徐　超，鮑俊旺，蔡秋鳳,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心，福建 廈門 361021)

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鯉魚肌肉Ⅴ型膠原蛋白的分離純化及其抗體制備

徐超1，鮑俊旺1，蔡秋鳳1,2，張凌晶1,2，劉光明1,2，曹敏杰1,2

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心，福建 廈門 361021)

[摘要]通過酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化鈉鹽析等方法，從鯉魚肌肉中純化得到了V型膠原蛋白.SDS-PAGE電泳圖譜分析發(fā)現(xiàn)，其至少由2條α鏈(α1和α2)組成，其中α1分子質(zhì)量約為135 ku，α2分子質(zhì)量約為120 ku.通過圓二色光譜儀分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征，其熱變性溫度為30.5 ℃.將V型膠原蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，成功制備了多克隆抗體.采用免疫印跡法對該多克隆抗體的特異性進(jìn)行分析，證明其僅與魚類V型膠原蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，特異性良好.

[關(guān)鍵詞]V型膠原蛋白；圓二色譜；多克隆抗體；免疫印跡法；鯉魚

0引言

膠原蛋白(Collagen)是一種高分子蛋白質(zhì)，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之一，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中含量也最為豐富.膠原蛋白廣泛存在于動物的皮膚、肌腱、軟骨、韌帶及其他結(jié)締組織中，具有支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能，占哺乳動物蛋白質(zhì)總量的25%~30%[1].生物體內(nèi)膠原蛋白種類較多，常見的類型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型.在魚類的肌肉組織中已經(jīng)報(bào)道了Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ等類型的膠原蛋白，其中，Ⅰ型膠原蛋白的含量最為豐富，為主要膠原蛋白，而Ⅴ型膠原蛋白的含量相對較低，為次要膠原蛋白[2].

膠原蛋白因?yàn)榫哂辛己玫纳锝到庑浴⑸锵嗳菪砸约吧锘钚?，如低免疫原性、在體內(nèi)易被吸收、能促進(jìn)細(xì)胞生長、促進(jìn)血小板凝結(jié)等，在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用.膠原蛋白制備的基本原理主要是根據(jù)其難于溶解的特性，通過改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，最后實(shí)現(xiàn)膠原蛋白與其他蛋白質(zhì)的分離.魚類膠原蛋白的提取主要以酸法和酶法為主，也有鹽析等提取方法.在實(shí)際提取過程中，不同提取方法之間往往互補(bǔ)[3-4].Sato等[5]用酸、酶結(jié)合鹽析法從鯉魚(Cyprinus carpio)肌肉中提取出Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白.Wang等[6]從軟骨魚史氏鱘(Acipenser schrenckii)魚皮中提取了Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白.

目前，國內(nèi)外對于魚類Ⅰ型膠原蛋白的研究已有很多報(bào)道[3-6]，但對于含量較少、提取過程較為復(fù)雜的Ⅴ型膠原蛋白的研究報(bào)道較少.研究發(fā)現(xiàn)，魚類冷藏過程中肌肉的軟化與膠原蛋白(尤其與Ⅴ型膠原蛋白)含量的變化密切相關(guān)[2,5].因此，對Ⅴ型膠原蛋白的研究應(yīng)引起人們的高度關(guān)注.本研究從鯉魚肌肉中分離純化Ⅴ型膠原蛋白，并成功制備了高特異性多克隆抗體，為今后對魚類Ⅴ型膠原蛋白的進(jìn)一步研究提供了新手段.

1材料與方法

1.1　材料與儀器

鮮活鯉魚((1500±200) g)購于廈門集美菜市場，宰殺后取其肌肉立即用于實(shí)驗(yàn).蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購于美國Thermo scientific公司；胃蛋白酶購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)為 Bio-Rad(美國)公司產(chǎn)品；羊抗兔 IgG-HRP 為DAKO(丹麥)公司產(chǎn)品，ECL 底物為 Pierce(美國)公司產(chǎn)品.其他試劑均為分析純.

組織搗碎機(jī)(PT-2100，Kinematica，瑞士)；高速冷凍離心機(jī)(Avanti JA-26.5，Beckman，美國)；小型冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5417，Eppendorf，德國)；超純水系統(tǒng)(RIOS 8，Millipore，美國)；凝膠成像儀(G-BOX，Syngene，英國)；圓二色光譜儀(Chirascan，Applied Photophysics，英國)；恒溫水浴鍋(Memmert，德國)；pH計(jì)(Sartorius，德國).

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鯉魚Ⅴ型膠原蛋白的分離純化

鯉魚肌肉中膠原蛋白的提取主要參照Sato等[5]和Wang等[6]的方法，并做了適當(dāng)修改，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將新鮮的魚肉(1500 g)絞碎后置于10倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液中，組織搗碎，離心(5000 r/min，20 min)取沉淀再加入到20倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液中，攪拌過夜，此操作重復(fù)4次.獲得的沉淀用蒸餾水洗至中性，再加入到10倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液中，攪拌2 d，離心去除酸不溶性成分.上清液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶，攪拌2 d，離心去除不溶性成分，上清液再加入NaCl至終濃度為2 mol/L，將膠原蛋白析出，離心(9000 r/min，30 min)取沉淀.此時(shí)的膠原蛋白主要為Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白的混合物，需要在接下來的步驟通過不同的鹽濃度進(jìn)行分離.得到的沉淀加入50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5,含1 mol/L NaCl)溶解，離心后取上清液，再加入NaCl至終濃度為2.4 mol/L，再進(jìn)一步離心(24900 r/min，90 min)后所得沉淀即為Ⅰ型膠原蛋白.

在Ⅰ型膠原蛋白的上清液中加入NaCl至終濃度為4.0 mol/L，離心(24900 r/min，90 min)取沉淀，將沉淀復(fù)溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，再裝入到透析袋中用乙酸溶液透析，期間每4 h換一次透析液.透析24 h加入NaCl至終濃度為0.7 mol/L，離心(10000 r/min，30 min)取上清液，在上清液中加入NaCl至終濃度為2.0 mol/L，離心(10000 r/min，30 min)，沉淀即為V型膠原蛋白.將沉淀復(fù)溶并用0.5 mol/L乙酸透析，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2圓二色譜對Ⅴ型膠原蛋白的測定

將純化的膠原蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為0.2 g/L，然后放入直徑為0.2 cm的比色皿中進(jìn)行圓二色譜分析.設(shè)置波長范圍為190~260 nm，步進(jìn)值為1.0，帶寬為1 nm，單點(diǎn)掃描時(shí)間為0.5 s，單一溫度點(diǎn)為20 ℃.同一個(gè)樣品重復(fù)測量3次.

測定膠原蛋白的熱變性溫度時(shí)，從10~80 ℃，每上升1 ℃掃描一次，再將得到的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析其熱變性溫度.

1.2.3Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體的制備

取100 μL 1 g/L的純化V型膠原蛋白與300 μL弗氏完全佐劑混合，置于混合器劇烈振蕩使抗原充分乳化，再將乳劑靜脈注射至質(zhì)量約2 kg的新西蘭大白兔.兩周后，用100 μg V型膠原蛋白與300 μL弗氏不完全佐劑混合，選取不同點(diǎn)加強(qiáng)免疫4次，耳動脈取少量血清檢測抗體效價(jià).在效價(jià)達(dá)到要求后，最后一次采血，將血漿放置于4 ℃靜置過夜，然后1500 r/min離心15 min，得到的上清液即為抗血清.

將抗血清和0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8.0)等比例混合上樣于與預(yù)先用相同緩沖液平衡好的Protein A Sepharose預(yù)裝柱，然后依次用10倍體積的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)和0.01 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)開始流洗，直至蛋白質(zhì)含量A280達(dá)基線.用0.1 mol/L甘氨酸(pH=3.0)以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集樣品，用 1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)中和.將純化得到的IgG多克隆抗體進(jìn)行分裝，于-80 ℃冰箱保存.

1.2.4免疫印跡法(Western blotting)

免疫印跡法參考Towbin等[7]的方法，將SDS-PAGE凝膠上的樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶室溫封閉2 h，TBST漂洗，加入一抗(兔抗V型膠原蛋白抗體，1∶4000)室溫孵育2 h，TBST漂洗，再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶20000)作為二抗，室溫孵育1 h，用TBST漂洗后，加入底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光ECL顯色.

2結(jié)果

2.1　鯉魚Ⅴ型膠原蛋白的分離純化

由于不同類型的膠原蛋白在中性和酸性條件下有不同的鹽析濃度，根據(jù)膠原蛋白這一特性，通過胃蛋白酶酶解和氯化鈉鹽析從鯉魚肌肉中分離得到2種不同的膠原蛋白，即：Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白(見圖1).鯉魚V型膠原蛋白α1鏈(分子質(zhì)量約135 ku)的含量約為α2鏈(分子質(zhì)量約120 ku)的2倍，推測其亞基組成形式可能為α1(V)2α2(V).研究表明，魚類Ⅴ型膠原蛋白至少由3條α鏈組成[8-10]，且至少存在4種亞基組成形式，分別是α1(V)2α2(V)、α1(V)α2(V)α3(V)、α2(V)3以及Ⅴ/Ⅵ混合的α鏈[11].本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[5-6，12-13]提取的Ⅴ型膠原蛋白的電泳圖譜結(jié)果相似.

2.2?、跣湍z原蛋白的圓二色譜分析

圓二色光譜(CD)是應(yīng)用最為廣泛的測定生物大分子二級結(jié)構(gòu)的方法，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究.如圖2所示，鯉魚Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白的CD光譜波峰在221 nm處，波谷在198 nm處，兩條光譜線在210 nm處相交，這是膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)典型的特征[14-15].該結(jié)果與Wang等[5]從史氏鱘魚皮中得到的Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白的圓二色譜掃描結(jié)果相似.如圖3所示，鯉魚Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度為30.5 ℃.采用同樣的方法分析得到鯉魚Ⅰ型膠原蛋白的熱變性溫度為28.5 ℃.Wang等[5]從史氏鱘魚皮中純化的Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度分別為32.52 ℃和35.92 ℃，說明Ⅴ型比Ⅰ型膠原蛋白熱穩(wěn)定性高，這與本文的研究結(jié)果類似.

2.3　抗Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體的性質(zhì)分析

2.3.1Dot blot法進(jìn)行抗體效價(jià)分析

在NC膜上用移液槍點(diǎn)上相同量的抗原，將純化后的抗V型膠原蛋白多克隆抗體稀釋不同倍數(shù)作為一抗孵育，經(jīng)二次抗體反應(yīng)后進(jìn)行ECL顯色.由圖4可知，抗V型膠原蛋白多克隆抗體的效價(jià)可以達(dá)到 1∶8000.

2.3.2抗Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體的特異性分析

采用 Western blotting對抗Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體進(jìn)行特異性分析.由圖5a可知，該抗體僅與鯉魚Ⅴ型膠原蛋白條帶反應(yīng)，而不與肌肉粗提物中的其他蛋白質(zhì)反應(yīng)，表明制備的抗Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體特異性良好.對反應(yīng)條帶進(jìn)行分析，兩條鏈的反應(yīng)程度相當(dāng)，與SDS-PAGE的結(jié)果有差異，這可能是由于樣品的濃度不同引起的結(jié)果.由于Western bloting采用的是ECL法顯影，靈敏度高，在樣品蛋白濃度較高的情況下，會掩蓋這種濃度差異.進(jìn)一步對該抗體的種屬特異性進(jìn)行分析，從圖5b和圖5c的結(jié)果可知，制備的抗V型膠原蛋白多克隆抗體只與海水魚藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)肌肉中的V型膠原蛋白有反應(yīng)，而對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、南美白對蝦(Penaeus vannameiBoone)、豬和牛的肌肉粗提液的檢測結(jié)果均為陰性，表明本研究制備的抗鯉魚Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體種屬特異性良好.

3討論

本研究通過酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化鈉鹽析等方法從鯉魚肌肉中純化得到了Ⅴ型膠原蛋白.在與含量最高的I型膠原蛋白的分離中，利用Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白在不同的鹽濃度下溶解度的差異，采用改變鹽濃度的方法把二者分開.SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化的蛋白質(zhì)主要由2條α鏈(α1和α2)組成，其中α1分子質(zhì)量約為135ku，α2分子質(zhì)量約為120ku.文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道，魚類V型膠原蛋白至少由3條α鏈(主要為α1和α2)組成.最近報(bào)道的史氏鱘V型膠原蛋白則由α1、α2和α3組成[6]，這是否是軟骨魚的特征有待進(jìn)一步驗(yàn)證.本實(shí)驗(yàn)得到的V型膠原蛋白α1鏈的含量約為α2鏈的2倍，推測α1(V)2α2(Ⅴ)可能為其亞基組成.通過圓二色光譜分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)V型膠原蛋白具有膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征，其熱變性溫度為30.5 ℃.

將純化的Ⅴ型膠原蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，成功制備了抗V型膠原蛋白多克隆抗體，采用免疫印跡法對制備的多克隆抗體進(jìn)行特異性分析，發(fā)現(xiàn)其特異性良好.采用制備的抗體對其他水產(chǎn)動物和哺乳動物肌肉粗提液進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有藍(lán)圓鲹肌肉中檢測到了Ⅴ型膠原蛋白的存在，且只有一條α鏈有反應(yīng)，推測這可能是由于不同魚類之間Ⅴ型膠原蛋白一級結(jié)構(gòu)的差異造成的.利用該抗體，在皺紋盤鮑、南美白對蝦、豬和牛的肌肉中均未檢測到V型膠原蛋白的陽性反應(yīng)，推測這是由于不同物種間Ⅴ型膠原蛋白的同源性低導(dǎo)致的結(jié)果.當(dāng)然，這也可能是由于皺紋盤鮑和南美白對蝦的肌肉中Ⅴ型膠原蛋白的含量很低所致，具體原因有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

有研究發(fā)現(xiàn)，在魚體死后的肌肉軟化過程中，膠原蛋白的含量不斷降低，肌肉硬度與膠原蛋白的含量及完整性密切相關(guān)[2,16].由于傳統(tǒng)的膠原蛋白提取分析方法只能獲得膠原蛋白含量變化的信息，但不能得到膠原蛋白降解的直接證據(jù).為了研究魚類冷藏過程中膠原的變化，有必要制備高特異性的抗魚類膠原蛋白抗體，通過免疫印跡方法并結(jié)合肌肉彈性的質(zhì)構(gòu)分析，可以更準(zhǔn)確地了解膠原蛋白在不同冷藏時(shí)間含量的變化情況并揭示其機(jī)理.本研究結(jié)果表明，制備的抗V型膠原抗體的特異性和效價(jià)都比較理想，為后期詳細(xì)研究魚類冷藏過程中肌肉軟化時(shí)Ⅴ型膠原蛋白的降解情況提供可靠的分析方法.

[參考文獻(xiàn)]

[1]蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001.

[2]SATO K,ANDO M,KUBOTA S,et al.Involvement of type V collagen in softening of fish muscle during short-term chilled storage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1997,45(2):343-348.

[3]連喜軍,魯曉翔,劉勤生.魚類膠原蛋白研究進(jìn)展[J].肉類研究,2007,01:46- 49.

[4]DEYL Z,MIKSIK A,ECKHARDT A.Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins[J].Journal of Chromatography B,2003,790(1/2):245-275.

[5]SATO K,YOSHINAKA R,SATO M,et al.Isolation of types I and V collagens from carp muscle[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry,1988,90(1):155-158.

[6]WANG L,LIANG Q F,WANG Z B,et al.Preparation and characterisation of type I and V collagens from the skin of Amur sturgeon(Acipenser schrenckii)[J].Food Chemistry,2014,148:410- 414.

[7]TOWBIN H,STAEHELIN T,GORDON J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1979,76:4350- 4354.

[8]HWANG J H,MIZUTA S,YOKOYAMA Y,et al.Purification and characterisation of molecular species of collagen in the skin of skate(Raja kenojei)[J].Food Chemistry,2007,100(3):921-925.

[9]NISHIMOTO M,MIZUTA S,YOSHINAKA R.Characterization of molecular species of collagen in muscles of Japanese amberjack,Seriolaquinqueradiata[J].Food Chemistry,2004,84(1):127-132.

[10]NISHIMOTO M,SAKAMOTO R,MIZUTA S,et al.Identification and characterisation of molecular species of collagen in ordinary muscle and skin of the Japanese flounderParalichthysolivaceus[J].Food Chemistry,2005,90(1/2):151-156.

[11]BIRK D E.Type V collagen:heterotypic type I/V collagen interactions in the regulation of fibril assembly[J].Micron,2001,32:223-237.

[12]SATO K,SAKUMA A,OHTSUKI K,et al.Subunit composition of eel(Anguilla japonica)type V collagen:evidence for existence of a novel fourth α4(V)chain[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1994,42:675-678.

[14]IKOMA T,KOBAYASHI H,TANAKA J,et al.Physical properties of type I collagen extracted from fish scales ofPagrusmajorandOreochromisniloticas[J].International Journal of Biological Macromolecules,2003,32(3/5):199-204.

[15]WOOD A,OGAWA M,PORTIER R J,et al.Biochemical properties of alligator(Alligator mississippiensis)bone collagen[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2008,151(3):246-249.

[16]曹敏杰,張玲,王慈.魚類基質(zhì)金屬蛋白酶研究進(jìn)展[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,19(5):321-329.

(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Purification of Type V Collagen from Common Carp(Cyprinus carpio)Muscle and Preparation of Polyclonal AntibodyXU Chao1,BAO Jun-wang1,CAI Qiu-feng1,2,ZHANG Ling-jing1,2,LIU Guang-ming1,2,CAO Min-jie1,2

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;

2.Engineering Research Center for Aquatic Products Processing of Fujian Province,Xiamen 361021,China)

Abstract:The type V collagen from common carp muscle was extracted by pepsin digestion and salt precipitation.SDS-PAGE analysis revealed that the protein contains at least two different α chains(α1and α2).The molecular mass of α1-chain was about 135 ku,while that of α2-chain was around 120 ku.The characteristic of type V collagen is typical with triple helical structure and its denaturation temperature is 30.5 ℃ as assessed by circular dichroism.Purified type V collagen was used as an antigen to immunize a New Zealand rabbit subcutaneously to prepare a specific polyclonal antibody.The specificity of the anti-collagen(V)polyclonal antibody was confirmed by Western blotting and it specifically reacted with type V collagen from fish.

Key words:type V collagen;circular dichroism;polyclonal antibody;Western blotting；Cyprinuscarpio

[中圖分類號]Q 512+.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-7405(2015)06-0401-06

[作者簡介]徐超(1991—),男，碩士生，從事蛋白質(zhì)化學(xué)研究.通信作者：曹敏杰(1964—)，男，教授，博士，從事蛋白質(zhì)化學(xué)及水產(chǎn)品加工方向研究，E-mail:mjcao@jmu.edu.cn.

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271838)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201305015-3)

[收稿日期]2015-03-30[修回日期]2015-05-27