楊 揚，李 斌，葉 杰，亓翠玲，何曉東，李江超，章倩倩，黃 韌，張 鈺，王麗京*

(1.廣東藥學院血管生物學研究所，廣東廣州 510006；2.廣東省實驗動物檢測所，廣東廣州 510260)

心房鈉尿肽基因敲除小鼠的鑒定

楊 揚1，李 斌1，葉 杰1，亓翠玲1，何曉東1，李江超1，章倩倩1，黃 韌2，張 鈺2，王麗京1*

(1.廣東藥學院血管生物學研究所，廣東廣州 510006；2.廣東省實驗動物檢測所，廣東廣州 510260)

研究心房鈉尿肽基因敲除小鼠(ANP-/-小鼠)的生物學及病理學特性。ANP-/-小鼠與C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，觀察小鼠的繁育狀況及其生物學特性，選取合適時間處死小鼠，通過HE染色觀察臟器形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)。ANP-/-小鼠的繁殖周期比C57BL/6長，產(chǎn)仔率較低；ANP-/-小鼠肝臟、肺臟、脾臟較C57BL/6小鼠的有明顯炎癥反應(yīng)，但是C57BL/6小鼠未見明顯的病理改變。提示ANP基因的缺失可能與炎癥發(fā)生有關(guān)。說明ANP-/-小鼠繁殖較慢、產(chǎn)仔率低，且正常繁殖的普通小鼠不會引起器官的病理學改變。但作為一種在心血管、代謝疾病上的動物模型，并與炎癥甚至腫瘤有可能的未知聯(lián)系的轉(zhuǎn)基因動物，其很有研究和探索價值。

心房鈉尿肽；轉(zhuǎn)基因小鼠；鑒定

鈉尿肽( natriuretic peptide, NP) 是近20年發(fā)現(xiàn)的一類多肽。國內(nèi)外研究報道， 到目前為止，人類共發(fā)現(xiàn)了5種利鈉肽，其中，心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是一種由21個～35個氨基酸殘基組成的多功能活性肽，又稱為心鈉素、利鈉素、利尿素、血管舒張素[1]。它是一種由心房合成并貯存的活性多肽，通過與心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖器官和腎臟等組織或器官上的鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors, NPR) 結(jié)合，促進細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的生成[2]。因此，ANP在研究高血壓、心功能不全、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腎功能不全等發(fā)病機制和防治上均有重要意義。生理上其具有強大利鈉利尿、舒張血管、降低血壓、抑制細胞增殖、參與調(diào)節(jié)免疫及脂質(zhì)代謝等作用[3]，近年來還發(fā)現(xiàn)其在炎癥、抗腫瘤方面具有潛在的巨大價值[4-6]。

在本研究所特有的轉(zhuǎn)基因小鼠平臺上，我們從美國Jackson實驗室引進了ANP基因敲除雜合子(ANP+/-)小鼠并成功進行了繁殖和鑒定[7]，得到ANP基因敲除純合子(ANP-/-)小鼠并進行配種、觀察。同時對其進行組織切片，HE染色后觀察其臟器在組織學上是否與同齡普通小鼠存在差異。為進一步研究ANP在疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和相關(guān)分子機制提供了更好的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，2只，雌雄各半，12周齡，為廣東省動物中心飼養(yǎng)；ANP-/-小鼠，2只，雌雄各半，12周齡，由繁殖后鑒定純合子配種所得；引進ANP+/-品系背景為C57BL/6J，雌雄各2只，基因型為雜合子(ANP+/-)。經(jīng)大半年繁殖和鑒定得到純合子(ANP-/-)都用于配種(1∶1),實驗鼠為其產(chǎn)仔所得。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；全自動生物組織包埋機、烤片機為PR公司產(chǎn)品、低溫離心機為美國熱電集團產(chǎn)品；石蠟切片機為德國徠卡儀器公司產(chǎn)品；獨立通氣籠IVC為蘇杭科技器材有限公司產(chǎn)品；其他普通儀器有DYY-C型電泳儀、GENE凝膠成像系統(tǒng)、LG微波爐、臺式滅菌器等。

多聚甲醛固定液和genomic DNA裂解緩沖液自己配制；蘇木素、伊紅染色劑、磷酸鹽緩沖液為中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K、dNTP為Roche 公司產(chǎn)品；Taq酶為康龍生物有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖粉為Biowest公司產(chǎn)品；PCR引物為英駿生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他生化試劑：溴化乙錠(EB)、無水乙醇、甲醛溶液、二甲苯、石蠟等均為進口或國產(chǎn)分裝試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因工程小鼠的飼養(yǎng)和繁殖 ANP+/-小鼠為美國Jackson Laboratory產(chǎn)品(Stock Number: 002685)，品系背景為C57BL/6J，雌雄各2只，基因型為雜合子(ANP+/-)。經(jīng)半年繁殖和鑒定得到純合子(ANP-/-)共8只都用于配種(1∶1)和觀察。

小鼠均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。飼養(yǎng)室內(nèi)的溫度保持在22 ℃～28 ℃，相對濕度維持在40%～60%，噪音<60 dB，日夜溫差為2 ℃，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。飼料為廣東省醫(yī)學實驗動物中心產(chǎn)品，小鼠飲用水、籠盒和墊料均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。小鼠的繁殖選擇將性成熟(6周齡～8周齡)純合子1∶1同籠配種，對配種小鼠定期給予蛋黃或滅菌葵花籽以補充營養(yǎng)。每天密切觀察小鼠飲食、活動及全身情況。及時記錄小鼠受孕及分娩時間。

1.2.2 基因工程小鼠的鑒定與篩選 待哺乳期滿(18 d～21 d)且經(jīng)過分籠后的小鼠即可進行DNA鑒定。由于引進的ANP小鼠為雜合子(ANP+/-)，根據(jù)孟德爾定律其子代可能為3型：ANP+/+、ANP+/-、ANP-/-，故需要鑒定得到待研究對象。

1.2.2.1 小鼠組織DNA提取 用消毒后的剪刀剪下小鼠尾尖部約1 cm置于1.5 mL EP管中，參照上海捷瑞生物工程有限公司組織/細胞DNA提取試劑盒說明提取小鼠DNA加無菌去離子水后于4 ℃保存待用。

1.2.2.2 PCR基因擴增 引物序列分別為：5′-CCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′；5′-CTGTCCAACACAGATCTGATG-3′；5′-CTGTTGCAGCCTAGTCCACT-3′；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min 。

1.2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳與基因型鑒定 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物7 mL，加入10× loading buffer 1 mL, 加樣于15 g/L瓊脂糖凝膠孔，于TAE電泳緩沖液中電泳(170 V，20 min)。用Gene公司凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 制作主要臟器組織石蠟切片并HE染色 脫頸椎法處死小鼠, 并進行詳細解剖和檢查。對主要臟器取材, 經(jīng)多聚甲醛固定液液固定12 h，石蠟包埋、切片7 mm厚度，HE染色，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察并拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 ANP-/-小鼠基因型鑒定

親代ANP小鼠均為雜合子(ANP+/-)配種，故子代小鼠有雜合型(ANP+/-)、純合型(ANP-/-)和野生型(ANP+/+)3種基因型。出現(xiàn)在700 bp條帶是純合子(ANP-/-)小鼠，出現(xiàn)在434 bp條帶是野生型(ANP+/+)小鼠。同時出現(xiàn)以上2條帶電泳帶為雜合子(ANP+/-)小鼠?？梢?號～5號和10號小鼠電泳條帶位于700 bp和434 bp處，為雜合子；6號～8號小鼠電泳條帶位于700 bp處，為純合子；9號位于434 bp處，為野生型(圖1)。

圖1 ANP-/-小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig.1 Genotype identification results of mouse ANP-/- gene

2.2 ANP-/-小鼠生殖情況統(tǒng)計

對繁殖鑒定所得ANP-/-小鼠進行配種，持續(xù)觀察其生長狀態(tài)并記錄其生殖率。自2012年11月至今，共用8籠ANP-/-純合子1∶1配種，統(tǒng)計其繁殖周期及產(chǎn)仔率后與同期本所動物房內(nèi)配種C57BL/6小鼠繁殖周期及產(chǎn)仔率進行對比，發(fā)現(xiàn)ANP-/-小鼠的繁殖周期(圖2A)平均比C57BL/6小鼠長10 d左右，且每胎產(chǎn)仔率(圖2B)大都1只～4只，明顯低于C57BL/6小鼠，且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此我們判斷，ANP基因敲除小鼠的繁殖周期較C57BL/6略長，產(chǎn)仔率較C57BL/6較低。

圖2 ANP-/-小鼠的繁殖周期與產(chǎn)仔數(shù)與C57小鼠統(tǒng)計對比Fig.2 The comparison of reproductive cycle and litter size between ANP-/- mice and C57BL/6 mice

2.3 ANP-/-小鼠主要臟器對正常小鼠C57BL/6組織病理學觀察對比

分別各取2只12周齡ANP-/-小鼠與C57BL/6小鼠，雌雄各半，同時處死后石蠟包埋臟器，HE染色對比其組織結(jié)構(gòu)。肉眼觀察無論雌雄ANP-/-小鼠的主要臟器相對C57BL/6小鼠未見明顯嚴重改變。其HE切片在低倍(200×)觀察發(fā)現(xiàn)，心肌細胞形態(tài)未見明顯改變(圖3A和圖3C)；腎小體結(jié)構(gòu)無明顯異常，但在試驗組及對照組腎小管上皮內(nèi)均可見少量顆粒變性，可能因為飼養(yǎng)環(huán)境及應(yīng)激反應(yīng)致腎小球濾過性狀改變，導(dǎo)致管腔內(nèi)產(chǎn)生少量蛋白質(zhì)、細胞或者細胞碎片管型所致(圖3B和圖3D)。心臟及腎臟細胞核亦未見異常分裂相。

圖3 ANP-/-小鼠和C57BL/6小鼠心肌和腎臟組織結(jié)構(gòu)對比圖(200×)Fig.3 Histological observation of myocardia and renal structures in ANP-/- mice and C57BL/6 mice

但在ANP-/-小鼠肝臟、脾臟、肺臟中低倍視野即可見較明顯病理性改變。對有輕微病理性改變的脾臟、肝臟、肺臟進行高倍(400×及1 000×)觀察，我們發(fā)現(xiàn)ANP基因缺失小鼠的脾臟紅髓白髓邊界模糊不清，淋巴細胞核深染且增生明顯并有炎性細胞浸潤(箭頭所指)；肝臟組織內(nèi)肝板結(jié)構(gòu)不清，部分肝細胞存在水腫及輕微脂肪變性，且有小部分炎性細胞聚集(箭頭所指)；肺臟切片也看到部分肺泡壁明顯增厚、炎性細胞浸潤(箭頭所指)。提示ANP缺失可能與炎癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)(圖4)。

3 討論

自1955年Kisch等發(fā)現(xiàn)心房細胞內(nèi)含有特殊的分泌顆粒，到1984年Debold等從大鼠以及人心房組織中分離、提純了到心鈉素，并證明它是一種由28個氨基酸組成的肽，稱為心房鈉尿肽 (atrial natriuretic poly peptide，ANP)，又稱心鈉素 ( cardionatin ) 。ANP開始正式進入越來越多科學家的研究領(lǐng)域，后逐漸發(fā)現(xiàn)其具有強大的排鈉利尿、擴張血管和降血壓的作用，ANP及其類似結(jié)構(gòu)蛋白也逐漸有了更多臨床開發(fā)前景。因為ANP同時具有增加血管通透性, 并抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng),還對體內(nèi)的水電解質(zhì)平衡，心血管活動及內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)起著重要作用，它在心血管以及代謝疾病中也逐漸呈現(xiàn)出越來越重要的角色[8]。同時ANP的受體NPRA被發(fā)現(xiàn)在越來越多的腫瘤組織中高表達，包括肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等[9]，提示ANP可能跟腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。因此，關(guān)于ANP動物模型的需求也隨之而生并越來越大。

圖4 ANP-/-小鼠部分炎細胞增生臟器與C57BL/6小鼠對比圖Fig.4 Histological observation of C57BL/6 mice and ANP-/- mice which organs with inflammation

1995年北卡來羅納大學的Dr. Oliver Smithies率先成功構(gòu)建ANP基因敲除(ANP-/-)小鼠，主要用于研究心血管疾病和食源性高血壓。該小鼠屬于鹽敏感性高血壓小鼠，即雜合子在低鹽飲食時血壓無明顯異常，高鹽飲食是呈現(xiàn)高血壓，而純合子在無論高鹽還是低鹽都呈現(xiàn)高血壓。目前,已用ANP-/-小鼠的研究主要集中在2個方面，即心血管疾病、代謝疾病。而最近研究發(fā)現(xiàn)，ANP可能具有抗腫瘤血管生成及促進腫瘤細胞凋亡的作用，它還可緩解抗癌藥物對腎臟肝臟的毒性作用，這種心臟激素可單獨或聯(lián)合應(yīng)用于多種腫瘤的治療[10]。但這些研究大都集中在細胞試驗，多缺乏體外動物試驗及組織學等佐證。而常見的實驗動物造模方式[11]在此類分泌蛋白課題上無法進行，且ANP蛋白價格昂貴，故研究探索ANP-/-小鼠的生物學特性和病理特征，對以后開展更多的動物試驗有重要意義。

而我們通過對繁育所得ANP-/-小鼠的生物學和病理觀察，發(fā)現(xiàn)其繁殖周期及產(chǎn)仔率都較明顯低于正常小鼠，這可能與母鼠孕期血壓或者子宮血管病變有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)ANP-/-小鼠主要臟器存在不同程度炎性細胞浸潤，提示我們ANP的缺失可能與炎癥的發(fā)生與發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)性。這也為以后對ANP與炎癥、腫瘤等研究提供了很好的指路作用?？傊?，對轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬Ｐ偷纳飳W特征和病理觀察[12],對于以后探索基因與疾病關(guān)系和新藥開發(fā)是至關(guān)重要的。

[1] 昝春輝，宣 兵.心房利鈉肽與心血管疾病的臨床研究進展[J].實用心腦肺血管病雜志，2013，21(4)：8-10.

[2] 羅 溶，周白麗.利鈉肽與心血管疾病關(guān)系的研究進展[J].社區(qū)醫(yī)學雜志，2011，9(2)：51-52.

[3] 高 波，吳曉琰，陸 怡.心房利鈉肽的抗腫瘤作用及其基因工程表達[J].中國臨床醫(yī)學，2012，19(4)：437-439.

[4] Cui Yujie, Wang Wei, Dong Ningzheng, et al. Role of corin in trophoblast invasion and uterine spiral artery remodeling in pregnancy[J].Nature,2013,484(7393):246-250.

[5] Xing Junjie, Yakubov B, Poroyko V, et al. Opposite effects of ANP receptors in attenuation of LPS-induced endothelial permeability and lung injury[J].Microvasc Res,2012,83(2):194-199.

[6] Magnusson M, Jujic A, Hedblad B, et al. Low plasma level if atrial natriuretic peptide predicts development of diabetes: the prospective malmo diet and cancer study[J].J Clin Endocrinol Metab,2012,97(2):638-645.

[7] 何曉東，楊 揚，周 秦，等. ANP基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育及基因型鑒定[J].廣東藥學院學報,2013,29(4):428-430.

[8] Romero M, Caniffi C, Bouchet G, et al. Sex differences in the beneficial cardiac effects of chronic treatment with atrial natriuretic peptide in spontaneously hypertensive rats[J].PLoS One,2013,8(8):e71992.

[9] 趙志龍，張 佳，王健生，等. NPRA與腫瘤相關(guān)性的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2013,19(2):285-287.

[10] Vesel Y D L. Metabolic targets of cardiac hormones' therapeutic anti-cancer effects[J].Curr Pharm Des,2010,16(9):1159-1166.

[11] 孫 赫，李文雄.高脂血癥大鼠模型幾種造模方式的比較[J].動物醫(yī)學進展,2014,35(3):78-82.

[12] 何保麗，楊仁華，李進濤，等.樹鼩自發(fā)性乳腺癌的病理學觀察[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(11):135-163.

Identification of Atrial Natriuretic Peptide Gene Knockout(ANP-/-)Mice

YANG Yang1,LI Bin1,YE Jie1,QI Cui-ling1,HE Xiao-dong1,LI Jiang-chao1,ZHANG Qian-qian1,HUANG Ren2,ZHANG Yu2,WANG Li-jing1

(1.InstituteofVascularBiology,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510006,China；2.GuangdongLaboratoryAnimalMonitoringInstitute,Guangzhou,Guangdong,510260,China)

To investigate the biological features of new transgenic mice (ANP-/-mice) and compare its pathological features with normal mice. ANP-/-mice and C57BL/6 mice (normal control mice) were housed in the same SPF environment to observe the multiplication and study their biological characteristics. The histological morphology and structure of organs were compared with normal mice. The ANP-/-mice have longer reproductive cycle and lower birth rate; Moreover, ANP-/-mice show slightly higher inflammatory response than C57BL/6 mice, suggesting that ANP gene may associated with inflammation. The reproduction and birth rate of ANP-/-mice are slow, but as the animal model used in cardiovascular and metabolic disease, even inflammation or cancer, they have potential research and exploration value.

atrial natriuretic peptide;transgenic animal model;identification

2014-05-11

國家自然科學基金項目(31271455)

楊 揚(1988-)，女，陜西楊凌人，碩士研究生，主要從事轉(zhuǎn)基因動物分子病理學研究。*

R737.9; R965.1

:A

:1007-5038(2015)01-0071-04