顏 暢，劉爽，宋慶志，胡藝冰

北京大學深圳醫(yī)院1胃腸外科，2乳甲外科，廣東 深圳518036

結直腸癌是我國發(fā)病率第2位、死亡率第4位的惡性腫瘤［1］。癌干細胞（CSCs）是結直腸癌中主導化療耐藥、轉移和治療后復發(fā)的細胞亞群［2］。針對結直腸CSCs的治療對提高結直腸癌的預后尤為重要［3］。

目前鑒別和分選CSCs主要依賴其細胞膜表達的CD133、CD44、Lgr5等分子標志物［4］。但是，由于缺乏統(tǒng)一的標志物，且此類標志物的功能和機制尚并不完全清楚，靶向CSCs標志物的臨床應用仍相對受限［5］。準確的來講，CSCs區(qū)別于癌分化細胞的主要特征是其具備更強的自我更新能力、分化潛能、成瘤能力等生物學功能，而不是簡單表達某種標志物［2-6］。我們前期的研究表明，結直腸CSCs除了具備更強的自我更新能力和體內成瘤能力，還具有更高的線粒體氧化磷酸化和活性氧（ROS）水平［7,8］。因此，靶向抑制結直腸CSCs線粒體代謝或ROS是潛在的治療手段。

糖尿病和結直腸癌的發(fā)生和預后存在復雜的關系［9］。較多研究顯示，糖尿病患者有更高的結直腸癌發(fā)生率和癌癥特異性死亡率［10］。二甲雙胍是世界上廣泛應用的治療II型糖尿病的藥物。研究表明，二甲雙胍能顯著降低糖尿病人群中結直腸癌的發(fā)生率，并顯著提升結直腸癌病人的預后［9,11］。盡管有研究顯示二甲雙胍可以調控腫瘤的葡萄糖及線粒體代謝，抑制結直腸癌［12,13］。其具體機制仍不清楚。二甲雙胍能否通過抑制結直腸CSCs的線粒體代謝，從而促進其分化尚缺乏研究。本研究擬用二甲雙胍與原代結直腸癌來源的類器官中的CSCs體內和體外共培養(yǎng)，觀察其促進結直腸CSCs分化的作用，并進一步探討其機制，為靶向結直腸CSCs的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞和動物

已轉染Wnt 報告基因慢病毒（TOP-GFP）的結直腸癌病人來源的類器官（PDOs）來源于本課題組已建立的結直腸癌PDOs活樣本庫，樣本獲取及研究已充分經過知情同意，并獲得倫理委員會許可（IRB ID:20141106）［7,8］。SPF級非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID，北京華阜康公司）。所有實驗程序均經倫理委員會批準，并參照《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行（IACUC ID:2014S652）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、B27、MitoSOX紅色熒光探針試劑盒（Invitrogen）；人表皮生長因子、胃泌素、基礎成纖維細胞生長因子、二甲雙胍、半乳糖、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Sigma）；Trizol 裂解液、逆轉錄試劑盒（Takara）；實時熒光定量PCR試劑盒（Thermo）；基質膠、FACS Aria II流式細胞儀（BD Bioscience）；四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine,ethyl ester,TMRE）試劑盒（Abcam）。

1.3 方法

1.3.1 類器官培養(yǎng) 收集活樣本庫中結直腸癌PDOs，加入0.025%胰蛋白酶溶液在37 ℃下孵育15～20 min，消化為單細胞后包埋至基質膠（去生長因子、無酚紅）并接種至超低吸附培養(yǎng)皿。待基質膠聚合后，加入類器官基礎培養(yǎng)基，并置入37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換一次類器官基礎培養(yǎng)基［8］。類器官基礎培養(yǎng)基為添加人表皮生長因子（50 ng/mL）、胃泌素（10 nmol/L）、1×B27和A83-01（500 nmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)基［8］。

1.3.2 流式細胞分選癌干細胞 收集已轉染Wnt報告基因慢病毒（TOP-GFP）的結直腸癌PDOs，并制備為單細胞懸液（1×107/mL）。使用流式細胞儀根據GFP的熒光強度，分選出表達最強的5%～10%細胞為GFP+細胞（高表達Wnt，即Wnt+細胞，富集癌干細胞）和表達最弱的5%～10%細胞為GFP-細胞（不表達Wnt，即Wnt-細胞，富集癌分化細胞）［7,8］。

1.3.3 細胞球體形成實驗 細胞接種在超低吸附6 孔板內（1000/孔），在干細胞培養(yǎng)基中加入藥物（5、10、20、30 μmol/L 二甲雙胍、10 mmol/L 半乳糖、5 mmol/L NAC）或等體積的干細胞培養(yǎng)基作為空白對照，置入37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d補0.5 mL干細胞培養(yǎng)基及藥物，9 d 后觀察細胞球體的形態(tài)及數量［8］。干細胞培養(yǎng)基為添加人表皮生長因子（10 ng/mL）、1×B27 和基礎成纖維細胞生長因子（10 ng/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基［8］。

1.3.4 克隆形成實驗 將細胞接種在6孔板（1000/孔），貼壁后加入10 μmol/L二甲雙胍或等體積的干細胞培養(yǎng)基，置入37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d補0.5 mL干培養(yǎng)基及藥物，9 d后去除培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛常溫固定30 min后，用0.1%結晶紫染色15 min，光學顯微鏡觀測克隆的數目及大?。?4］。

1.3.5 體內有限稀釋實驗 用基質膠包被細胞后按濃度梯度皮下注射至NOD/SCID小鼠背部（100 μL/側），每5 d經腹腔內注射二甲雙胍（100 mg/kg body weight）或對照［15］，每3 d監(jiān)測腫瘤的起始及大小。待腫瘤生長至一定體積后，處死小鼠，收獲腫瘤，計數成瘤率和稱量腫瘤質量。根據網站ELDA:Extreme Limiting Dilution Analysis（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html）提供的分析工具計算各組細胞中可成瘤細胞頻率，并計算統(tǒng)計學差異［16］。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞Wnt表達率和活性 接種純化的Wnt+細胞在超低吸附6孔板內，在干細胞培養(yǎng)基中加入對應濃度的藥物或對照，置入37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后收集細胞通過流式細胞儀檢測細胞的GFP表達率，并檢測GFP+細胞中GFP的平均熒光強度［8］。

1.3.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）使用Trizol裂解液提取細胞總RNA，加入適量無酶無菌水調節(jié)RNA濃度至500 ng/μL；參照逆轉錄試劑盒（Takara）反應體系逆轉錄生成cDNA；采用SYGR熒光染料摻入法檢測目的基因表達。每組實驗重復3次，以GAPDH作為實驗內參。引物序列來自于已發(fā)表文獻［17］，引物由武漢擎科生物有限公司合成（表1）。本研究使用的引物如下：

表1 qRT-PCR對差異表達的mRNA的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR for differentially expressed mRNAs

1.3.8 海馬能量代謝儀檢測細胞氧化率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR）將Wnt+細胞接種在96孔板（1×104/mL），每孔加入80 μL干細胞培養(yǎng)基，經10 μmol/L二甲雙胍或對照處理48 h后，按照安捷倫實驗操作進行后續(xù)實驗并計算OCR和ECAR［18］。

1.3.9 探針檢測線粒體膜電位和ROS水平 獲取實驗組和對照組Wnt+細胞，按照試劑盒說明每孔加入100 nmol/L TMRE探針或MitoSOX探針，37 ℃避光孵育探針30 min，離心并洗滌細胞2遍后，PBS溶液重懸，上流式細胞儀檢測線粒體膜電位和ROS水平［19］。

1.3.10 NDI1轉染與鑒定 根據已報道的文獻引物序列［12］，從釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）中純化NDI1 cDNA，引物如下：FWD: 5'ATAAGATCTGCCGCCA CCATGCTATCGAAGAATTTGTAT3'；REV: 5' TATG AATTCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTAA TCCTTTAAAAAAGTCTCT3'。pCMV-NDI1-Puro慢病毒質粒構建及病毒包裝由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司提供。在培養(yǎng)基中加入10 μg/mL polybrene，慢病毒以感染復數25（MOI=25）感染結直腸癌類器官細胞72 h后，更換含有1 μg/mL Puromycin的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉染NDI1 的細胞。通過免疫印跡檢測細胞中NDI1的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用SPSS 22.0和Graphpad 8.0進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復3次，正態(tài)分布的定量數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍選擇性抑制結直腸CSCs的自我更新

采用不同濃度二甲雙胍（5、10、20、30 μmol/L）與原代結直腸癌類器官（PDO1、PDO2和PDO3）中分選出的Wnt+細胞和Wnt-細胞分別在體外共培養(yǎng)形成細胞球體。體外細胞球體形成實驗顯示不同濃度的二甲雙胍均可以顯著抑制Wnt+細胞自我更新形成細胞球體（P＜0.01，圖1A），對Wnt-細胞無顯著抑制效應（P＞0.05，圖1A）。當二甲雙胍濃度升至10 μmol/L后，其對Wnt+細胞形成細胞球體的抑制率已超過50%（圖1A）。因此，選取10 μmol/L二甲雙胍與Wnt+細胞共培養(yǎng)作為最佳的體外實驗模型。單克隆集落形成實驗同樣顯示，10 μmol/L二甲雙胍在體外可顯著抑制單個Wnt+細胞自我更新形成單克?。≒＜0.001，圖1B）。進一步，通過二甲雙胍處理接種不同數量級的Wnt+細胞的小鼠，體內有限稀釋實驗顯示二甲雙胍可以抑制Wnt+細胞形成移植瘤的數量，并顯著降低腫瘤起始細胞（TICs）的數量（P＜0.001，表2）。

圖1 二甲雙胍體外對結直腸癌干細胞和癌分化細胞的自我更新能力的影響Fig.1 Evaluation of self-renewal capacity of CSCs and differentiated cancer cells obtained from PDOs following metformin treatment. A: Sphere formation assays of Wnt+ and Wnt- cells treated with different concentrations of metformin. B: Colony formation assays of Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.(**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group).

表2 小鼠體內有限稀釋實驗檢測二甲雙胍對結直腸癌干細胞成瘤能力的影響Tab.2 Limiting dilution assays on tumor-initiating frequencies(TIFs)of metformin-treated colorectal CSCs in vivo

2.2 二甲雙胍促進Wnt+細胞分化為癌分化細胞

用10 μmol/L二甲雙胍處理純化的CSCs 3 d后，用流式細胞儀檢測Wnt+細胞比例變化，結果顯示二甲雙胍可顯著降低Wnt+細胞的比例（P＜0.01，圖2A）。qRT-PCR分析顯示，二甲雙胍顯著抑制Wnt+細胞中干性相關標志物CD133、Lgr5、CD44的mRNA水平，顯著升高Wnt+細胞中癌分化細胞相關標志物MUC2、KRT20和FABP2的mRNA水平（P＜0.05，圖2B）。進一步分析Wnt+細胞中GFP 的熒光強度，結果顯示二甲雙胍能顯著抑制Wnt+細胞中Wnt 信號通路活性（P＜0.001，圖2C）。qRT-PCR實驗證實，二甲雙胍能顯著抑制Wnt+細胞Wnt下游信號通路c-Myc、CCND1、ASCL2和AXIN2的mRNA水平（P＜0.05，圖2D）。

圖2 二甲雙胍抑制結直腸癌干細胞Wnt信號通路并促進其分化Fig.2 Metformin inhibits Wnt activity of CSCs and induces CSCs into differentiated cancer cells.A, C: FACS analysis on Wnt expression in 10 μmol/L metformin-treated CSCs and GFP intensity of residual Wnt+cells.B,D:qRT-PCR analysis of changes in cancer stemness-related markers,differentiation-related markers and Wnt target genes in Wnt+ cells treated with 10 μmol/L metformin.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

2.3 二甲雙胍對結直腸CSCs糖代謝活性的影響

通過海馬能量代謝分析儀分析顯示10 μmol/L二甲雙胍處理Wnt+細胞后，其基礎呼吸和氧化磷酸化的OCR均顯著下降（P＜0.001，圖3A）。同時，其ECAR水平顯著增加（P＜0.001，圖3B）。TMRE探針檢測線粒體膜電位顯示，二甲雙胍能顯著降低Wnt+細胞線粒體膜電位（P＜0.001，圖3C）。MitoSOX 探針檢測顯示，二甲雙胍顯著抑制Wnt+細胞內線粒體ROS 的產生（P＜0.001，圖3D）。

圖3 二甲雙胍抑制結直腸癌干細胞的線粒體有氧代謝并降低細胞內ROSFig.3 Metformin impairs mitochondrial aerobic capacity and ROS production in colorectal CSCs.A, B: Seahorse analysis for OCR and ECAR of 10 μmol/L metformintreated Wnt+cells.C,D:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/Lmetformin-treated Wnt+cells.***P＜0.001 vs control group.

2.4 二甲雙胍促進結直腸癌干細胞分化及機制

體外細胞球體形成實驗顯示，半乳糖顯著增強Wnt+細胞體外自我更新形成細胞球體的能力，二甲雙胍或外源性抗氧化劑NAC均能顯著抑制Wnt+細胞的細胞球體形成能力，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖促進Wnt+細胞形成細胞球體的效應（P＜0.05，圖4A、B）。MitoSOX探針檢測證實，半乳糖顯著增強Wnt+細胞線粒體ROS水平；加入二甲雙胍或外源性抗氧化劑NAC均能顯著抑制Wnt+細胞ROS 水平，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖增強Wnt+細胞ROS水平的效應（P＜0.01，圖4C）。進一步流式細胞學分析各組Wnt+細胞比例及其細胞內Wnt信號通路活性顯示，半乳糖顯著增加細胞球體中Wnt+細胞比例及其Wnt活性，二甲雙胍和NAC均能顯著降低細胞球體中Wnt+細胞比例及其Wnt活性；并且，二甲雙胍可顯著削弱半乳糖增強Wnt+細胞比例及Wnt活性的效應（P＜0.05，圖4D、E）。

圖4 二甲雙胍通過降低結直腸癌干細胞線粒體ROS抑制其自我更新Fig.4 Metformin inhibits self-renewal capacity of colorectal CSCs by reducing mitochondrial ROS.A,B:Representative images(Original magnification: ×200) and quantitative analysis of sphere-formation capacity of Wnt+ cells treated with 10 mmol/L galactose(Gal),10 μmol/L metformin(Met),5 mmol/L NAC and 10 mmol/L galactose plus 10 μmol/L metformin.C:FACS analysis for mitochondrial ROS production in Wnt+cells.D,E:FACS analysis on Wnt expression and GFP intensity of Wnt+cells in spheres.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Gal group.

2.5 二甲雙胍調控結直腸癌干細胞Wnt信號通路的機制

免疫印跡檢測顯示，人結直腸癌類器官細胞不表達NDI1，轉染NDI1 慢病毒后細胞可穩(wěn)定表達NDI1（圖5A）。TMRE探針和MitoSOX探針檢測分析顯示，10 μmol/L二甲雙胍顯著抑制結直腸Wnt+細胞線粒體膜電位及細胞內ROS水平，轉染NDI1可顯著削弱二甲雙胍抑制結直腸CSCs線粒體氧化磷酸化及ROS的效應（P＜0.001，圖5B、C）。熒光顯微鏡觀察及流式細胞檢測顯示，10 μmol/L二甲雙胍顯著降低PDOs中Wnt+細胞的比例及其Wnt信號通路活性，轉染NDI1可顯著削弱二甲雙胍降低結直腸CSCs的比例、抑制其Wnt信號通路活性的效應（P＜0.001，圖5D、F）。

圖5 二甲雙胍抑制線粒體復合體I抑制結直腸癌干細胞Wnt/β-catenin信號通路Fig. 5 Metformin suppresses Wnt/β-catenin signaling pathway of colorectal CSCs by inhibiting mitochondrial complex I.A:Western blotting for NDI1 expressions in Wnt+cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus.B,C:FACS analysis for mitochondrial membrane potential and ROS production of 10 μmol/L metformin-treated Wnt+ cells infected by NDI1 lentivirus or vector lentivirus. D-F: Representative images and FACS analysis of Wnt expression and GFP intensity in NDI1 lentivirus or vector lentivirus-infected Wnt+ cells derived organoids (Scale bar: 100 μm).***P＜0.001 vs control group,###P＜0.001 vs vector lentivirusinfected organoids treated with 10 μmol/Lmetformin.

3 討論

二甲雙胍是經典的治療糖尿病的藥物，其潛在的預防和抗結直腸癌的作用也引起了廣泛的研究興趣［9-13］。然而，其發(fā)揮作用的對象和機制仍缺乏不清楚［19,20］。本研究首次使用人原代結直腸癌PDOs作為研究對象，探討臨床治療濃度（5～30 μmol/L）的二甲雙胍對不同腫瘤和不同細胞亞群的抑制效應［21,22］，結果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對抑制結直腸CSCs體外自我更新形成細胞球體的效應呈濃度依賴性，對癌分化細胞無顯著影響。同時，二甲雙胍可顯著降低CSCs相關基因和Wnt信號通路下游基因的mRNA表達水平，顯著升高癌分化細胞相關基因的mRNA水平。既往體內研究數據僅發(fā)現(xiàn)二甲雙胍降低CSCs形成腫瘤的體積或生長速度，無法排除二甲雙胍對增殖的抑制效應［20-23］，本研究率先通過小鼠體內有限稀釋實驗計算可形成腫瘤細胞的數量，證實二甲雙胍在體內顯著降低結直腸CSCs亞群中的可成瘤細胞頻率，抑制CSCs自我更新形成腫瘤。以上數據證實，二甲雙胍選擇性抑制結直腸CSCs并促進其分化為癌分化細胞亞群。

二甲雙胍可以通過抑制線粒體氧化磷酸化發(fā)揮其抗腫瘤作用［24］。研究表明，結直腸CSCs較癌分化細胞具有更高的氧化磷酸化和ROS水平，ROS可以增強介導CSCs自我更新的Wnt/β-catenin信號通路［7,8,25］。因此，我們進一步探討了二甲雙胍對結直腸CSCs葡萄糖代謝和ROS水平的影響，結果顯示二甲雙胍顯著降低結直腸CSCs的細胞OCR、線粒體膜電位水平和ROS水平，顯著增強其ECAR，證實二甲雙胍可抑制結直腸CSCs氧化磷酸化及下游ROS的產生，并促進其代謝重編程至糖酵解產生更多的酸性代謝產物。加入外源性半乳糖增強細胞氧化磷酸化、升高ROS水平［26］，能顯著增強結直腸CSCs自我更新能力和Wnt信號通路活性，加入抗氧化劑NAC降低ROS水平能顯著削弱結直腸CSCs自我更新能力和Wnt信號通路活性；并且，二甲雙胍能顯著削弱半乳糖增強結直腸CSCs的線粒體氧化磷酸化和ROS 水平的效應，從而抑制半乳糖對Wnt/βcatenin信號通路的促進作用。以上數據表明，二甲雙胍通過抑制線粒體氧化磷酸化及下游ROS的生成降低結直腸CSCs的Wnt/β-catenin信號通路。

二甲雙胍通過抑制線粒體復合體I發(fā)揮其臨床治療作用［27］。我們將酵母NADH脫氫酶NDI1轉染至結直腸癌PDOs，其在細胞內可替代人線粒體復合體I的功能且不受二甲雙胍的抑制，從而維持線粒體的有氧代謝和ROS水平［28］。轉染NDI1后，二甲雙胍失去降低結直腸CSCs氧化磷酸化和ROS水平的作用，與文獻報道一致［12］。流式細胞學分析顯示，轉染NDI1可挽救二甲雙胍降低結直腸CSCs 比例和Wnt 活性水平的效應。表明二甲雙胍通過抑制線粒體復合體I下調CSCs的Wnt/β-catenin信號通路。

目前結直腸癌和卵巢癌的臨床研究均已發(fā)現(xiàn)，術前服用二甲雙胍可顯著降低腫瘤內CSCs的比例，提示二甲雙胍在靶向抑制CSCs中有重要的應用前景［29,30］。本研究證實了二甲雙胍通過抑制結直腸CSCs的線粒體復合體I降低結直腸CSCs線粒體氧化磷酸化水平，從而通過抑制ROS/Wnt/β-catenin 信號通路降低結直腸CSCs的自我更新能力，為探索應用二甲雙胍治療結直腸癌提供了新的理論依據。