胡莉莉 樊靈杰 香詠欣 彭 享 孔天翰 董偉華

(廣州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436)

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·論著·

蝎毒多肽B5對(duì)正常及輻射后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

胡莉莉 樊靈杰 香詠欣 彭 享 孔天翰 董偉華*

(廣州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436)

目的:觀察蝎毒多肽B5(SVPB5)對(duì)正常及輻射后的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)生長(zhǎng)的影響。方法：利用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離純化rBMSCs，體外擴(kuò)增傳代，取第3～5代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(IR-control)、正常加藥組(IR-SVPB5)、輻射對(duì)照組(IR+control)以及輻射加藥組(IR+SVPB5)。分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色及集落形成單位計(jì)數(shù)。結(jié)果：SVPB5對(duì)正常及輻射rBMSCs均有促進(jìn)增殖的作用，其中SVPB5處理3 d后，對(duì)正常rBMSCs開(kāi)始便表現(xiàn)為明顯的促增殖作用(P<0.05)，而對(duì)輻射rBMSCs則于第10、11天表現(xiàn)出明顯的促增殖作用(P<0.05)。SVPB5作用于正常rBMSCs后，其衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，其集落數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：SVPB5能促進(jìn)正常及輻射后rBMSCs增殖，增強(qiáng)rBMSCs的增殖潛能并緩解其衰老。

蝎毒增殖多肽；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞衰老

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，也被稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞或間葉祖細(xì)胞，存在于骨髓的基質(zhì)部分，在骨髓有核細(xì)胞總數(shù)中只占有一小部分(0.001%～0.01%)。目前研究證實(shí)，BMSCs具有支持造血、促進(jìn)造血重建等作用[1]。在骨髓微環(huán)境中，BMSCs通過(guò)造血微環(huán)境與造血干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、粘附分子等之間形成復(fù)雜的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)正常造血調(diào)控的精細(xì)調(diào)節(jié)，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于保持機(jī)體在生理狀況下尤其是應(yīng)激狀態(tài)下造血的穩(wěn)定性具有重要作用。

蝎毒多肽B5(scorpion venom peptide B5，SVPB5)是從東亞鉗蝎蝎毒中分離純化的一種分子量為7 212.33 Da、含66個(gè)氨基酸殘基的多肽[2]。前期的研究結(jié)果顯示，SVPB5具有明顯的促輻射后小鼠骨髓造血功能恢復(fù)的作用，且SVPB5對(duì)X射線輻射后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，rBMSCs)有明顯促增殖，緩解其衰老的作用[3]。然而，SVPB5對(duì)正常rBMSCs的作用仍不清楚。本研究以rBMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察SVPB5對(duì)正常rBMSCs生長(zhǎng)的影響，并連續(xù)觀察SVPB5對(duì)X線輻射后的rBMSCs的促增殖作用。

1 材料與方法

SPF級(jí)SD大鼠，雌性或雄性，6～8周，180～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物質(zhì)量合格證明No.4407209475，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002]。

1.2 主要試劑

SVPB5(本實(shí)驗(yàn)室分離純化制備)，L-DMEM培養(yǎng)基粉劑(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco)，L-谷氨酰胺(Sigma)，0.25%胰酶(Gibco)，碳酸氫鈉(廣州試劑)，衰老試劑盒(Cell Signaling Technology)，結(jié)晶紫粉末。

1.3 主要器械及儀器

眼科剪和眼科鑷，2 mL無(wú)菌注射器，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，數(shù)碼相機(jī)(Samsung)，離心機(jī)(Eppendorf，離心半徑為6 cm)，X射線機(jī)(SIMENSE Primus)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 全骨髓細(xì)胞貼壁法分離純化rBMSCs 將SD大鼠頸椎脫臼處死后，75%酒精浸泡5 min，于無(wú)菌條件下取出其雙側(cè)股骨和脛骨置，去掉兩端骨骺。用無(wú)菌的2 mL注射器以無(wú)血清L-DMEM充分沖洗骨髓腔三次，收集骨髓全細(xì)胞液，900 r/min離心5 min后去除上清，L-DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗、2 mmol/L L-谷氨酰胺)重懸細(xì)胞沉淀，每只SD大鼠的全骨髓細(xì)胞接種至1個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后半量換液，48 h后全量換液，以后3 d換液1次。P0～P2細(xì)胞培養(yǎng)7～9 d至細(xì)胞布滿瓶底約90%左右后胰酶消化2 min，以1∶2傳代。P3以后的細(xì)胞培養(yǎng)3 d(細(xì)胞融合80%～90%)后即可以1∶2傳代。收集P3～P5細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)表明，在螺栓連接較為緊密時(shí)，兩傳感器所采樣的振動(dòng)信號(hào)基本以振動(dòng)激勵(lì)的振動(dòng)函數(shù)為主，此時(shí)兩信號(hào)除振動(dòng)幅度以外，基本不存在其他差異，也反映出兩被聯(lián)件連接相當(dāng)緊密受激勵(lì)部件完全跟隨主振器件發(fā)生振動(dòng)。然而，當(dāng)螺栓連接不緊密，出現(xiàn)松動(dòng)時(shí)，其振動(dòng)波形包含高次諧波，而高次諧波在本系統(tǒng)中不作為判定條件，屬于沒(méi)有意義的引入雜波，需對(duì)其進(jìn)行濾除。本文選用FPGA進(jìn)行數(shù)字濾波，其主要特點(diǎn)是對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)合可通過(guò)改變FPGA內(nèi)濾波器的方式來(lái)適應(yīng)不同的應(yīng)用場(chǎng)合，例如高頻振動(dòng)環(huán)境下的濾波并不適用于低頻振動(dòng)環(huán)境下的濾波情況，而不需要更換硬件設(shè)施，只需將FPGA的代碼做更改即可適應(yīng)不同工作環(huán)境[11]。

1.4.2 X線輻射細(xì)胞模型 收集P3～P5對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×103/孔的密度接種于12孔板，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，利用等中心照射技術(shù)(SAD)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行總劑量8.0 Gy的X射線照射，輻射后盡快進(jìn)行細(xì)胞換液，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行相應(yīng)處理。

1.4.3 SVPB5對(duì)正常及輻射rBMSCs生長(zhǎng)的影響 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(IR-control)、正常加藥組(IR-SVPB5)、輻射對(duì)照組(IR+control)以及輻射加藥組(IR+SVPB5)。正常組以1×103/孔的密度將rBMSCs接種于12孔板，貼壁12 h后進(jìn)行換液并按照分組加藥處理，3 d加藥1次。于首次加藥處理后每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)數(shù)至加藥后第6天；輻射組以4×103/孔的密度接種rBMSCs于12孔板，貼壁12 h后進(jìn)行輻射并換液加藥，每3 d加藥1次，計(jì)數(shù)首次加藥后至第11天的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)的同時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞密度。

1.4.4 衰老相關(guān)β半乳糖苷(senescence associated beta-galactosidase，SA-β-gal)活性檢測(cè) 將rBMSCs以2.5×102/孔的密度接種于6孔板中，貼壁12 h后換液加藥，3 d加藥1次，于加藥后第9天按照衰老試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行SA-β-gal染色，衰老細(xì)胞染色藍(lán)色為陽(yáng)性細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察，計(jì)算每1 000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

1.4.5 集落染色 將rBMSCs以1.25×102/孔的密度接種于6孔板中，貼壁12 h后換液加藥，3 d加藥1次，于加藥后第7天對(duì)集落進(jìn)行結(jié)晶紫染液(0.1%)染色，水洗，干燥，倒置相差顯微鏡下觀察集落染色情況，肉眼計(jì)數(shù)每個(gè)孔內(nèi)集落數(shù)量，以含50個(gè)以上細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)集落。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 rBMSCs生長(zhǎng)特性

全骨髓細(xì)胞接種24 h半量換液后可觀察到貼壁與懸浮的圓形細(xì)胞分界清楚，48 h全量換液可去除絕大多數(shù)的懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)梭形及多邊形變化，培養(yǎng)5 d后懸浮細(xì)胞通過(guò)全量換液全部去除，一部分梭形的貼壁細(xì)胞出現(xiàn)由3～5個(gè)形態(tài)相同的細(xì)胞成簇生長(zhǎng)的小集落，至第7 d時(shí)長(zhǎng)至旋渦狀或呈一定方向生長(zhǎng)的梭形干細(xì)胞大集落，可傳代。第1代及第2代細(xì)胞雖大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)，且大小均一平行排列呈旋渦狀，但周?chē)院幸恍﹫A形細(xì)胞或短梭形基質(zhì)細(xì)胞，第3代以后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快，已經(jīng)純化至形態(tài)均一，折光性強(qiáng)，長(zhǎng)梭形的rBMSCs。見(jiàn)圖1。

圖1 不同代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)(倒置顯微鏡,×100)

2.2 SVPB5對(duì)正常及輻射后rBMSCs的促增殖作用

2.2.1 SVPB5對(duì)正常rBMSCs的促增殖作用 正常加藥組細(xì)胞數(shù)均高于正常對(duì)照組，尤其從第3天開(kāi)始，正常加藥組細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。提示SVPB5對(duì)正常rBMSCs有促增殖作用。2.2.2 SVPB5對(duì)輻射rBMSCs的促增殖作用 輻射加藥組細(xì)胞數(shù)高于輻射對(duì)照組，尤其在輻射后10、11 d最為明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。提示SVPB5對(duì)輻射rBMSCs有促增殖作用，且其促增殖作用出現(xiàn)較晚。

2.3 SVPB5對(duì)正常rBMSCs衰老的作用

SA-β-gal是細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行染色可較為直接的觀察到衰老細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量。SA-β-gal染色陽(yáng)性的細(xì)胞表現(xiàn)為圍繞細(xì)胞核的周?chē)?xì)胞質(zhì)藍(lán)染，鏡下觀察正常加藥組(圖3B)藍(lán)染細(xì)胞明顯少于正常對(duì)照組(圖3A)。正常對(duì)照組和正常加藥組SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(18.33±1.65)%和(10.7±0.7)%，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示SVPB5能下調(diào)rBMSCs細(xì)胞SA-β-gal的表達(dá)，抑制細(xì)胞衰老，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。

注：A：正常rBMSCs；B：輻射rBMSC；與對(duì)照組比較,*P<0.05

圖2 SVPB5對(duì)正常及輻射rBMSCs的促增殖作用

注：A：正常對(duì)照組(倒置顯微鏡,×100)；B：正常加藥組(倒置顯微鏡)；C：SVPB5對(duì)正常rBMSCs衰老陽(yáng)性細(xì)胞率的影響；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3 SVPB5對(duì)正常rBMSCs的衰老抑制作用(9 d)

2.4 SVPB5促進(jìn)正常rBMSCs集落的形成

集落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，正常加藥組集落數(shù)量明顯多于正常對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。提示SVPB5促進(jìn)正常rBMSCs集落的形成。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4 SVPB5對(duì)正常rBMSCs集落形成的作用(7 d)

3 討 論

放化療是腫瘤的常規(guī)治療模式，然而這些治療方法并不是腫瘤特異性的，極易造成正常組織的損傷，尤其是骨髓造血功能的抑制。有研究表明，輻射誘導(dǎo)的骨髓抑制主要是通過(guò)造血干細(xì)胞(hematopoiesis stem cells，HSCs)的細(xì)胞死亡引起，而骨髓抑制后骨髓重建主要依賴于兩個(gè)因素：充足的造血干細(xì)胞及充足的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)[4]。本實(shí)驗(yàn)以rBMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法連續(xù)觀察SVPB5對(duì)X線輻射后rBMSCs的作用，發(fā)現(xiàn)SVPB5能促進(jìn)輻射后rBMSCs增殖，提示SVPB5可通過(guò)促進(jìn)MSCs增殖而促進(jìn)放療后的骨髓重建。

隨著細(xì)胞工程學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，利用MSCs的多向分化性及其可在體外表達(dá)多種外源目的基因的特性，將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療和基因治療的研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[5]。而如何得到大量純化的MSCs則成為臨床利用這些細(xì)胞治療疾病的前提。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SVPB5促進(jìn)rBMSCs增殖，同時(shí)還促進(jìn)rBMSCs的集落形成，提示SVPB5不僅促進(jìn)了rBMSCs的增殖速度，還增強(qiáng)了rBMSCs的增殖潛能，這無(wú)疑為大量體外擴(kuò)增MSCs提供了新的方法。

本研究結(jié)果還顯示，SVPB5對(duì)正常及輻射rBMSCs均具有促增殖的作用，但是前者的促增殖作用出現(xiàn)較早(加藥后第3天)，而后者的促增殖作用則出現(xiàn)較晚，提示SVPB5對(duì)正常和輻射rBMSCs促增殖作用的機(jī)制可能不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，SVPB5促進(jìn)輻射rBMSCs增殖可能與促進(jìn)了輻射后受損的MSCs的自我修復(fù)，維持了其干細(xì)胞的自我更新能力有關(guān)。劉銘超等[6]發(fā)現(xiàn)大黃素于加藥后48 h開(kāi)始促進(jìn)rBMSCs增殖，可能與血小板生成素(TPO)基因及干細(xì)胞因子(Kitlg)基因表達(dá)明顯升高有關(guān)。黃進(jìn)等[7]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖于加藥后72 h促進(jìn)rBMSCs增殖，可能與干細(xì)胞因子(SCF)mRNA及SCF蛋白表達(dá)升高有關(guān)。SVPB5促進(jìn)rBMSCs增殖的作用是否與促進(jìn)MSCs造血相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

衰老是細(xì)胞的重要生命現(xiàn)象之一。MSCs與大多數(shù)正常的體細(xì)胞一樣，在體外培養(yǎng)時(shí)有一定的壽限。有研究表明，體外培養(yǎng)的MSCs一旦衰老，其分化潛能和細(xì)胞表型都將發(fā)生改變，而復(fù)制性衰老是從MSCs體外培養(yǎng)開(kāi)始就持續(xù)存在的生物學(xué)過(guò)程[8]。復(fù)制性衰老的MSCs增殖活性和分化能力降低，體內(nèi)移植后其分化和歸巢能力將受到限制，導(dǎo)致?lián)p傷組織再生能力降低，限制了MSCs作為種子細(xì)胞在細(xì)胞工程和組織工程學(xué)的應(yīng)用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SVPB5降低rBMSCs衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞率，緩解rBMSCs的復(fù)制性衰老，這為MSCs的細(xì)胞治療提供了更多的保障。

綜上所述，BMSCs是SVPB5作用的靶細(xì)胞群，SVPB5提高正常及輻射后rBMSCs的增殖能力，增強(qiáng)rBMSCs的增殖潛能，緩解正常及輻射后rBMSCs的衰老。這些作用不僅與促進(jìn)輻射后骨髓重建有密切關(guān)系，還與MSCs作為作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療有密切關(guān)系。但是，SVPB5作用與正常及輻射rBMSCs的具體作用機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

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(本文編輯:歐陽(yáng)菁)

Effect of scorpion venom peptide B5 on growth of normal and irradiated rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells

HuLili,FanLingjie,XiangYongxin,PengXiang,KongTianhan,DongWeihua

(DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China)

Objective:To observe scorpion venom peptide B5 (SVPB5) on growth of normal and irradiated rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (rBMSCs).Methods: rBMSCs were separated and purified with adherent cultivation of whole bone marrow cells, then cultured and amplified in vitro. Passage 3-5 rBMSCs were used as experimental subjects, divided into normal control group (IR-control group), normal dosing group (IR- SVPB5 group), irradiation control group (IR+control group) and the irradiation dosing group (IR+ SVPB5 group). Each group was counted for total cells, colony forming units and stained with senescence-associated β-galactosidase.Results: SVPB5 promoted proliferation of both normal and irradiated rBMSCs. Specifically, the proliferation-promoting effect became obvious as early as 3d of SVPB5 treatment in normal rBMSCs (P<0.05), which was not shown in irradiated rBMSCs until 10-11d of the treatment (P<0.05). After SVPB5 treatment, the normal rBMSCs showed significantly lower percentage of senescence β-galactosidase staining positive cells and higher counts of colony forming units, compared with the normal control group (bothP<0.05). Conclusion:SVPB5 may promote proliferation of normal and irradiated rBMSCs, enhance proliferation potential and mitigate cell aging of rBMSCs.

proliferation polypeptide scorpion venom; bone marrow mesenchymal stem cells; cell proliferation; cell aging

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172599)

胡莉莉(1992-)，女，碩士，助理研究員。

R285.5

2095-9664(2015)05-0012-04

2014-12-21)

研究方向：腫瘤學(xué)。

*通訊作者：E-mail：dong_gz@163.com；tianhankong@163.com