周功銳，包曉航，毛慶祥，龍宗泓，景 勝，黃 靜，楊天德

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院麻醉科，重慶400037）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種慢性疼痛綜合征，臨床上以自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏以及疼痛異常為特征。由于其發(fā)病機制復(fù)雜，尚無特別有效的治療手段，近年來越來越成為疼痛領(lǐng)域研究的熱點。而星形膠質(zhì)細胞被認為是NP激活的重要靶點，探索其分子機制有可能為臨床疼痛治療提供新的思路。pannexin（PX）通道蛋白是一類縫隙連接蛋白（gap junction，GJ），目前發(fā)現(xiàn)存在3種亞型，PX1、PX2、PX3，以PX1表達最多，廣泛存在于全身大部分組織，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達。它能連接兩個相鄰細胞，也能形成半通道與細胞外液想通，能夠?qū)崿F(xiàn)離子及小分子物質(zhì)在細胞和組織液間的快速交換。有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞上PX 半通道能夠通過控制ATP的釋放和調(diào)節(jié)鈣離子的內(nèi)流，影響星形膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)［1］。本研究旨在通過建立坐骨神經(jīng)分支選擇性結(jié)扎模型（spared nerve injury，SNI），觀察大鼠脊髓上PX1蛋白的表達變化以及通過鞘內(nèi)注射GJ阻斷劑甘珀酸（carbenoxolone，CBX），分析其與星形膠質(zhì)細胞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑和儀器：PX1 兔多克隆抗體（美國，Sigma）；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔多克隆抗體（北京，中杉金橋）；生物素抗兔二抗（美國，Vector）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（北京，中杉金橋）；CM1900冰凍切片機及激光掃描顯微鏡（德國，Leica）；組織蛋白裂解試劑盒（上海，貝博）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（武漢，博士德）；3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液試劑盒（北京，中杉金橋）；CBX 試劑（美國，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 健康SD 雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～200g，由新橋醫(yī)院動物實驗中心提供。將50只大鼠分為3組：對照組（WT 組，n＝10）、假手術(shù)組（sham 組，n＝10）、SNI組（n＝30）。SNI組：按Decosterd等［2］的方法建立動物模型。大鼠麻醉（2%戊巴比妥鈉50 mg／kg，腹腔注射）后取俯臥位，備皮，消毒后切開大鼠右側(cè)大腿后外側(cè)，暴露坐骨神經(jīng)及其分支，遠端結(jié)扎并剪斷腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，最后逐層縫合肌肉和皮膚。sham 組：大鼠行假手術(shù)，在暴露分離坐骨神經(jīng)后，不作任何處理，直接縫合肌肉和皮膚。WT 組：大鼠不作任何處理。整個手術(shù)過程注意動作輕柔，避免牽拉和損傷腓腸神經(jīng)，術(shù)后均肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后于動物房室溫，單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 Western blot法測定脊髓PX1 蛋白表達 SNI組20只大鼠，分別于術(shù)后3、5、7、14d（5 只／每個時段）麻醉后處死，分別取其L4～6段脊髓組織；sham、WT 組各5 只大鼠于術(shù)后14d麻醉后處死，分別取其L4～6段脊髓組織，加入裂解液冰上勻漿，10 000r／min 離心5 min 后取上清液，核酸濃度儀（Thermo公司）測定蛋白濃度，調(diào)定濃度為4μg／uL，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸5min。等量蛋白樣品經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，PX1一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，隔日加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1h，ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色。Quantity One軟件分析結(jié)果。

1.2.3 大鼠鞘內(nèi)模型制備 選取SNI組10 只大鼠于建立SNI模型前進行鞘內(nèi)模型制備，方法參照文獻［3］。大鼠麻醉（2%戊巴比妥鈉50mg／kg，腹腔注射）后取俯臥位，L4～6處切開皮膚，鈍性分離脊柱兩側(cè)肌肉，暴露L4～5椎板，剪去部分L5棘突，用5mL注射器針頭刺破黃韌帶同時見清亮液體流出，遂將拉細的硬膜外導(dǎo)管沿相同路徑置入，見大鼠甩尾即置管成功。固定導(dǎo)管，逐層縫合傷口，封閉導(dǎo)管外口。術(shù)后第3天導(dǎo)管注入1%利多卡因10μL，有下肢麻痹癥狀的大鼠再按前述方法制備SNI模型。10只大鼠在SNI術(shù)后7d分成兩組，5只鞘內(nèi)注射20μL生理鹽水（SNI＋NS組），另外5只注射20μL 0.5g／L CBX 溶液（SNI＋CBX 組）［4］。

1.2.4 GFAP免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后7d取WT（n＝5）、sham（n＝5）、SNI＋NS（n＝5），SNI＋CBX（n＝5）4組大鼠，麻醉（2%戊巴比妥鈉60 mg／kg，腹腔注射）后剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針并固定，同時剪開右心耳。首先用0.01 mol PBS液灌注約200mL至肝臟變白后再用4 ℃的4%多聚甲醛灌注約300 mL。小心取出大鼠脊髓組織L4～6段，放置4%多聚甲醛中4 ℃過夜，再放于30%蔗糖溶液中脫水至組織沉底。取出標(biāo)本，用冰凍切片包埋劑（北京，中山金橋）包埋，制作冰凍冠狀切片（厚度40μm），各標(biāo)本分別取5 張切片染色。切片經(jīng)3%H2O2洗脫、Triton X-100 打孔，牛血清封閉后，加GFAP多克隆抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜；隔日0.01 mol PBS漂洗后，加入生物素二抗（1∶200）37 ℃孵育2h，再加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）三抗37 ℃孵育1h，最后滴加DAB液經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后顯色，封片劑封片。每張切片在顯微鏡下觀察，計算每張切片傷側(cè)脊髓背角每平方毫米GFAP表達數(shù)目，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)比較用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠脊髓PX1 蛋白表達 與WT、sham 組比較，SNI組術(shù)后3dPX1蛋白表達開始升高，術(shù)后5、7d一直持續(xù)高表達，至14d趨于穩(wěn)定，仍高于WT、sham 組（P＜0.05）。SNI組術(shù)后3、5、7、14d表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。WT、sham 組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓PX1蛋白表達

圖2 術(shù)后7d各組大鼠脊髓背角GFAP免疫組化圖像

2.2 各組大鼠脊髓背角GFAP表達 術(shù)后7dSNI組大鼠脊髓傷側(cè)背角GFAP表達較WT、sham 組明顯增強（P＜0.05），SNI＋CBX 組較SNI＋NS組的脊髓背角GFAP表達下調(diào)（P＜0.05），但仍高于WT、sham 組（P＜0.05）。sham、WT 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖3 術(shù)后7d各組大鼠脊髓背角GFAP表達比較

3 討 論

近年來，隨著對疼痛研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)脊髓內(nèi)的膠質(zhì)細胞在病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。在坐骨神經(jīng)慢性壓迫型模型（CCI）、部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎傷模型（PSNL）、L5脊神經(jīng)冷凍模型中均觀察到脊髓星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活的反應(yīng)。多種疼痛相關(guān)物質(zhì)可以引起膠質(zhì)細胞的活化?？s膽囊素和緩激肽可以與星形膠質(zhì)細胞上的受體結(jié)合，激活胞內(nèi)由Ca2＋介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］?；罨哪z質(zhì)細胞可以通過釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)ROS、NO、EAAs、ATP等，直接影響神經(jīng)元的可塑性，使病理性疼痛進一步發(fā)展和持續(xù)［6］。作為神經(jīng)免疫細胞，又可以通過合成和釋放多種炎性細胞介質(zhì)如白細胞介素、TNF-α產(chǎn)生致痛作用［5］。而阻斷脊髓膠質(zhì)細胞活化則可以抑制或減輕痛敏反應(yīng)［7］。越來越多的研究表明，調(diào)控星形膠質(zhì)細胞已經(jīng)成為疼痛研究的一個重要方向。

GJ是連接兩個相鄰細胞的大通道，能夠?qū)崿F(xiàn)離子及小分子物質(zhì)在細胞間的快速交換，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達。之前的研究表明這些細胞間的縫隙連接通道均由縫隙連接蛋白Connexin（CX）構(gòu)成，不同于CX 蛋白形成細胞間連接，新發(fā)現(xiàn)的PX 作為GJ中的一類新蛋白，主要是以半通道單體的形式存在，調(diào)節(jié)ATP、Ca2＋等分子直接與細胞外液間的交換［8-9］。其作為細胞信息與外界交換的一種補充，極大地豐富了神經(jīng)細胞間信息的交換和整合。本研究通過分支選擇性結(jié)扎坐骨神經(jīng)建立NP模型，研究PX1在脊髓中的表達變化。通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)后3、5、7、14d大鼠脊髓PX1表達量較WT、sham 組明顯上調(diào)（P＜0.05）。在術(shù)后5～7d，其表達量達到一個峰值，隨后逐漸下降，在14d時趨于平穩(wěn)。SNI組表達量的明顯增高，提示PX1 可能參與了疼痛的激活和調(diào)控。CBX作為目前惟一相對特異非選擇性的GJ阻斷劑，有研究已經(jīng)證實其可以阻斷縫隙連接通道，導(dǎo)致離子或其他分子交換減少甚至停止。GFAP作為星形膠質(zhì)細胞的特異性標(biāo)志物，已經(jīng)得到大量研究證實。本研究免疫組化中發(fā)現(xiàn)，SNI組與其他兩組比較，脊髓背角中GFAP 陽性細胞個數(shù)明顯增多（P＜0.05）。在術(shù)后7d進行鞘內(nèi)注射CBX 后，GFAP 陽性細胞個數(shù)較未注射的SNI組有明顯的下降（P＜0.05）。由此，可以推測PX1這類GJ可能與星形膠質(zhì)細胞的表達激活有關(guān)。

以前的研究大量集中在CX 上，但是近年來，自從其同源蛋白PX 在2004年被克隆出來后，又成為研究的熱點。PX1蛋白參與了很多重要的病理生理過程。PX1參與了機體免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，巨噬細胞可能由PX1 通道介導(dǎo)IL-1β 釋放［10-11］；紅細胞膜上PX1半通道可介導(dǎo)ATP釋放從而對局部血流進行調(diào)節(jié)［12］；PX1 還能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的正常增殖［13］。由于PX 不同于CX 組成的六聚體細胞間通道，只能形成三聚體的半通道。它的功能和CX 相比較類似但又不完全一樣，而這二者誰在疼痛信號的傳遞上起著更為重要的作用，需進一步探究［14］。由于CBX 是非選擇性的GJ阻斷劑，在二者的功能研究上很難以進行區(qū)分和鑒別。尋找更好、更特異的GJ阻斷劑，能分別阻斷兩種同源蛋白通道，將為下一步研究提供更好的幫助，同時為疼痛藥物的研發(fā)提供方向。

綜上所述，縫隙連接蛋白PX1確實在NP 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。至于PX1半通道如何調(diào)控星形膠質(zhì)細胞，如何進一步整合和傳遞膠質(zhì)細胞間的信息，還有待進一步的研究。

［1］ Bennett MV，Garre JM，Orellana JA，et al.Connexin and pannexin hemichannels in inflammatory responses of glia and neurons［J］.Brain Res，2012（1487）：3-15.

［2］ Decosterd I，Woolf CJ.Spared nerve injury：an animal model of persistent peripheral neuropathic pain［J］.Pain，2000，87（2）：149-158.

［3］ Mata M，Shuang LH.Applications of Gene Therapy to the Treatment of Chronic Pain［J］.Curr Gene Ther，2008，8（1）：42-48.

［4］ Yoon SY，Robinson CR，Zhang H，et al.Spinal astrocyte gap junctions contribute to oxaliplatin-induced mechanical hypersensitivity［J］.J Pain，2013，14（2）：205-214.

［5］ Ji RR，Berta T，Nedergaard M.Glia and pain：is chronic pain a gliopathy？［J］.Pain，2013，154Suppl 1：10-28.

［6］ Mika J，Zychowska M，Popiolek-Barczyk K，et al.Importance of glial activation in neuropathic pain［J］.Eur J Pharmacol，2013，716（1／2／3）：106-119.

［7］ Obata H，Sakurazawa S，Kimura M，et al.Activation of astrocytes in the spinal cord contributes to the development of bilateral allodynia after peripheral nerve injury in rats［J］.Brain Res，2010（1363）：72-80.

［8］ Garre JM，Retamal MA，Cassina P，et al.FGF-1induces ATP release from spinal astrocytes in culture and opens pannexin and connexin hemichannels［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（52）：22659-22664.

［9］ Houtao L，Abduqodir HT.Maxi-anion channel as a candidate pathway for osmosensitive ATP release from mouse astrocytes in primary culture［J］.Cell Res，2008，18（3）：558-565.

［10］ Kanneganti TD，Lamkanfi M，Kim YG，et al.Pannexin-1-mediated recognition of bacterial molecules activates the cryopyrin inflammasome independent of Tolllike receptor signaling［J］.Immunity，2007，26（4）：433-443.

［11］ Eugenin EA.Role of connexin／pannexin containing channels in infectious diseases［J］.FEBS Lett，2014，588（8）：1389-1395.

［12］ Locovei S，Bao L，Dahl G.Pannexin 1in erythrocytes：function without a gap［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（20）：7655-7659.

［13］ Lai CP，Bechberger JF，Thompson RJ，et al.Tumor-suppressive effects of pannexin 1in C6glioma cells［J］.Cancer Res，2007，67（4）：1545-1554.

［14］ Iglesias R，Dahl G，Qiu F，et al.Pannexin 1：the molecular substrate of astrocyte“hemichannels”［J］.J Neurosci，2009，29（21）：7092-7097.