丁 曼，張岸梅，朱 波

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腫瘤科／全軍腫瘤診治研究所，重慶400037）

作為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，肺癌惡性程度高且預(yù)后差，是惡性腫瘤中致死的首要病因，對人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害［1］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，肺癌的早期診斷和綜合治療均有一定進(jìn)步，其臨床療效也有相對的改善，但多數(shù)患者在中晚期確診而不能進(jìn)行手術(shù)治療，且肺癌對放、化療有所抵抗，因此患者總體5年生存率低于15%［2］。腫瘤干細(xì)胞理論提出腫瘤源于腫瘤干細(xì)胞，這群細(xì)胞具有自我更新、多向分化和無限增殖的潛能，是腫瘤對放、化療抵抗，以及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源［3］。有研究表明，腫瘤干細(xì)胞可能作為一個新的靶點在臨床上來進(jìn)行治療。但是，腫瘤組織中的干細(xì)胞水平極少，因此分離并鑒定腫瘤干細(xì)胞能為后續(xù)研究工作提供一個良好的基礎(chǔ)。肺癌中同樣存在這樣一群干細(xì)胞，即肺癌干細(xì)胞。Ho等［4］在2007年采用側(cè)群細(xì)胞分選法有效分選出非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞，證實了肺癌干細(xì)胞的存在。目前已有多種肺癌細(xì)胞株已分選出具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，如H466、A549、H460等［5-7］。肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等均與肺癌干細(xì)胞相關(guān)，因此，能有效富集肺癌干細(xì)胞對肺癌的進(jìn)一步研究尤為重要。腫瘤干細(xì)胞的分離及鑒定中，通常選用細(xì)胞表面標(biāo)志物的方法。CD133是公認(rèn)的經(jīng)典腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，已在肺癌［8］、前列腺癌［9］、乳腺癌［10］、腦膠質(zhì)瘤［11］、結(jié)腸癌［12］等多 種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)。本研究采用無血清連續(xù)培養(yǎng)結(jié)合紫杉醇誘導(dǎo)干細(xì)胞的方法分離出干細(xì)胞，并用一系列腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物或相關(guān)標(biāo)志物鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1650購自美國典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC）；主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清（FBS）購自TBD 公司，0.25%胰酶、DMEM／F12 培養(yǎng)基購自HyClone公司，重組人胰島素購自Sigma公司，重組人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、重組人堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自PeproTech公司，牛血清清蛋白（BSA）購自Sigma公司；紫杉醇注射液購自山西普德藥業(yè)有限公司，CD133及CD326流式細(xì)胞儀抗體購自Miltenyi公司；CD133及CD326免疫熒光抗體購自Biorbyt公司，異硫氰酸熒光素（FITC）及3H-吲哚菁類染料Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗購自碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒購自Takara公司；Oct4抗體、Nanog抗體及Sox-2抗體均購自Abcam 公司，β-actin抗體購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H1650細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI1640，加入10%標(biāo)準(zhǔn)FBS、青霉素和鏈霉素。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。細(xì)胞球培養(yǎng)：取NCI-H1650細(xì)胞，去掉原培養(yǎng)液，胰酶（0.25%）消化后用原培養(yǎng)液終止消化，移入離心管離心（800 r／min，5min）后棄去上清液。加入含有重組人胰島素、EGF、bFGF、BSA 及DMEM／F12培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液種植在6孔板中（密度為20 000個／孔），每個孔4 mL培養(yǎng)液。2～3d后取上清液，離心后加入無血清培養(yǎng)液移入新培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞成球生長，6孔板中繼續(xù)加入無血清培養(yǎng)液，2～3d后再次取上清離心后移入培養(yǎng)瓶，并換液及傳代。成球生長細(xì)胞傳代2次后，按照1×106個／mL細(xì)胞加入0.2ng／mL的紫杉醇培養(yǎng)，24h后離心換液。紫杉醇刺激后細(xì)胞大量死亡，換液后每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，2～3d換液1次，直至細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)如加紫杉醇前。實驗取紫杉醇刺激后培養(yǎng)瓶中第5代細(xì)胞球。此過程細(xì)胞球均在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測 將不同代數(shù)的細(xì)胞球離心（1 000r／min，5min）后，調(diào)整其濃度至1×107／mL，在100μL細(xì)胞液中加入熒光素標(biāo)記的CD133抗體（鼠抗人）和CD326抗體（鼠抗人）各1μg，于室溫下放置30min后，用PBS離心并洗滌2次，再加入200μL PBS重懸細(xì)胞，即可上機(jī)檢測CD133及CD326的陽性率。

1.2.3 免疫熒光檢測 取第5 代細(xì)胞球，甩片離心（800r／min，5min），將細(xì)胞球甩片到玻片上，用冰凍的4%多聚甲醛固定20min，用PBS洗3次后使用5%BSA 封閉20min，將玻片甩干。加入兔抗人CD133一抗（1∶200）或者兔抗人CD326一抗（1∶200），置入4 ℃冰箱過夜孵育。次日，于冰箱中取出玻片，室溫下放置10min，用PBS洗3次后加入FITC 標(biāo)記或Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶500），在37 ℃避光孵育30 min。之后用PBS洗3次，避光下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色3min，PBS洗3次后用抗熒光淬滅封片劑封片，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.2.4 RT-PCR檢測 采取NCI-H1650細(xì)胞及細(xì)胞球使用Trizol法提取總RNA 后，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RTPCR 試劑盒說明操作。采用2-△△CT法進(jìn)行分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，見表1。

1.2.5 Western blot檢測 取NCI-H1650細(xì)胞及細(xì)胞球用蛋白裂解液提取蛋白，制備成蛋白樣品并用BCA 法檢測蛋白水平。進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），經(jīng)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF 膜用5%BSA 在室溫下封閉1h，再加入兔抗人Oct4抗體、Nanog抗體及Sox-2抗體（1∶200）、鼠抗人β-actin抗體（1∶1 000），放置于冰箱4 ℃過夜。次日用TBST 洗3次后加入對應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶1 000），在37 ℃水浴鍋中孵育30 min，再次用TBST 緩沖液（Tris-HCl緩沖鹽溶液＋吐溫溶液）洗3次后用顯影劑在凝膠成像儀中曝光并記錄成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料用±s表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 RT-PCR 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 NCI-H1650細(xì)胞及細(xì)胞球培養(yǎng)結(jié)果 NCI-H1650細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)下，在培養(yǎng)瓶底部呈梭形貼壁生長（圖1A）。而在連續(xù)的無血清培養(yǎng)下，有少部分細(xì)胞呈圓形懸浮生長，但細(xì)胞成球較小，細(xì)胞大小基本一致，折光性較好（圖1B）。經(jīng)紫杉醇刺激后多次傳代，懸浮生長的細(xì)胞逐漸增多，其細(xì)胞球體積也逐漸變大，第5次傳代后仍保持良好的克隆形成能力（圖1C、D）。表明紫杉醇刺激后連續(xù)無血清培養(yǎng)能成功誘導(dǎo)形成NCI-H1650細(xì)胞形成懸浮生長的細(xì)胞球。

2.2 免疫熒光結(jié)果 在激光共聚焦顯微鏡下可見，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜與FITC 標(biāo)記的CD133 的二抗結(jié)合呈綠色熒光，即CD133陽性；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜與Cy3標(biāo)記的CD326的二抗結(jié)合呈紅色熒光，即CD326陽性；細(xì)胞核用DAPI染色呈藍(lán)色。表明紫杉醇刺激后連續(xù)無血清培養(yǎng)能成功誘導(dǎo)形成NCIH1650干細(xì)胞，見圖2。

圖1 顯微鏡下觀察NCI-H1650細(xì)胞及細(xì)胞球生長情況

圖2 免疫熒光檢測NCI-H1650細(xì)胞球干細(xì)胞標(biāo)志（×1 200）

2.3 流式細(xì)胞結(jié)果 在NCI-H1650 細(xì)胞中，CD133＋和CD326＋雙陽性細(xì)胞率僅為1.69%（圖3A），而第5 次傳代后的細(xì)胞球中CD133＋和CD326＋雙陽性細(xì)胞率為93.20%（圖3B），高于有血清培養(yǎng)的NCI-H1650細(xì)胞。表明采用此種方法能成功誘導(dǎo)NCI-H1650干細(xì)胞。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞標(biāo)志

圖4 Oct-4、Nanog、Sox-2蛋白表達(dá)水平

2.4 Western blot 結(jié) 果 與NCI-H1650 細(xì) 胞 比 較，NCIH1650細(xì)胞球中Oct4、Nanog和Sox-2的蛋白高表達(dá)，二者光密度比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 RT-PCR 檢測結(jié)果 NCI-H1650細(xì)胞的Oct4、Nanog和Sox-2的基因表達(dá)水平均低于其細(xì)胞球表達(dá)水平，見圖5。

圖4 Oct-4、Nanog、Sox-2的mRNA 表達(dá)水平

3 討 論

隨著從不同腫瘤中分離得到腫瘤干細(xì)胞及鑒定的證據(jù)漸多，腫瘤干細(xì)胞的理論也得到了更多人的認(rèn)同。腫瘤組織由明顯異質(zhì)性的細(xì)胞群體構(gòu)成，其中的極少細(xì)胞具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性，即自我更新、增殖克隆、分化潛能、侵襲遷移、高致瘤性、耐藥性以及對放療抵抗性［13］。

目前，腫瘤干細(xì)胞主要根據(jù)其表面標(biāo)志物進(jìn)行分選和鑒定。CD133最初是作為人造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞的分子標(biāo)志物［14］，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CD133＋腫瘤細(xì)胞也具有自我更新等干細(xì)胞特性，因此也成為多種腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志物，包括肝癌、胰腺癌、卵巢癌等。CD326又稱上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM），其在肝癌、肺癌等腫瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)，也是目前公認(rèn)的肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物之一。因此，本研究采用這兩個分子標(biāo)志物鑒定誘導(dǎo)的NCI-H1650干細(xì)胞。現(xiàn)已有大量報道從肺癌組織中分離干細(xì)胞，然而該方法組織來源困難，分離技術(shù)難度高，且分選出的干細(xì)胞活性不足，限制了對肺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究。此外，還有大量報道用另一種肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行體外誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞。然而NCI-H1650來源于晚期肺腺癌患者，與A549 相比具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而且NCI-H1650是EGF 受體突變細(xì)胞株，誘導(dǎo)其干細(xì)胞具有重要的研究價值及臨床意義。

目前得到肺癌干細(xì)胞主要通過側(cè)群細(xì)胞分選法、磁珠分選法和無血清連續(xù)培養(yǎng)法，但以上方法分出細(xì)胞少、價格昂貴、分選出后不易存活。本實驗室曾用無血清連續(xù)培養(yǎng)的方法分離出卵巢癌細(xì)胞株A2780中的干細(xì)胞［15］，但應(yīng)用此種方法誘導(dǎo)NCI-H1650干細(xì)胞得到干細(xì)胞量少，加入紫杉醇后能明顯提高干細(xì)胞的富集。本研究采用連續(xù)無血清條件培養(yǎng)基結(jié)合藥物刺激的方法培養(yǎng)懸浮細(xì)胞球，從而富集肺癌干細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，NCI-H1650中存在極少一部分具有自我更新能力的細(xì)胞，經(jīng)過無血清連續(xù)培養(yǎng)后可懸浮生長成為腫瘤干細(xì)胞球，其具有形成連續(xù)克隆的能力。流式檢測發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞球高表達(dá)肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD326，同時免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球共表達(dá)CD133和CD326。為了進(jìn)一步驗證細(xì)胞球的干細(xì)胞特性，本研究采用RT-PCR及Western blot檢測了干性標(biāo)志物Oct4、Sox2 及Nanog的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球中這3種分子的表達(dá)高于有血清貼壁培養(yǎng)的NCI-H1650細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明使用藥物聯(lián)合無血清培養(yǎng)的方法成功誘導(dǎo)了NCI-H1650肺癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞已成為腫瘤方面的研究熱點，其分離和鑒定對基礎(chǔ)及臨床研究均具有重要意義。本研究采用無血清聯(lián)合藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，成功誘導(dǎo)出肺癌干細(xì)胞，為后續(xù)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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