楊 超，曾艷平，楊 桐，覃君慧，李海勛，桑宏勛

（1．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；

2．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032）

阿司匹林抑制去勢(shì)大鼠IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF的表達(dá)及其防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用的研究

楊 超1，曾艷平1，楊 桐2，覃君慧2，李海勛1，桑宏勛1

（1．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；

2．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032）

目的探討阿司匹林對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子- （TNF- ）及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）表達(dá)的影響，以及其防治骨質(zhì)疏松的作用。方法選取Sprague-Dawley大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）和去卵巢模型組（50只），術(shù)后1周去卵巢模型組大鼠再隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松組，其中，A組（0．25 mmol／L阿司匹林）、B組（0．5 mmol／L）、C組（1．0 mmol／L）和D組（1．5 mmol／L），各10只。檢測(cè)各組血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平，同時(shí)采用Micro-CT對(duì)骨小梁微觀三維形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果骨質(zhì)疏松組血清IL-1，IL-6，TNF- ，M-CSF分別為（80．15±7．18）pg／mL、（82．16± 6．63）pg／mL、（30．21±4．73）pg／mL和（11．42±4．25）pg／mL，均明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）。A，B，C，D組中，D組 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF水平最低（P＜0．05）。骨質(zhì)疏松組骨組織 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF分別為（71．24±8．10）pg／mL、（78．02±5．15）pg／mL、（26．92±3．23）pg／mL和（10．22±3．15）pg／mL，均明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）；A，B，C，D組中，D組 IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平最低（P＜0．05）。Micro-CT檢測(cè)結(jié)果表明，阿司匹林治療組腰椎椎體骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量及骨密度均顯著高于骨質(zhì)疏松組。結(jié)論阿司匹林能抑制去勢(shì)大鼠骨流失，這可能與阿司匹林抑制大鼠血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF-和M-CSF的表達(dá)有關(guān)，從而使破骨活動(dòng)減弱的作用。

阿司匹林；細(xì)胞因子；骨質(zhì)疏松；大鼠

骨質(zhì)疏松是中老年人群高發(fā)疾病，患者單位體積內(nèi)骨組織量顯著低于正常水平，并因此出現(xiàn)疼痛、駝背、身高降低、骨折等癥狀[1]。臨床尚未明確其發(fā)病機(jī)制，但分析可能與骨微環(huán)境改變有關(guān)。白細(xì)胞介素 -1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）是骨微環(huán)境中的重要功能因子，對(duì)骨代謝、骨改建活動(dòng)存在重要影響[2]。阿司匹林是骨質(zhì)疏松常用治療藥物，筆者研究了其對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠體內(nèi)IL-1，IL-6，TNF-α及M-CSF表達(dá)的影響，以及其防治骨質(zhì)疏松的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)方法

動(dòng)物及分組：選取Sprague-Dawley大鼠60只，6月齡，清潔級(jí)，體重240～330 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將所有SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Sham組，10只）和去卵巢模型組（50只），其中去卵巢模型組大鼠術(shù)后1周再隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松組(OVX組)，按給予阿司匹林劑量不同分為 A，B，C，D組(給藥劑量分別為0．25，0．50，1．00，1．50 mmol／L），各10只。

造模方法：給予大鼠戊巴比妥麻醉后，常規(guī)腹部消毒，腹側(cè)入路打開腹腔，對(duì)照組大鼠切除腹腔少許脂肪組織后逐步縫合；骨質(zhì)疏松組大鼠切除雙側(cè)卵巢后逐步縫合。術(shù)后兩組大鼠給予常規(guī)抗生素治療，同樣喂食進(jìn)水。

干預(yù)方法：骨質(zhì)疏松組(DVX組)大鼠中，A組給予0．25 mmol／L阿司匹林片（阿斯利康制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026200，規(guī)格為每片0．3 g）+葡萄糖溶液10 mL灌胃治療，B組給予0．50 mmol／L，C組給予1．00 mmol／L，D組給予1．50 mmol／L。

血清 IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF檢測(cè)：治療12周后，取大鼠股動(dòng)脈血2 mL，2 000 r／min離心，收集血清，選用放射免疫（RIA）法檢測(cè)血清IL-1及IL-6，選用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α和M-CSF，試劑盒均由北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

骨組織IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF檢測(cè)：取血后處死大鼠，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)側(cè)股骨下端，多聚甲醛固定，置4℃溫箱內(nèi)保存。取部分骨樣本，EDTA脫鈣15 d，石蠟包埋，連續(xù)切片，選用卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法(ABC法)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分步選用兔抗小鼠 IL-1，IL-6，TNF-α和 M-CSF多克隆抗體進(jìn)行一抗，洗滌，山羊抗兔IgG二抗，洗滌，BAD染色，光鏡下預(yù)讀結(jié)果。

骨小梁微觀三維形態(tài)結(jié)構(gòu) Micro-CT分析：取下 L4椎體節(jié)段，切除肌肉、韌帶，僅保留椎體骨質(zhì)部分。每組動(dòng)物的10個(gè)椎體標(biāo)本放入Micro-CT(美國(guó)GE公司）樣本杯中，在相同條件下進(jìn)行三維CT重建，評(píng)價(jià)骨小梁改建情況。分析指標(biāo)包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV／TV)、骨表面積體積比（BS／BV）、骨小梁厚度（Tb．Th)、骨小梁數(shù)量（Tb．N）、骨小梁分離度 (Tb．Sp)及Micro-CT總體骨密度值（BMD)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表3和圖1。

表1 各組血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL)

表1 各組血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL)

注：與對(duì)照組比較， P＜0．05；與OVX組比較，＃P＜0．05。表2同。

組別Sham組OVX組A組B組C組D組F值P IL-1 20．17±2．86 80．15±7．18 78．27±6．83 65．37±8．30 57．22±7．48 23．22±3．16＃57．281＜0．05 IL-6 22．14±3．27 82．16±6．63 77．12±7．49 72．36±6．91 62．07±8．04 31．29±7．18＃32．173＜0．05 TNF-17．87±2．12 30．21±4．73 28．13±2．41 24．11±3．02 23．17±3．01 19．91±2．17＃11．273＜0．05 M-CSF 1．82±0．93 11．42±4．25 9．48±3．12 7．33±2．10 5．22±1．14 2．32±0．98＃13．362＜0．05

表2 各組骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL，n=10)

表2 各組骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL，n=10)

組別Sham組OVX組A組B組C組D組F值P IL-1 18．13±2．24 71．24±8．10 63．21±7．01 53．11±6．88 35．22±6．17 21．13±3．02＃21．047＜0．05 IL-6 19．92±2．51 78．02±5．15 65．22±6．81 52．05±7．11 43．20±7．06 27．09±6．11＃35．091＜0．05 TNF-13．28±1．87 26．92±3．23 21．14±2．90 19．02±2．99 17．14±2．15 15．24±1．83＃12．042＜0．05 M-CSF 1．73±0．85 10．22±3．15 8．46±2．03 6．81±1．92 4．22±1．02 2．01±0．14＃9．202＜0．05

表3 各組灌胃3個(gè)月時(shí)Micro-CT結(jié)果比較（，n=10)

表3 各組灌胃3個(gè)月時(shí)Micro-CT結(jié)果比較（，n=10)

注：與OVX組比較，aP＜0．05。

圖1 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果

3 討論

絕經(jīng)是骨質(zhì)疏松的重要病因，雌激素水平下降誘使骨吸收與骨形成平衡失調(diào)，吸收大于形成，進(jìn)而出現(xiàn)骨量降低，骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變，并發(fā)展為骨質(zhì)疏松[3]。雙側(cè)卵巢切除是經(jīng)典的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松造模方案，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有極高相似度。本研究中，選取雙側(cè)卵巢切除大鼠進(jìn)行絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠造模，并對(duì)造模大鼠進(jìn)行了不同劑量阿司匹林給藥治療。造模12周后，大鼠全身骨骼密度顯著下降，骨皮質(zhì)變薄，髓腔擴(kuò)大，破骨細(xì)胞數(shù)目顯著增多，而成骨細(xì)胞顯著減少，呈明顯骨吸收、骨形成失衡狀態(tài)，提示造模成功。

M-CSF是一種二聚體糖蛋白，主要分布于骨髓腔內(nèi)，對(duì)單核細(xì)胞分化、增殖以及活性維持具有重要作用[4]。其具有促骨吸收的功能，可與RANKL直接作用于破骨前體細(xì)胞的表達(dá)[5]。TNF-α是細(xì)胞凋亡因子，對(duì)骨吸收具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，可直接作用于破骨細(xì)胞的早期分化和成熟，還可介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞合成破骨細(xì)胞分化需求的下游因子[6]。此外，TNF-α還可抑制成骨細(xì)胞生成，同時(shí)降低骨基質(zhì)鈣化，最終誘使骨形成及骨吸收失衡。IL-1及IL-6是骨代謝中的重要參與因子，均對(duì)骨吸收具有較強(qiáng)刺激作用，可直接或間接作用破骨細(xì)胞生成，增強(qiáng)骨組織骨吸收能力[7]。已有研究顯示，絕經(jīng)后人體雌激素量大幅降低，誘使IL-6基因轉(zhuǎn)錄、IL-1及 TNF-α啟動(dòng)子拮抗能力降低，IL-1及TNF-α可作為“上游”因子共同促進(jìn)“下游”細(xì)胞因子的合成，包括IL-6及M-CSF等，最終誘使破骨細(xì)胞大量生成，導(dǎo)致骨吸收、骨形成失衡，并誘發(fā)骨質(zhì)疏松[8]。破骨細(xì)胞是一種骨組織成分，具有骨吸收功能，其功能與成骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)，二者協(xié)同在骨骼形成、發(fā)育過程中扮演著重要角色[9]。

本研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組大鼠血清及骨組織IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF水平明顯高于對(duì)照組，提示骨質(zhì)疏松組存在明顯骨吸收情況，大鼠骨質(zhì)疏松癥狀明顯。不同劑量阿司匹林干預(yù)治療后，D組大鼠血清及骨組織上述指標(biāo)表達(dá)水平降低最明顯，表明高劑量阿司匹林可有效抑制IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF表達(dá)，并以此降低大鼠骨吸收狀態(tài)；其中1．5 mmol／L給藥時(shí)，阿司匹林藥物代謝動(dòng)力學(xué)效果最佳。本研究采用Micro-CT對(duì)椎體的松質(zhì)骨進(jìn)行了重建分析，直接觀察松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)、結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)筑，并測(cè)量骨小梁的立體測(cè)量學(xué)的參數(shù)。結(jié)果表明，阿司匹林組灌胃治療3個(gè)月后松質(zhì)骨骨小梁數(shù)量、連接率及粗細(xì)程度均明顯高于OVX組，且D組與Sham組無(wú)顯著性差異。阿司匹林是臨床常用藥物，具有多種生物學(xué)效用，如抑制環(huán)氧化酶(COX)-1及COX-2活性等。體外試驗(yàn)表明，阿司匹林可有效抑制破骨前體細(xì)胞的分化、成熟，進(jìn)而改善骨吸收與骨形成失衡狀態(tài)，緩解骨組織退行性病變[10]。

綜上所述，阿司匹林能抑制去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF表達(dá)，使破骨活動(dòng)減弱，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松。此外，阿司匹林在骨質(zhì)疏松治療中存在劑量依賴性特征，但臨床尚未達(dá)成系統(tǒng)的劑量標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究。

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Aspirin in Restraining IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF Expression and Its Effect in Preventing Post-Menopause Osteoporosis

Yang Chao1,Zeng Yanping1,Yang Tong2,Qin Junhui2,Li Haixun1,Sang Hongxun1
(1．Xijing Hospital,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032; 2．Pathology and Pathophysiology Teaching and Research Department,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032)

Objective To investigate the influence of aspirin on ovariectomized osteoporosis in mice interleukin-1(IL-1),interleukin-6 (IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α)and macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)expression and its role in prevention and treatment of osteoporosis．Methods 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group(control group,10 rats)and ovariectomized model group (50 rats),and the ovariectomized model group were then randomly divided into the osteoporosis group,group A(given 0．25 mmol／L aspirin),group B(given 0．5 mmol／L aspirin),group C(given 1．0 mmol／L aspirin)and group D (given 1．5 mmol／L aspirin)at 1 week after operation,10 rats in each group．The serum and bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF level were detected,while the scanning electron microscope was used to analyze every area of bone resorption．Results The IL-6,serum IL-1,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(80．15±7．18)pg／mL,(82．16 ±6．63)pg／mL,(30．21± 4．73)pg／mL and(11．42±4．25)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(71．24±8．10)pg／mL,(78．02 ±5．15)pg／mL,(26．92±3．23)pg／mL and (10．22±3．15)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the micro -CT analysis showed that the vertebral trabecular thickness,trabecular bone volume and bone mineral density of the aspirin group were significantly higher than those of the OVX group．Conclusion Aspirin can inhibit the serum and bone tissue of ovariectomized osteoporosis mice model IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF expression,weaken the osteoclast activity,and to prevent osteoporosis．

aspirin;cell factor;osteoporosis;rat

R965；R971+.1

A

1006-4931(2015)21-0015-03

2015-05-27)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：81270959。