張志翔 李衛(wèi)華 李 慧 張倩倩 廖東江 盧心銘

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,廣東 廣州 510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510120)

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·論著·

野生型及突變截短型HBx轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株的蛋白組學(xué)分析

張志翔1李衛(wèi)華1李 慧1張倩倩1廖東江2盧心銘2

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,廣東 廣州 510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510120)

目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)羧基端31個(gè)氨基酸自然缺失突變體(HBxΔ31)對(duì)肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。方法：脂質(zhì)體法介導(dǎo)全長(zhǎng)HBx基因和HBxΔ31突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2，Western blotting分析證實(shí)HBx蛋白的表達(dá)，雙向電泳分離細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，圖像分析HepG2-HBx及HepG2-HBxΔ31的差異蛋白表達(dá)，MALDI-TOF-MS及數(shù)據(jù)庫搜索鑒定差異蛋白質(zhì)。結(jié)果：在HepG2-HBxΔ31及HepG2-HBxΔ31細(xì)胞株中篩選鑒定出6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分別為HSPB1、RanBP1、Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta、MRP-L12，在HBxΔ31-HepG2細(xì)胞株中MRPL12、RanBP1、HSPB1高表達(dá)，Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta低表達(dá)。結(jié)論：HBx蛋白羧基端31個(gè)氨基酸突變?nèi)笔?huì)改變肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)，這些蛋白與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),或可成為肝癌診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。

肝細(xì)胞癌；轉(zhuǎn)染；蛋白質(zhì)組

HBV X基因(HBx)是乙肝病毒基因組中最小的開放讀碼框(open reading frames，ORF)，也是功能重疊最明顯的區(qū)域，其編碼的HBx蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖與凋亡等方面有確切作用，目前普遍認(rèn)為HBx蛋白主要通過反式激活作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[1-4]。研究表明，在HBV自身基因組和宿主基因組進(jìn)行整合時(shí)，整合基因組上的HBx常常發(fā)生斷裂不全，其中HBx羧基端自然缺失31AA突變體(HBxΔ31)的發(fā)生率最高，這些缺失型的突變?cè)诟渭?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中有著重要的作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)和突變?nèi)笔虷Bx的肝癌細(xì)胞株中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況，旨在解釋肝細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制或從中篩選出腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2由本實(shí)驗(yàn)室凍存。將HBV感染患者血清中分離獲得的野生型HBx基因和肝癌組織中分離到的HBx缺失突變體HBxΔ31，分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)野生型HBx蛋白和HBx缺失突變體的人肝癌細(xì)胞株HBx-HepG2及HBxΔ31-HepG2。HBx-HepG2及HBxΔ31-HepG2均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素，0.2 mg/mL G418混合液的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)、弱陽離子納米磁珠試劑盒、α-氰基-4羥基肉桂酸、乙腈、三氟乙酸(TFA)、SPA、尿素、DTT；基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectronmetry，MALDI-TOF-MS)Autoflex-Ⅲ。

1.3 總蛋白收集

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種細(xì)胞，胰酶消化后離心，PBS洗滌三次后加入裂解液(7 mol/L Urea、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L Tris-Base、40 mmol/L DTT、2% Pharmalyte)，冰浴放置30 min，充分溶解后，4℃、20 000 g離心20 min后迅速取上清，即為細(xì)胞總蛋白。使用蛋白質(zhì)定量試劑盒2D Quantification kit定量后-70℃凍存。

1.4 第一向電泳——等點(diǎn)聚焦電泳

取300 μg總蛋白樣品與水化液(8 mol/L Urea、2% CHAPS、0.002%溴酚藍(lán)和0.5% IPG Buffer)混合至350 μL，將其加入IPG膠條中，膠面向下放入槽中，每根膠條上覆蓋1 mL礦物油，按如下條件等電聚焦：30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1 500 V，0.5 h；8 000 V，1 h;8 000 V，48 000 V h。

1.5 SDS-PAGE

將等電聚焦后的IPG膠條放入10 mL平衡液1(50 mmol/L Tris-Base、6 mol/L Urea、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚蘭、0.2% DTT)和10 mL平衡液2(50 mmol/L Tris-Base、6mol/L Urea、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚蘭、3%碘乙酰胺)中各平衡15 min。再將平衡后的IPG膠條放入SDS-PAGE膠上，用含有溴酚蘭的0.5%瓊脂糖凝膠封口后在Ettan DALT SIX 垂直電泳槽中進(jìn)行SDS-PAGE，電泳設(shè)置恒溫25℃，恒電流15 mA/gel先運(yùn)行15 min，后20 mA/gel，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到膠條的底線1 cm時(shí)停止電泳。

1.6 染色

將跑完的膠轉(zhuǎn)移到染色盒中固定30 min，考馬斯亮藍(lán)G-250染色，搖床過夜。脫色液脫色至背景無色。

1.7 圖像獲取與分析

染色后的凝膠經(jīng)ImageScanner掃描儀掃描獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜，利用Imagine master軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析.

1.8 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫查詢

質(zhì)譜鑒定和匹配在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié) 果

2.1 雙向電泳圖譜建立及蛋白點(diǎn)差異分析。

在相同條件下，對(duì)兩組細(xì)胞株的蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行了3次雙向電泳，其蛋白質(zhì)分布模式圖極為相似，蛋白斑點(diǎn)多集中于pI4-7，相對(duì)分子質(zhì)量15～75 ku區(qū)域內(nèi)。經(jīng)ImageMaster 2D Platinum軟件分析，HBx-HepG2平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為(964±33)個(gè)，HBx-31-HepG2蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為(998±37)個(gè)，組內(nèi)匹配率分別為84.3%和82.2%，組間匹配率為77.1%。電泳圖像經(jīng)分析和匹配，識(shí)別出19個(gè)差異較大蛋白點(diǎn)，從中選出10個(gè)等電點(diǎn)分布不同，差異方向不同的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。見圖1。

A.HBx-HepG2;B.HBxΔ31-HepG2

圖1 轉(zhuǎn)染野生型及缺失突變型HBx人肝癌細(xì)胞株的二維電泳凝膠圖譜(考染)

2.2 質(zhì)譜及數(shù)據(jù)庫檢查結(jié)果

對(duì)篩選到的10個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析、數(shù)據(jù)庫檢索，有6種蛋白斑點(diǎn)得到鑒定，分別為HSPB1、RanBP1、Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta、MRP-L12。其中MRPL12、RanBP1、HSPB1在HBxΔ31-HepG2細(xì)胞株中高表達(dá)，Rho-GDI alpha、Serpin B5、CapZ beta低表達(dá)。見表1。

表1 10個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢索結(jié)果

3 討 論

本組前期研究發(fā)現(xiàn)，HBx羧基端缺失的突變體對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲具有完全不同于野生型HBx生物學(xué)效應(yīng)，因此本研究采用雙向電泳和凝膠分析法，從蛋白質(zhì)組角度了解這種差異涉及的相關(guān)蛋白質(zhì)。相比于全長(zhǎng)HBx蛋白，存在羧基端缺失31AA的HBx基因?qū)C(jī)體生物學(xué)功能影響可能主要包括：①反式激活作用發(fā)生改變： HBx蛋白由2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中羧基端的51-154位氨基酸構(gòu)成反式調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域是HBx蛋白發(fā)揮反式激活作用的部位，編碼該區(qū)域的基因發(fā)生突變會(huì)使其反式激活作用發(fā)生改變；②影響細(xì)胞信號(hào)通路：HBx在低表達(dá)時(shí)主要位于細(xì)胞核，而高表達(dá)時(shí)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，胞質(zhì)中的HBx可影響多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，信號(hào)通路之間又相互影響，會(huì)形成更為復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，因此HBx的突變可對(duì)整個(gè)信號(hào)通路造成極大影響；③影響細(xì)胞增殖和凋亡：細(xì)胞增生調(diào)節(jié)異常和細(xì)胞凋亡機(jī)制受損是腫瘤發(fā)生的重要原因。HBx突變引起HSPs、MRPs等蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常，而HSPs作為分子伴侶可以通過多種方式抑制細(xì)胞凋亡，MRPs可通過影響細(xì)胞能量代謝障礙影響細(xì)胞凋亡[7-9]。④影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)： HSP27、戴帽蛋白Z(CapZ)與細(xì)胞骨架組織互相作用，在腫瘤組織中高表達(dá)，可保護(hù)癌細(xì)胞免受應(yīng)激產(chǎn)生的損傷[7,10,11]。⑤影響miRNA的表達(dá)：如miR-151，作為與肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種miRNA，miR-151可直接通過肝癌轉(zhuǎn)移抑制因子Rho GDIα而發(fā)揮功能，而在HBx羧基端缺失突變過程中Rho GDIα表達(dá)發(fā)生了明顯的改變[12-14]。

綜上所述，轉(zhuǎn)染有全長(zhǎng)及羧基端缺失HBx基因的肝癌細(xì)胞株中蛋白質(zhì)表達(dá)有著明顯的不同，這些改變涉及細(xì)胞功能的多個(gè)方面，且多數(shù)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。越來越多的研究證實(shí)HBx在肝癌發(fā)生的各個(gè)階段均起著重要的作用，但其具體的分子機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步深入研究。

[1] Knoll S, Fürst K, Thomas S, et al. Dissection of cell context-dependent interactions between HBx and p53 family members in regulation of apoptosis:a role for HBV-induced HCC [J]. Cell Cycle, 2011, 10(20):3554-3565.

[2] Wang Fan, Xia XM, Wang JL, et al. Notch1 signaling contributes to the oncogenic effect of HBx on human hepatic cells [J]. Biotechnol Lett, 2013, 35(1):29-37.

[3] Ng SA, Lee C. Hepatitis Bvirus X gene and hepatocar-cinogenesis [J]. J Gastroenterol, 2011, 46(8):974-990.

[4] Bouchard MJ, Schneider RJ. The enigmatic X gene of hepatitis B virus [J]. J Virol, 2004, 78 (23):12725 - 12734.

[5] Zhu PA, Tan DM, Peng ZT, et al. Polymorphism of hepatitis B virus x gene in hepatocellular carcinoma patients and the biological effects of HBx genewith deletion varationson QSG7701 cells [J]. Chin J Hepa-tol, 2008, 16(1):7-11.

[6] Zhang H, Shan CH, Li N, et al. Identification of a naturalmutant of HBV X protein truncated 27 amino acids at the COOH terminal and its effecton liver cell proliferation [J]. Acta Pharmacol Sin, 2008, 29(4):473-480.

[7] Guo K , Kang NX, Li Y, et al. Regulation of HSP27 on NF-k appaBpathway activation may be involved in metastatic hepatocellular carcinoma cells apoptosis [J]. BMC Can-cer, 2009(9):100.

[8] Yang YX, Sun XF, Cheng AL, et al. I ncreased expression of HSP27 linked to vincristine resistance in human gastric cancer cell line[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(2):181-189.

[9] Miller JL, Koc H, Koc EC. Identification of phosphorylation sites in mammalian mitochondrial ribosomal protein DAP3 [J]. Protein Sci, 2008, 17(2):251-260.

[10] Shin J , Lee YC, Yang SC, et al. Collapsin response mediator protein-1:a novel invasion-suppressor gene [ J]. Clin Exp Metastasis, 2003, 20(1):69-76.

[11] 黨勝春, 毛正發(fā). 肝癌組織中Ezrinhe F-actin的表達(dá)及意義[J]. 山東醫(yī)藥, 2007, 7(33):63-64.

[12] Wu Y, McRoberts K, Berr SS, et al. Neuromedin U is regulated by the metastasis suppressor RhoGDI2 and is a novel promoter of tumor formation, lung metastasis and cancer cachexia [J]. Oncogene, 2007, 26(5):765-773.

[13] Li X, Lee AY. Semaphorin 5A and plexin-B3 inhibit human glioma cell motility through RhoGDIalpha-mediated inactivation of Rac1 GTPase [J]. J Biol Chem, 2010, 285(42):32436-32445.

[14] Ding J, Huang S, Wu S, et al. Gain of miR-151 on chromosome 8q24.3 facilitates tumour cell migration and spreading through downregulating RhoGDIA [J]. Nat Cell Biol, 2010, 12(4):390-399.

(本文編輯:張輝)

·醫(yī)學(xué)新聞·

不進(jìn)早餐者血脂異常風(fēng)險(xiǎn)較高

據(jù)醫(yī)學(xué)論壇網(wǎng)報(bào)道，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科張皎月、萬麗敏和曾天舒等研究了湖北省宜昌市夷陵地區(qū)40歲及以上居民早餐頻率與血脂異常的關(guān)系。結(jié)果表明，不進(jìn)早餐者血脂異常的風(fēng)險(xiǎn)較規(guī)律進(jìn)早餐者高,養(yǎng)成規(guī)律進(jìn)早餐的習(xí)慣對(duì)于預(yù)防血脂異常的發(fā)生可能有重要的作用。相關(guān)論文發(fā)表于2015年第8期《中華內(nèi)分泌代謝雜志》。

研究者們采用隨機(jī)整群抽樣的方法于2011至2012年調(diào)查夷陵地區(qū)居民共10 420名。結(jié)果顯示，血脂異常的患病率高達(dá)64.0%,其中女性的患病率高于男性(65.9%對(duì)60.6%)。與規(guī)律進(jìn)食早餐組相比,不進(jìn)食早餐組高低密度脂蛋白膽固醇血癥及高甘油三酯血癥的患病率明顯增高。調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒等后,不同早餐頻率與高低密度脂蛋白膽固醇血癥仍相關(guān)(OR=2.382, 95%CI 1.300～4.367,P=0.019)。

Proteomic analysis of wild-type and mutant truncated HBx-transfected human hepatoma cell line

ZhangZhixiang1,LiWeihua1,LiHui1,ZhangQianqian1,LiaoDongjiang2,LuXinming2

(1DepartmentofGeriatrics,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120;2GuangzhouInstituteofRespiratoryDisease,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

Objective:To investigate the effects of a natural deletion mutant of hepatitis B virus X protein (HBx) with truncation of 31 amino acids at the carboxy-terminal (HBxΔ31) on protein expressions in liver cancer cells.Methods:Liposome-mediated transfection of full-length and HBxΔ31 mutant HBx genes into human hepatoma cell line HepG2 was performed. Western blotting was used to confirm the expression of HBx proteins. Two-dimensional electrophoresis was employed to separate the cytoplasmic proteins. The differential protein expression of HepG2-HBx and HepG2-HBxΔ31 was studied by imaging analysis. MALDI-TOF-MS and database search were used to identify the differentially expressed proteins.Results: Screening of HepG2-HBxΔ31 and HepG2-HBxΔ31 cell strains yielded 6 differentially expressed proteins:HSPB1, RanBP1, Rho-GDI alpha, Serpin B5, CapZ beta and MRP-L12. In HBxΔ31-HepG2 cell strains, we found up-regulated expression of MRPL12, RanBP1 and HSPB1, compared with down-regulated expression of Rho-GDI alpha, Serpin B5 and CapZ beta.Conclusion:Deletion mutation of HBx with truncation of 31 amino acids at the carboxy-terminal may alter protein expression in hepatoma cells. These proteins are closely related to tumor formation and metastasis, and therefore can become biomarkers for diagnostic and prognostic evaluation in liver cancer.

hepatocellular carcinoma; transfection; proteome

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.005

張志翔(1989-),男，碩士，助理研究員。

R735.7

2095-9664(2015)05-0020-04

2015-02-11)

研究方向：HBVSHCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究。