付聰敏，王 燁，王迎寒，劉玉玲，張曉峰，東岫巖，郭洪杰

（1.承德護理職業(yè)學(xué)院涉外護理系；2.河北省重要研究與開發(fā)重點實驗室；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬肛腸醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，河北承德067000）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腹痛、腹部不適，并伴有排便習(xí)慣和（或）大便性狀異常為主要臨床表現(xiàn)的慢性腸功能紊亂性疾病，在中國以腹瀉型IBS（DIBS）較多見。由于本病反復(fù)發(fā)作或慢性遷延，對患者學(xué)習(xí)、工作和生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟壓力和思想負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，IBS患病率為15%～22%，每年約有500萬人因此病而就診，年消耗醫(yī)療費80億美元［1］。國內(nèi)學(xué)者調(diào)查顯示，廣州市居民IBS的患病率為5.6%，普通內(nèi)科門診及消化?？崎T診中IBS 所占比例分別為10.1%、34.3%［2］。且國內(nèi)患病率呈逐年上升趨勢，已引起廣泛重視。迄今為止，IBS的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其病因主要與遺傳因素、食物、炎癥及精神心理因素有關(guān)，其發(fā)病機制主要與內(nèi)臟高敏感、腸道動力異常、腦-腸軸、腦-腸肽等有關(guān)。治療方面，目前尚無特效療法，主要采用對癥治療［3-5］，但易反復(fù)，遠(yuǎn)期效果不理想。近年來，中醫(yī)藥在D-IBS的治療上積累了豐富的經(jīng)驗。本實驗通過探討健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠模型降鈣素基因相關(guān)肽（calcilonin gene-related peptide，CGRP）表達(dá)的影響，為該藥物的臨床應(yīng)用提供理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：Wistar大鼠60只，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量（170±20）g，動物合格證編號：SCXK（冀）2014-0004，由河北省實驗動物中心提供。60只大鼠分成6籠，雌雄分籠，常規(guī)飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后進(jìn)入實驗階段。實驗藥物：（1）造模用藥，番瀉葉（批號為20140420）購自安國市京興藥業(yè)有限責(zé)任公司，濃煎成生藥0.6g／mL 的藥液。（2）治療用藥，陽性對照組用匹維溴銨片（得舒特），50 mg，法國蘇威制藥公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為624065，碾碎后用蒸餾水配制成3.0 mg／mL的藥液。（3）健脾化濕顆粒，由炙黃芪、茯苓、砂仁、益智仁、炒白芍等10味組成，按比例采用現(xiàn)代制劑工藝制成。實驗試劑：CGRP免疫組化試劑盒（規(guī)格為0.1mL，批號為20140716），購自德國博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及建模 將60只大鼠分成對照組（n＝10）和造模組（n＝50），再將造模組大鼠分為5組：模型組、陽性對照組及健脾化濕顆粒低、中、高劑量組（低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組），每組10只。每組大鼠雌雄各半，雌雄分籠。建立D-IBS大鼠模型：采用喬氏造模法建立D-IBS大鼠模型［6］。實驗前10h禁食，自由飲水。造模組大鼠于上午8：00分別給予番瀉葉煎劑（生藥0.6g／mL）灌胃，灌胃劑量按10 mL／kg計算，在灌服完番瀉葉煎劑后1h，用粗制棉繩束縛大鼠的后兩肢，使之行動不便，煩躁不安，造成一定的應(yīng)激刺激，每次持續(xù)2h，每日1次，連續(xù)2周。對照組大鼠全程只給予生理鹽水灌胃（10mL／kg）。以稀便級判斷造模是否成功。

1.2.2 給藥方法 對照組大鼠不施加任何處理因素；其他各組于每天上午8：00用藥，每天1次，連續(xù)2周。模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，陽性對照組大鼠給予得舒特溶液（3.0 mg／mL）灌胃，高、中、低劑量治療組大鼠分別給予健脾化濕顆粒藥液4.0、2.5、1.5g／mL灌胃，灌胃劑量均按10mL／kg計算。

1.2.3 標(biāo)本采集和處理 治療2周后停止用藥，用代謝籠測每組大鼠稀便級。禁食、禁水12h后，各組大鼠均以4%水合氯醛麻醉（0.5mL／100g），沿腹腔矢狀線切開后，沿腸系膜剪開，留取小腸組織1段（長度為1.0cm），以生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物后，將標(biāo)本放于10%中性甲醛的小瓶內(nèi)固定24h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.2.4 觀察指標(biāo) 稀便級：Ⅰ級為糞便濾紙范圍直徑小于1.0 cm；Ⅱ級為糞便濾紙范圍直徑1.0～＜2.0cm；Ⅲ級為糞便濾紙范圍直徑2.0～3.0cm；Ⅳ級為糞便濾紙范圍直徑大于3.0 cm。糞便濾紙范圍為橢圓形者，按其長徑計算。

1.2.5 采用免疫組化法檢測CGRP 水平 嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行檢測。使用醫(yī)學(xué)圖像定量分析軟件分析小腸黏膜中CGRP陽性面積，每組大鼠隨機選取6張切片，每張切片隨機分析5個視野。于400倍視野下攝取切片圖像，隨機選定攝取圖像的黏膜層、黏膜下層，全視野測量，得出免疫組化圖像中CGRP陽性面積。光鏡下見細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色者即為CGRP陽性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠稀便級比較 藥物治療前1d：造模組大鼠稀便級數(shù)明顯增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示D-IBS造模成功。藥物治療2周后：各治療組大鼠稀便級數(shù)明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠治療前后稀便級比較（±s，n＝10，cm）

表1 各組大鼠治療前后稀便級比較（±s，n＝10，cm）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與模型組比較。

組別 治療前1d 治療2周后對照組0.11±0.09 0.14±0.11模型組 3.47±0.12a 4.41±0.20a陽性對照組 3.61±0.21a 2.82±0.18ab低劑量治療組 3.51±0.19a 3.42±0.16ab中劑量治療組 3.37±0.20a 2.78±0.14ab高劑量治療組 3.36±0.18a 1.81±0.15 ab

圖1 各組大鼠小腸黏膜CGRP陽性表達(dá)情況（×400）

2.2 各組大鼠小腸黏膜CGRP 表達(dá)比較 與對照組大鼠小腸黏膜CGRP陽性面積（0.043 17±0.002 78）比較，模型組降低（0.019 17±0.003 63，P＜0.01）；與模型組比較，各治療組CGRP陽性面積增高（P＜0.05）；與陽性對照組（0.038 52±0.002 37）比較，健脾化濕顆粒低、中劑量治療組CGRP陽性面積降低（0.0231 67±0.002 86、0.033 33±0.002 80，P＜0.05），而與健脾化濕顆粒高劑量治療組（0.037 18±0.001 41）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

3 討 論

健脾化濕顆粒源于上海市名中醫(yī)馬貴同教授經(jīng)驗方，該藥以前采用中藥傳統(tǒng)劑型-湯劑，臨床應(yīng)用多年，對D-IBS患者有很好的療效?，F(xiàn)經(jīng)水低溫動態(tài)提取、冰凍濃縮和干法制粒等方法制成顆粒劑，是古方與現(xiàn)代提取工藝、制劑工藝和藥理研究方法相結(jié)合的產(chǎn)物［7］。經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn)，低溫動態(tài)提取、冰凍濃縮的過程對中藥藥效的影響不大，與健脾化濕湯無差異［8］。且在治療D-IBS的實驗研究上取得了一定的成果［9］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦-腸互動在D-IBS發(fā)病機制中的作用日益被認(rèn)識［10］。CGRP 是一種含有37 個氨基酸殘基的腦腸肽，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，特別是感覺神經(jīng)元胞體和末梢以及胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)叢，具有調(diào)節(jié)胃腸血流、胃腸分泌及運動功能。有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，IBS模型大鼠血漿及結(jié)腸黏膜CGRP水平下降，提示CGRP 與IBS發(fā)病有關(guān)［11］。由于CGRP水平下降，導(dǎo)致胃腸道平滑肌收縮作用增強，血管舒張抑制，進(jìn)而腸道血流量減少，溫煦腸壁作用下降，這可能是IBS模型大鼠腹痛、腹瀉的主要原因之一。牛慶慧等［12］研究發(fā)現(xiàn)，D-IBS患者回盲部和乙狀結(jié)腸部位的腸黏膜CGRP 陽性神經(jīng)肽纖維強度較對照組高，而IBS其他分型與對照組無明顯差異。有研究發(fā)現(xiàn)，CGRP與神經(jīng)類物質(zhì)共同作用致老鼠腸道敏感性增高［13］，提示CGRP 可能參與了IBS 的病理生理過程。Kaur等［14］發(fā)現(xiàn)CGRP在生理情況下并不發(fā)揮作用，只在受到刺激或疾病狀態(tài)下釋放增多。吳皓萌等［15］發(fā)現(xiàn)CGRP 與DIBS的肝郁脾虛證、脾胃虛弱證呈正相關(guān)。CGRP 是促炎癥性感覺性神經(jīng)肽，可引起結(jié)腸動脈的舒張，加快結(jié)腸的蠕動，導(dǎo)致腹痛、腸鳴、腹瀉。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠小腸黏膜CGRP水平顯著下降，而各治療組大鼠血清CGRP 明顯升高，其中以健脾化濕顆粒高劑量組最明顯，提示CGRP 參與了DIBS的病理生理過程。

健脾化濕顆粒對D-IBS有很好的治療作用，高劑量組優(yōu)于中、低劑量組，其作用機制可能是通過提高局部腸組織中CGRP水平而達(dá)到治療目的。

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