鏈（proteintech），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（CST），辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（CST）。RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司），ECL 蛋白質印跡檢測試劑（MA），尼羅紅粉末（Sigma），DAPI（索萊寶生物科技有限公司），免疫組化試劑盒（上海基因科技有限公司），鐵離子檢測試劑盒（Abcam），普魯士藍染色試劑盒（貝博）。單體：野漆樹苷（曼思特），柚皮素（曼思特），甘草酸（曼思特），甘草查爾酮A（曼思特）。

1.1.3 儀器與設備 全波長酶標檢測儀（Thermo Fisher Scientific），低溫高速離心機（5427R，Eppendorf），臺式高速大容量離心機（5810R，Eppendorf），RM2245石蠟切片機、EG1160包埋機、CM-1850冰凍切片機（徠卡公司），病理顯微鏡Eclipse E100、激光共聚焦顯微鏡C2（尼康公司），正置激光共聚焦顯微鏡（LSM 880，蔡司），KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（Servicebio），曝光儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），Chemray 240和Chemray 800全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技），高效液相色譜儀（UltiMate3000，ThermoFisher賽默飛）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 中藥煎煮方法參考《中藥藥理實驗方法學》（上?？茖W技術出版社，2006 年版），將藥物按照比例混合放于陶制中藥鍋內，加適量去離子水浸泡30 min，開始煎煮直至水沸騰，文火慢煮30～40 min。收集剩余藥液，倒入500 mL燒杯中。重新加水于鍋中進行二次煎煮。將兩次煎出藥液混合后，置95～98 ℃水浴鍋中加熱濃縮，并制備成相應濃度的水煎劑。

1.2.2 分組給藥和模型制備 參考本人既往發(fā)表文章采用的NAFLD 小鼠模型構建方法［9］，36 只雄性野生型C57BL/6J 小鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為對照組（Control）、模型組（Model）、二陳湯低劑量組（ECDL）、二陳湯中劑量組（ECDM）、二陳湯高劑量組（ECDH），多烯磷脂酰膽堿組（PPC），6只/組。對照組喂養(yǎng)低脂飼料（飼料代碼：TP26362），其余組則喂養(yǎng)高脂飼料（飼料代碼：TP 26305），所有小鼠均采用自由飲食模式進食。于第12周末結束造模。所有小鼠均自由飲水進食。

藥物組小鼠在高脂飲食第7周開始灌胃給藥，二陳湯低劑量組、中劑量組和高劑量組生藥給藥量分別為7.5、15、30 g/kg，多烯磷脂酰膽堿組為9.12 mg/kg。其中低劑量組，由臨床常用劑量生藥質量/體質量，按照人鼠比例進行換算；其余各組灌胃等量飲用水。各組均按1 mL/100 g小鼠體質量進行灌胃，3次/周，持續(xù)給藥6周，隔天觀察小鼠毛發(fā)、飲食、自主活動及精神狀態(tài)等情況，每周記錄小鼠體質量1次。

1.2.3 標本采集 用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，完成采血后使用灌注儀進行心臟灌注，然后采集肝臟和脾臟，部分放置于4%多聚甲醛中浸泡，剩余部分的肝臟和脾臟組織分裝到1.5 mL EP管中，放置-80 ℃冰箱保存以備后用。小鼠全血在室溫靜置2～4 h后，放置常溫離心機離心（3000 r/min，離心15min），離心結束后分離上清，放置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 肝組織病理學檢測及分析 4%多聚甲醛溶液固定的肝組織和脾組織常規(guī)處理固定，脫水、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，根據(jù)標準流程進行脫蠟和水化。此外部分固定的組織用OCT膠包埋，切成14 μm厚的切片。采用相應的切片進行HE和尼羅紅染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性情況。

1.2.5 HPLC-MS分析法 采用高效液相色譜法對二陳湯水煎劑的活性成分進行鑒定分析。取500 μL藥液，加入500 μL乙醇，18 000×g離心5 min，離心后留取上清。另取500 μL藥液稱重，用500 μL超純水提取，再次18 000×g離心5 min，離心后留取上清。取500 μL兩上清混合液，用0.22 μm過濾器過濾混合液，制備原液，最后對樣品進行分析?；贖PLC分析結果，從二陳湯樣品中鑒定出的4個單體組成分別與標準混合物中的相應峰匹配。

1.2.6 普魯士藍染色法 切片脫蠟至水后，蒸餾水洗3遍，2 min/次。滴加適量的試劑A溶液，孵育15～30 min；孵育結束后蒸餾水洗3遍，3 min/次。然后往切片上滴加適量核固紅試劑B溶液染細胞核8 min。自來水流沖洗直至水變干凈。脫水封片，正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 免疫蛋白印跡法 將適量的肝、脾組織剪碎后加入組織裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液），勻漿機勻漿，4 ℃，12 000×g離心15 min，收集上清液。用BCA法測定蛋白質濃度。制好蛋白樣后進行電泳并轉膜。5%BSA封閉后，孵育一抗Fpn1（兔，1∶1000）、Steap3（兔，1∶1000）、HO-1（兔，1∶1000）、TfR（兔，1∶1000）、GAPDH（兔，1∶1000），4 ℃過夜。用TBST洗滌3次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h。最后，多功能成像系統(tǒng)檢測。通過Image J進行定量。

1.2.8 免疫組織化學法 切片脫蠟至水后，用枸櫞酸鈉溶液進行組織抗原修復，PBS洗3遍，3 min/次。加入3%過氧化氫溶液清除組織的內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。PBS洗3遍，3 min/次。免疫組化封閉液室溫孵育1～2 h。加入一抗溶液，4 ℃孵育12～16 h。PBS洗3遍，5 min/次。二抗溶液室溫孵育1 h。PBS洗3遍，3 min/次。根據(jù)劑盒的說明書使用DAB溶液進行顯色反應。滴加蘇木精染料染細胞核，3 min/張。脫水封片，放置通風櫥中靜置晾干，正置顯微鏡中觀察拍照。

1.2.9 免疫熒光染色法 冰凍切片用PBS洗2次，10 min/次。通透液通透10 min后，PBS洗3 min；加適量封閉液，室溫封閉1 h。滴加適量一抗溶液，4 ℃孵育12 h。次日PBS洗3遍，10 min/次。室溫下孵育二抗溶液1 h。PBS 洗2遍，10 min/次。使用DAPI 溶液孵育5min，PBST洗2遍，5 min/次?？篃晒獯銣鐒┓馄?，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.10 鐵離子濃度檢測 采用全自動生化分析儀（深圳雷都生命科技：Chemray 240或Chemray 800）檢測血清鐵離子濃度。操作方法參既往發(fā)表的文章［9］。

1.2.11 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件作圖和SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組樣本比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組樣本間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，采用Turkey檢驗方法進行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett's T3檢驗方法進行組間比較。P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二陳湯活性成分的鑒定

對比標準品混合物溶液圖譜（圖1A）與二陳湯樣品圖譜（圖1B），柚皮素的保留時間分別為10.08 s 和10.07 s，相應保留時間處m/z 分別是271.06085、271.06088；甘草酸的保留時間分別為12.25 s和12.26 s，相應保留時間處m/z分別是821.39484、821.39471；野漆樹苷的保留時間分別為7.60 s 和7.65 s，相應保留時間處m/z 分別是577.15558、577.15662；甘草查爾酮A的保留時間分別為13.62 s 和13.63 s，相應保留時間處m/z分別是337.14401、337.14374。

2.2 二陳湯有效改善NAFLD小鼠模型的脂代謝紊亂

圖2A顯示模型構建和給藥處理的時間節(jié)點，從第7周開始灌胃給藥，在第12周末結束造模。首先觀察小鼠肝臟的整體形態(tài)變化，對照組肝臟形態(tài)正常，顏色呈紅褐色。模型組肝臟表面光滑有脂滴，顏色呈橘黃色。二陳湯中劑量組和高劑量組可明顯改善肝臟的病變，而多烯磷脂酰膽堿降脂效果比二陳湯的降脂效果差（圖2B）。HE染色和尼羅紅染色結果表明，與模型組相比，中劑量組和高劑量組二陳湯可有效緩解肝臟的脂質累積，而低劑量二陳湯和多烯磷脂酰膽堿減輕肝臟脂質累積的效果明顯較差（圖2C、D）。

圖2 二陳湯抑制高脂飲食誘導的脂代謝紊亂Fig. 2 Erchen Decoction inhibits lipid metabolism disorder induced by high-fat diet. A: Flow chart of NAFLD mouse model establishment and drug intervention.B:Overall lesion map of mouse liver.C:HE staining results of the liver tissue in each group.D:Nile Red staining of the liver tissue in each group.ECDL:Erchen Decoction low-dose group;ECDM:Erchen decoction mediumdose group;ECDH:Erchen decoction high-dose group;PPC:Polyene phosphatidyl choline group.

2.3 高脂飲食通過抑制TfR表達抑制脾臟細胞的鐵攝入能力

普魯士藍染色結果表明，高脂飲食引起脾臟紅髓的鐵含量顯著降低（圖3A）。免疫蛋白印跡方法發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組小鼠脾臟組織的TfR蛋白表達顯著下調（P＜0.01，圖3B），免疫組織化學染色方法結果也證實高脂飲食抑制脾臟TfR蛋白的表達（P＜0.05，圖3C）。

圖3 高脂飲食降低脾臟細胞的鐵離子攝入能力Fig. 3 High-fat diet reduces iron uptake capacity of the spleen cells.A:Prussian blue staining for observing iron content in the spleen.B:Expression of TfR protein in the spleen detected by Western blotting.C: Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.

2.4 高脂飲食通過上調Fpn1表達促進脾臟細胞的鐵排出能力

免疫蛋白印跡結果分析顯示，與對照組相比，模型組小鼠脾臟組織Fpn1和Steap3蛋白表達顯著上調（P＜0.05，圖4A）。免疫組織化學染色方法分析顯示，高脂飲食促進脾臟Fpn1蛋白表達（P＜0.01，圖4B）。免疫熒光染色方法分析再次證實，與對照組相比，模型組脾臟Fpn1蛋白表達上調（P＜0.05，圖4C）。

2.5 二陳湯改善脾臟細胞的鐵離子轉運能力

與對照組比較，模型組血清鐵含量顯著增多（P＜0.01），而二陳湯和多烯磷脂酰膽堿均可有效降低血清鐵離子濃度（P＜0.01，圖5A）。普魯士藍染色結果顯示，二陳湯和多烯磷脂酰膽堿可上調NAFLD模型中脾臟紅髓的鐵含量（圖5B）。免疫組織化學法檢測脾臟TfR、Fpn1和Steap3蛋白的表達水平。與對照組相比，模型組脾組織TfR蛋白表達顯著下調（P＜0.001）。與模型組相比，中劑量二陳湯、高劑量二陳湯以及多烯磷脂酰膽堿上調脾組織TfR蛋白的表達（P＜0.05，圖5C）。與對照組相比，模型組脾組織Fpn1蛋白表達明顯上調（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量和高劑量二陳湯均可下調脾組織Fpn1蛋白的表達（P＜0.01，圖5D）。與對照組相比，模型組脾組織的Steap3蛋白表達顯著上調（P＜0.05）。與模型組相比，中劑量二陳湯組和多烯磷脂酰膽堿組Steap3蛋白的表達較模型組下調（P＜0.05，圖5E）。

圖5 二陳湯調控脾臟細胞的鐵離子轉運能力Fig. 5 Erchen Decoction regulates iron transport in the spleen cells.A:Serum iron level in each group.B:Prussian blue staining of the spleen tissue in each group.C:Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.D:Expression of Fnp1 protein in the spleen detected by immunohistochemistry. E: Expression of Steap3 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Model group.

2.6 二陳湯改善脾臟巨噬細胞降解紅細胞的能力

接著檢測脾臟中Ter-119蛋白表達的情況以及不同表型巨噬細胞的數(shù)量。模型組小鼠脾組織Ter-119蛋白表達水平與對照組無顯著性差異（圖6A）。與對照組相比，模型組脾組織CD68和CD163蛋白的表達顯著增多（P＜0.05，圖6B）。與模型組比較，中劑量二陳湯和多烯磷脂酰膽堿均未改變CD163 和CD68 蛋白的表達（圖6B）。有趣的是，與對照組比較，模型組小鼠HO-1蛋白表達降低（P＜0.01，圖6C），而二陳湯中劑量組和多烯磷脂酰膽堿組小鼠脾組織HO-1蛋白表達較模型組上調（P＜0.05，圖6C）。

圖6 二陳湯調控脾臟巨噬細胞降解紅細胞的能力Fig. 6 Erchen Decoction regulates the ability of splenic macrophages to degrade red blood cells.A:Expression of Ter-119 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.B:Expressions of CD163 and CD68 proteins detected by immunofluorescence assay.C:Expression of HO-1 protein in the spleen detected by immunoblotting.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01 vs Model group.

3 討論

目前的研究表明NAFLD是一種復雜的代謝性疾病，而脂質代謝紊亂是引起NAFLD發(fā)生發(fā)展的關鍵。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)脂質累積所誘發(fā)的其它變量可能是NAFLD進展的關鍵，并且提出“多次打擊”的學說［17］：脂代謝紊亂引起的鐵過載［18］、炎癥細胞激活、氧化應激、腸道菌群失調、脂肪組織功能障礙、線粒體功能障礙等引起的細胞損傷和死亡，是決定NAFLD進展的關鍵。這表明NAFLD的發(fā)生發(fā)展存在多種潛在的干預因素，仍需進一步探討。目前主流的治療方案主要是從維護體內脂質代謝和抗氧化平衡等角度出發(fā)，常選用辛伐他汀等降脂類藥物、吡格列酮等胰島素增敏劑、維生素E等抗氧化劑以及多烯磷脂酰膽堿［19-21］。雖然上述部分藥物已經(jīng)在臨床上被應用，并在一定程度上緩解NAFLD患者的病情，但是這些藥物由于副作用多或療效有限，無法適用于所有人群［22］。而中醫(yī)藥具有改善胰島素抵抗，降低肝臟脂質沉積和減輕肝臟炎癥的顯著作用，對本病的治療有其獨特優(yōu)勢，并且可極大程度的減弱毒副作用［23,24］。為此，從中醫(yī)藥寶庫深入挖掘防治NAFLD的中藥和治療方案，具有重大的臨床意義。

二陳湯最早見于《太平惠民和劑局方》，被譽為“千年祛痰方”。后世各醫(yī)家根據(jù)“異病同治”的理論，將該方隨證化裁，應用于一系列由“痰濕”之邪所誘發(fā)的疾病，比如代謝性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病等?，F(xiàn)代研究［25-28］發(fā)現(xiàn)，二陳湯具有良好的化痰、降血脂的藥理作用，可以從降低脂質累積和減輕氧化應激損傷等角度改善NAFLD的進展。為了解二陳湯的可能藥理機制，經(jīng)HPLC-MS分析，我們發(fā)現(xiàn)二陳湯的活性成分包含柚皮素、野漆樹苷、甘草酸和甘草查爾酮A。其中柚皮素、野漆樹苷及甘草查爾酮A均為黃酮類化合物，具有護肝解毒和抗氧化等作用。研究表明柚皮素可有效降低機體內TC和TG的生成和累積，亦具有良好的抗炎作用［29,30］；野漆樹苷具有抗過氧化、清除自由基、抗炎的作用［31,32］；甘草酸具有抗炎、降脂、抗氧化等多種生化與藥理特性，亦可以抑制高糖誘導的炎癥反應和氧化應激損傷［33］；甘草查爾酮A可以通過Nrf2介導的防御機制起到良好的護肝作用［34］。本研究選用高脂飲食誘導的NAFLD小鼠經(jīng)典模型，成模率高，穩(wěn)定性好。研究結果顯示，高脂飲食3個月成功誘導小鼠肝臟發(fā)生明顯的脂質累積。經(jīng)多烯磷脂酰膽堿和二陳湯干預后，小鼠的脂質代謝狀態(tài)均得到部分改善，與既往研究結果相符［25,35］，但是二陳湯的降脂效果較多烯磷脂酰膽堿顯著。上述結果表明二陳湯對NAFLD中脂質代謝具有良好的調節(jié)作用。

鐵離子是有機生物維持正常過程所需的重要元素，通過參與氧氣運輸、線粒體呼吸、物質代謝和細胞信號傳導等維持機體的正常生理功能。而鐵代謝失調將會導致一系列疾病的發(fā)生，包含貧血、NAFLD、心血管疾病、腫瘤等多種疾?。?6］。在部分肥胖者中，脂代謝紊亂與鐵過載往往并存。我們前期的研究表明，高脂飲食可加劇小鼠鐵離子代謝紊亂，并上調血清鐵離子和肝組織鐵離子濃度［9］。所以調控鐵穩(wěn)態(tài)可能是防治NAFLD發(fā)生發(fā)展的關鍵。另外，有研究表明，除了肝臟、小腸和骨髓，脾臟也是鐵離子代謝的關鍵靶器官，與機體鐵穩(wěn)態(tài)密切相關［37,38］。因此，為了進一步揭示NAFLD小鼠體內鐵代謝紊亂的可能調控機制，本研究重點探討脾臟功能改變對鐵離子代謝的影響和可能存在的作用機制。我們采用普魯士藍染色方法證實高脂飲食顯著降低脾臟鐵離子的含量。上述結果表明，高脂飲食不僅誘導肝臟鐵代謝紊亂，還加劇脾臟鐵穩(wěn)態(tài)失調。研究表明與Tf結合的三價鐵離子，通過與肝細胞膜上的TfR蛋白結合，促進細胞鐵離子的吸收［39］。進入胞內的三價鐵離子通過鐵還原酶Steap3將三價鐵還原為二價鐵。Fpn1，作為一種跨膜的鐵輸出蛋白，是鐵離子釋放的唯一出口，負責將細胞內的二價鐵離子排出胞外［40,41］。我們的研究表明，高脂飲食通過抑制TfR蛋白表達減少脾臟細胞鐵離子的攝入。上調的Steap3可以促進三價鐵轉換成二價鐵，然后通過Fpn1蛋白將脾臟細胞鐵離子排出，進而降低脾臟鐵離子含量，最終導致NAFLD鐵代謝紊亂。目前大部分的研究主要從脂代謝紊亂方向探討二陳湯防治NAFLD的效果。結合前面所述，脂代謝紊亂所誘發(fā)的“二次打擊”才是NAFLD 進一步惡化的關鍵。為此，我們試圖從另外的角度探討二陳湯防治NAFLD的作用機制。中醫(yī)理論認為脾主運化水液和水谷精微以化生氣血，與現(xiàn)代醫(yī)學中脾臟代謝鐵離子的生理功能不謀而合。結合中藥“多靶點、多層面”的優(yōu)勢，我們猜測二陳湯可能通過調控脾臟鐵穩(wěn)態(tài)緩解NAFLD的進展。此外，我們已經(jīng)證實化橘紅可有效降低高脂飲食誘導的鐵離子代謝紊亂［9］。如預期那樣，二陳湯可以有效逆轉上述結果，而多烯磷脂酰膽堿與二陳湯相比，改善鐵離子代謝的能力無顯著性差異。因此，二陳湯通過改善脾臟細胞轉運鐵離子的能力以維持NAFLD鐵穩(wěn)態(tài)。

現(xiàn)代研究表明飲食和紅細胞降解釋放是鐵離子的主要來源［42,43］。人體每天需要20～25 mg的鐵離子以維持正常的生理功能，但飲食來源的鐵離子只有1～2 mg/d［35］。因此紅細胞來源的鐵離子是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的重要來源。而脾臟紅髓的巨噬細胞是降解衰老和損傷紅細胞的重要細胞。CD163+巨噬細胞是一類重要的噬紅細胞，可通過血紅素加氧酶(HO-1)降解血紅素以回收再利用鐵離子［44］。因此，我們通過Ter-119標記紅細胞，免疫組織化學染色結果顯示高脂飲食并沒有改變脾臟紅細胞的數(shù)量。與對照組相比，模型組CD163+巨噬細胞數(shù)量雖然顯著升高，但模型組脾臟鐵離子含量卻明顯降低（普魯士藍染色結果），似乎兩者相互矛盾。此外，二陳湯未能顯著改變CD163+巨噬細胞的數(shù)量。有趣的是，與對照組相比，高脂飲食顯著降低脾臟細胞HO-1蛋白的表達。而二陳湯和多烯磷脂酰膽堿可上調HO-1的表達。綜上所述，二陳湯通過上調CD163+巨噬細胞HO-1蛋白的表達影響該類噬紅細胞的功能，以改善機體鐵穩(wěn)態(tài)。

綜上，本研究證實二陳湯不僅可以改善NAFLD脂代謝紊亂，而且可以通過調控脾臟細胞鐵離子轉運能力和脾臟巨噬細胞降解紅細胞能力改善NAFLD鐵代謝紊亂，為臨床治療NAFLD提供新的切入點和方向。然而，二陳湯作為中藥復方，具有多靶點、多層面干預的優(yōu)勢和特色，本研究仍存在一些局限性。其對于NAFLD脾臟細胞鐵離子轉運能力相關靶標蛋白的調控仍需相應的基因調控小鼠進一步深入探討。此外，后續(xù)將依據(jù)HPLC-MS分析的結果，進一步明確二陳湯中活性成分干預NAFLD進展的具體作用機制。