龔玉梅，張培君*，朱文革，賀云霞，王宏俊，張 瑜， 邵慶紅

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.北京信得威特科技有限公司，北京順義 101302)

雞傳染性鼻炎(三價(jià))和新城疫二聯(lián)滅活疫苗的研究

龔玉梅1，張培君1*，朱文革2，賀云霞1，王宏俊1，張 瑜2， 邵慶紅2

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.北京信得威特科技有限公司，北京順義 101302)

利用Page A型、B型、C型副雞禽桿菌和新城疫病毒La Sota株，研制雞傳染性鼻炎(三價(jià))和新城疫二聯(lián)油乳劑滅活疫苗。用3個(gè)批次疫苗進(jìn)行單劑量(0.5 mL/次)3次接種和大劑量(2.0 mL)單次接種的安全性試驗(yàn)、SPF雞的免疫效力試驗(yàn)、商品雞的免疫持續(xù)期試驗(yàn)和疫苗的保存期試驗(yàn)。結(jié)果表明，3批疫苗對(duì)試驗(yàn)雞安全無副作用；免疫接種SPF雞只30 d后對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥80%,用20 μL/只疫苗免疫接種SPF雞21 d后新城疫的平均HI抗體>24；商品雞42日齡首免，110日齡二免，二免后9個(gè)月對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥70%，對(duì)新城疫病毒強(qiáng)毒100%保護(hù)；用4 ℃～8 ℃保存12個(gè)月和15個(gè)月的3批疫苗進(jìn)行了SPF雞的近期免疫效力試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌攻毒的保護(hù)率≥70%，用20 μL/只疫苗免疫SPF雞，免疫接種后21 d新城疫病毒的平均HI抗體>24，對(duì)新城疫病毒強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率>70%。說明研制的疫苗安全有效。

雞傳染性鼻炎;新城疫;三價(jià);二聯(lián);滅活疫苗

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza，IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Avpg)引起的上呼吸道傳染病[1-2]，副雞禽桿菌在2005年以前稱為副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)，主要影響蛋雞的產(chǎn)蛋和肉雞的肉質(zhì)[2]。本病世界各國(guó)均有發(fā)生，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失[2]。美國(guó)加利福尼亞一個(gè)蛋雞場(chǎng)暴發(fā)雞傳染性鼻炎，沒有檢測(cè)到其他病原體的混合感染，導(dǎo)致病死率升高至48%，并且在3個(gè)星期之內(nèi)產(chǎn)蛋率從75%下降至15.7%[2]。按照Page的分型方案，副雞禽桿菌可以分為A、B和C 3個(gè)血清型，血清型之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)[2]。1986年以來，我國(guó)已先后報(bào)道了A、B和C 3個(gè)血清型副雞禽桿菌所致的雞傳染性鼻炎[3-12]。2012年12月，北京、安徽和山東等地又較大規(guī)模暴發(fā)雞傳染性鼻炎，其病原經(jīng)細(xì)菌分離鑒定為B型副雞禽桿菌[11-12]。雞新城疫是可以導(dǎo)致雞只高發(fā)病率和高病死率的病毒性疫病[2]。雞傳染性鼻炎有時(shí)與新城疫混合感染，使病情加重，死淘率增加。

為有效防控雞傳染性鼻炎和新城疫，減少獸醫(yī)人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，參考本實(shí)驗(yàn)室雞傳染性鼻炎(A+C型)-新城疫二聯(lián)油佐劑滅活疫苗、雞傳染性鼻炎三價(jià)(A+B+C型)油乳劑滅活疫苗的研究方法和制作工藝，研制了3批雞傳染性鼻炎三價(jià)和新城疫

二聯(lián)滅活疫苗，現(xiàn)將這3個(gè)批次疫苗的安全性試驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、保存期試驗(yàn)和免疫持續(xù)期試驗(yàn)報(bào)道如下[13-17]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和毒株 副雞禽桿菌 B型菌為北京株由由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；A型菌為C-Apg-8(CVCC254株)、C型菌為Apg-668株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，3個(gè)菌株均保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所；新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)、雞新城疫病毒北京株(CVCC AV1611)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保存在北京信得威特科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 雞血清雞肉湯、雞血清雞肉湯瓊脂、半合成培養(yǎng)基等，均參照馮文達(dá)等的配方[15-16]，并添加適量的輔酶Ⅰ(NADH)。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 SPF種蛋、21日齡、28日齡和42日齡SPF雞為北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 試劑 司本-80、吐溫-80為上海申宇醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品；硬脂酸鋁為上海遠(yuǎn)航試劑廠產(chǎn)品；白油(Marcol-52)為法國(guó)SEPPIC 公司產(chǎn)品。

1.1.5 濃縮機(jī) 圣萬泉移動(dòng)式超濾濃縮機(jī)(膜包型)10萬分子量。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

1.2.1.1 副雞禽桿菌抗原 ①一級(jí)種子培養(yǎng)。將上述3個(gè)菌株分別接種雞血清雞肉湯瓊脂平皿，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)16 h～18 h，挑取典型菌落分別接種半合成培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h～24 h，純檢和無菌檢驗(yàn)，保存于-80 ℃?zhèn)溆?；②制苗用抗原。將純檢和無菌檢驗(yàn)合格的3個(gè)血清型一級(jí)種子，按照3%比例分別接種半合成培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h～24 h，純檢和無菌檢驗(yàn)，加入2.5 mL/L的福爾馬林滅活，純檢和無菌檢驗(yàn)合格的菌液離心至所需濃度置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 新城疫病毒抗原制備 將La Sota種毒做適當(dāng)稀釋后接種10 d～11 d SPF雞胚，繼續(xù)孵化96 h～120 h，無菌收獲尿囊液，取HA價(jià)≥640的尿囊液用超濾濃縮機(jī)作2倍濃縮，加入2.5 mL/L的福爾馬林滅活備用。

1.2.2 制苗 將2倍濃縮的NDV和所需濃度的副雞禽桿菌抗原(含3個(gè)血清型)按照2∶3混合，再與油乳劑按照1∶1制備成疫苗，此疫苗含A型菌6.0×108CFU/mL，B型菌1.0×109CFU/mL，C型菌8.0×108CFU/mL。按照此方法制備三批疫苗，其批號(hào)為201101、201102和201103。

1.2.3 安全性試驗(yàn) 21日齡SPF雞70只，飼養(yǎng)在SPF雞隔離器內(nèi)，隨機(jī)等量分成7組，第1組～第3組為大劑量注射組，分別注射上述3批疫苗，每只雞注射疫苗2.0 mL；第4組～第6組為單劑量3次注射組，分別注射上述3批疫苗，每只雞注射0.5 mL，3 d后進(jìn)行第2次注射，再3 d后進(jìn)行第3次注射；第7組為非接種對(duì)照組。所有雞只于第4組～第6組第3次注射后再觀察14 d。觀察接種雞的飲水、采食和排糞等情況。大劑量注射組和單劑量3次注射組各取1組雞只與非免疫對(duì)照組一道每2 d稱重1次[15-17]。

1.2.4 效力試驗(yàn)

1.2.4.1 雞傳染性鼻炎部分 將42日齡SPF雞120只隨機(jī)分成4組，3個(gè)免疫組用上述3批疫苗免疫，每只雞胸部肌肉注射0.5 mL，第4組為非免疫對(duì)照，同條件飼養(yǎng)。免疫后30 d每組取10只雞用A、B、C型副雞禽桿菌攻毒，攻毒后觀察7 d[15-17]。

1.2.4.2 雞新城疫部分 35只28日齡SPF雞，上述3批疫苗每批疫苗各胸部肌肉隨機(jī)注射10只雞，每只雞20 μL，另5只作非免疫對(duì)照。接種21 d后，每只雞分別采血分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定，所有雞只各肌肉注射雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCC AV1611)0.5 mL(含105.0ELD50)，觀察14 d[18]。

1.2.5 免疫持續(xù)期 280只42日齡商品羅曼蛋雞為大興區(qū)種雞場(chǎng)產(chǎn)品，無雞傳染性鼻炎病史，簡(jiǎn)稱試驗(yàn)雞，其中260只隨機(jī)分成4組，用前述3批疫苗各免疫65只雞，每只雞胸部肌肉接種疫苗0.5 mL。第4組接種禽流感(H9亞型)-新城疫二聯(lián)滅活疫苗(由本所姜北宇研究員惠贈(zèng))，每只雞胸部肌肉接種疫苗0.5 mL。另外20只相同日齡的雞只留作新城疫非免疫對(duì)照。第1次免疫后68 d(108日齡)每組隨機(jī)抽樣10只雞，加新城疫非免疫對(duì)照雞，采血測(cè)定新城疫HI效價(jià)；同時(shí)第1組～第3組195只雞用上述3批疫苗進(jìn)行第2次免疫，每只雞胸部肌肉接種疫苗0.5 mL，第4組65只雞接種禽流感(H9亞型)-新城疫二聯(lián)滅活疫苗，每只雞胸部肌肉接種疫苗0.5 mL。第2次免疫后3、6、9個(gè)月，每組隨機(jī)抽樣10只雞，加新城疫非免疫對(duì)照雞，采血測(cè)定新城疫HI效價(jià)。二免后6個(gè)和9個(gè)月，4個(gè)免疫組每組隨機(jī)抽取30只雞用A、B、C型副雞禽桿菌攻毒[15-17]，觀察7 d；觀察結(jié)束的當(dāng)日，4個(gè)免疫組各隨機(jī)取10只雞，新城疫非免疫對(duì)照組取5只雞，各肌肉注射雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCC AV1611)0.5 mL(含105.0ELD50)，攻毒后觀察14 d[18]。

1.2.6 疫苗保存期試驗(yàn) 上述3批疫苗保存在4 ℃～8 ℃，保存12個(gè)和15個(gè)月時(shí)，按照1.2.4.1和1.2.4.2進(jìn)行雞傳染性鼻炎和新城疫病毒的效力檢驗(yàn)[15-17]。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗(yàn)

所有70只雞在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)均健康存活。詳細(xì)結(jié)果見表1和表2。日增重試驗(yàn)(共計(jì)12 d)，3組雞只的日平均增重為：大劑量免疫組14 g，單劑量3次免疫組12.4 g，非免疫對(duì)照組14.55 g。盡管單劑量3次注射組平均日增重比非免疫對(duì)照組少2.15 g，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,3組日增重差異不顯著(P>0.05)。

表1 大劑量接種組Table 1 High dose inoculated groups

表2 單劑量3次接種組Table 2 Single dose inoculation for 3 times groups

2.2 效力試驗(yàn)

2.2.1 雞傳染性鼻炎部分 免疫后30 d，4組雞只每組分別取10只攻擊A、B、C型副雞禽桿菌，攻毒劑量為A型5.0×105CFU/0.2 mL/只雞，B型2.0×105CFU/0.2 mL/只雞，C型5.0×105CFU/0.2 mL/只雞，攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射。攻毒后觀察7 d，觀察雞只的精神狀態(tài)、飲水和采食情況等[9-11]。詳細(xì)結(jié)果見表3。

表3 IC(三價(jià))-ND二聯(lián)滅活疫苗SPF雞近期效力試驗(yàn)Table 3 The potence test of IC-ND vaccine in SPF chickens

2.2.2 新城疫部分 3批疫苗免疫雞只(20 μL/只)的ND HI平均效價(jià)分別為5.5、4.1、4.2、5只非免疫對(duì)照雞只的ND HI平均效價(jià)為0.6；對(duì)ND強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率分別為10/10、8/10、9/10，非免疫對(duì)照組為0/5。

2.3 試驗(yàn)雞(羅曼蛋雞)二免持續(xù)期試驗(yàn)

2.3.1 ND的HI效價(jià) 二免的當(dāng)天，二免后90、180、270 d，各組隨機(jī)采集的10只雞血清，按照國(guó)標(biāo)16550-1996新城疫檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范測(cè)定HI效價(jià)(表4)。

表4 二免當(dāng)天和二免后90、180、270 d NDV HI效價(jià)Table 4 HI Titers of NDV at 0, 90, 180 and 270 days for second vaccination

2.3.2 試驗(yàn)雞(羅曼蛋雞)二免后180 d和270 d攻毒結(jié)果 第2次免疫接種后180 d和270 d，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取30只雞用副雞禽桿菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒劑量為A型5.0×105CFU/0.2 mL/只雞，B型2.0×105CFU/0.2 mL/只雞，C型5.0×105CFU/0.2 mL/只雞，攻毒部位為眶下竇內(nèi)注射。攻毒后觀察7 d，觀察雞只的精神狀態(tài)、飲水和采食情況等[9-11]。副雞禽桿菌攻毒觀察結(jié)束的當(dāng)天，每組隨機(jī)取10只雞+ND非免疫對(duì)照組5只雞，用新城疫病毒北京株(CVCC1611)攻毒，劑量為每只雞肌肉注射0.5 mL(含105.0ELD50) (表5和表6)[12]。

表5 試驗(yàn)雞二免后180 d攻毒結(jié)果Table 5 Challenged test results 180 days after second immunized in conventional chickens

表6 試驗(yàn)雞二免后270 d攻毒結(jié)果Table 6 Challenged test results 270 days after second immunized in conventional chickens

2.4 疫苗保存期試驗(yàn)

2.4.1 疫苗保存12個(gè)月的試驗(yàn)結(jié)果 4 ℃～8 ℃保存12個(gè)月的3批疫苗，免疫42日齡SPF雞只30 d后攻擊A、B、C型副雞禽桿菌，攻毒劑量同2.2.1，其攻毒結(jié)果見表7；免疫4周齡SPF雞只(20 μL/只)，21 d后測(cè)定ND的HI平均效價(jià)分別為5.0、4.9、5.0，非免疫對(duì)照雞為1.2；對(duì)NDV強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率分別為9/10、9/10、10/10，非免疫對(duì)照為0/5(表7)。

2.4.2 疫苗保存15個(gè)月的試驗(yàn)結(jié)果 4 ℃～8 ℃保存15個(gè)月的3批疫苗，免疫42日齡SPF雞只30 d后攻擊A、B、C型副雞禽桿菌，攻毒劑量同2.2.1，其攻毒結(jié)果見表8；免疫4周齡SPF雞只(20 μL/只)，21 d后測(cè)定ND的HI平均效價(jià)分別為5.6、5.2、5.3，非免疫對(duì)照雞為1.0；對(duì)NDV強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率分別為10/10、10/10、10/10，非免疫對(duì)照為0/5(表8)。

表7 疫苗保存期試驗(yàn)ⅠTable 7 The storage duration test Ⅰ of the vaccines

表8 疫苗保存期試驗(yàn)ⅡTable 8 The storage duration test Ⅱ of the vaccines

3 討論

本試驗(yàn)按照農(nóng)業(yè)部442號(hào)公告有關(guān)要求進(jìn)行了安全性試驗(yàn)，三批疫苗(201101，201102，201103)無論是大劑量接種還是單劑量3次接種，對(duì)雞只沒有副反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有雞只均健活，大劑量接種、單劑量3次重復(fù)接種和非免疫3組雞只的平均日增重差異不顯著(P>0.05)，表明雞傳染性鼻炎(三價(jià))-新城疫二聯(lián)油乳劑滅活疫苗安全性良好。

IC效力試驗(yàn)結(jié)果表明，201101、201102和201103三批二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞只30日時(shí)攻擊A、B、C型副雞禽桿菌，其保護(hù)率均≥8/10，總保護(hù)率為87/90(表3)；4 ℃～8 ℃保存12個(gè)月的3批疫苗免疫SPF雞只，對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌的攻毒保護(hù)率均≥7/10，總保護(hù)率為74/90(表7)；4℃～8℃保存15個(gè)月的三批疫苗免疫SPF雞只，對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌的攻毒保護(hù)率均≥7/10，總保護(hù)率為78/90(表8)。

ND效力試驗(yàn)結(jié)果表明，201101、20102和201103三批二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞只，每只雞接種20 μL，其HI抗體平均值均>24，對(duì)新城疫強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率均>7/10；4 ℃～8 ℃保存12個(gè)月和15個(gè)月免疫SPF雞只，其ND HI抗體均值均>24，對(duì)新城疫強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率均>7/10。ND效檢結(jié)果符合《中國(guó)獸藥典》2010年版新城疫單苗的效檢標(biāo)準(zhǔn)。

試驗(yàn)雞的免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果表明，在42日齡首免，108日齡二免，二免后3、6、9個(gè)月的ND HI抗體為26.9～28.1(表4)；二免后6個(gè)月和9個(gè)月對(duì)新城疫強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率為100%，對(duì)A、B、C型副雞禽桿菌的攻毒保護(hù)率均≥7/10，總保護(hù)率分別為70/90和68/90(表5和表6)。

鑒于試驗(yàn)雞只僅養(yǎng)殖在相對(duì)隔離的小環(huán)境，免疫持續(xù)期試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月，存在自然感染NDV野毒的風(fēng)險(xiǎn)，為了不影響副雞禽桿菌攻毒雞的數(shù)量，又要兼顧NDV強(qiáng)毒攻毒時(shí)有非免疫對(duì)照雞，故我們僅設(shè)了20只雞為ND非免疫對(duì)照雞，用65只雞免疫雞新城疫+禽流感(H9)二聯(lián)滅活疫苗作為副雞禽桿菌攻毒非免疫對(duì)照組。

試驗(yàn)結(jié)果表明，我們研制的IC(三價(jià))和新城疫二聯(lián)滅活疫苗安全性和免疫原性良好。4℃～8℃保存，其保存期為15個(gè)月。42日齡首免，110日齡左右(開產(chǎn)前)二免，二免持續(xù)期為9個(gè)月。達(dá)到了接種一種疫苗有效預(yù)防雞傳染性鼻炎和新城疫兩種重要疫病的目的。

國(guó)外公司早期多研制雞傳染性鼻炎氫氧化鋁膠滅活疫苗[17]，我們?cè)?jīng)用進(jìn)口的雞傳染性鼻炎氫氧化鋁膠滅活疫苗和我們自己研發(fā)的油乳劑滅活疫苗進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)副雞禽桿菌的攻毒保護(hù)率油乳劑苗優(yōu)于鋁膠苗，這可能與油乳劑的非特異性免疫能力較強(qiáng)有關(guān)(張培君等未發(fā)表資料)。

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Studies on Combined Infectious Coryza (Serotype A + Serotype B + Serotype C) and Newcastle Disease Inactivated Vaccine

GONG Yu-mei1,ZHANG Pei-jun1,ZHU Wen-ge2,HE Yun-xia1,WANG Hong-jun1,ZHANG Yu2,SHAO Qing-hong2

(1.InstituteforAnimalHusbandryandVeterinaryScience,BeijingAcademyofAgriculturalandForestryScience,Beijing,100097,China; 2.BeijingSinderVet-technologyCO.,LTD.Shunyi,Beijing,101302,China)

Using Page's serovar A, B and C ofAvibacteriumparagallinarum(Avpg) and LaSota strain of NDV developed a combined infectious coryza and newcastle disease inactivated vaccines. Three batch of vaccines used for safety test.The chickens were injected 0.5 mL/chicken at a time for three times and 2.0 mL/chicken at a time. Efficacy tests were carried out on three batches of vaccines using SPF chickens, 30 days after immunization, the chickens were challenged with Page's serovar A, B and C of Avpg. The immune duration test of the conventional chickens which were immunized at 42 days old and 110 days old. Nine months after second immunization, the chickens were challenged with Page's A, B, C of Avpg and virulent Newcastle disease virus. The effect of storage on the vaccines was evaluated in SPF chickens using three batches of vaccineS stored at 4 ℃-8 ℃ for 12 and 15 months. The result showed that the vaccines is very safe, and challenged protection rate of immunized SPF chickens is ≥ 80% for Page's serovar A, B and C of Avpg. HI titer of ND is great than 24for immunized SPF chickens using 20 μL vaccine. The conventional chickens were challenged at 9 months post second vaccination and the protection rate ≥ 70% for all three serovars, and 100% against the virulent Newcastle disease virus. The protection rate of immunized chickens using the vaccines stored at 4 ℃-8℃ for 12 and 15 months is ≥70% for Page's serovar A, B and C of Avpg, HI titer is great than 24and 7/10 against the virulent Newcastle disease virus. The developed vaccine is safe and effective.

Infectious coryza;Newcastle disease;Avibacteriumparagallinarum;trivalence vaccine;inactivited vaccine

2014-05-06

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303044)；北京市財(cái)政專項(xiàng)資助項(xiàng)目(KJCX201104002)

龔玉梅(1961-)，女，湖南華容人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病診斷與預(yù)防工作。*

S858.31

:A

:1007-5038(2015)01-0040-05