王 坤，張佰忠，易康樂，朱立軍，蔣 雋，燕海峰，3＊

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；3.湖南天心黃雞育種有限公司，長沙410143）

禽類種蛋產(chǎn)出時(shí)，受精卵已發(fā)育成為具有內(nèi)外胚層，達(dá)40 000～60 000個(gè)細(xì)胞的X期囊胚［1］，該時(shí)期的細(xì)胞稱為囊胚細(xì)胞（Blastodermal cells，BCs）。雞BCs在禽類生物技術(shù)研究領(lǐng)域具有十分重要的作用：（1）BCs是潛在的雞胚胎干細(xì)胞［2］；（2）BCs是禽類轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中的主要靶細(xì)胞［3-5］；（3）BCs可在禽類種質(zhì)資源保護(hù)利用研究領(lǐng)域中，通過解凍BCs制備嵌合體而重新獲得活體［6-8］，解決無法冷凍保存禽類母系（W染色體）遺傳資源的困境。K.Kino等［8］通過移植超低溫冷凍的BCs能獲得種系嵌合體，說明冷凍保存后的細(xì)胞具有很好的生命力。但在后續(xù)的研究中，對雞干細(xì)胞的冷凍研究大多集中在原生殖細(xì)胞（PGCs），安靜［9］、王丙云等［10］對雞BCs的冷凍保存進(jìn)行過研究，雖然都獲得了不錯(cuò)的結(jié)果，但沒有對于BCs冷凍保存中各種操作程序和影響因素進(jìn)行研究。

本研究使用胚胎冷凍儀、細(xì)管冷凍以及二乙酰熒光素（Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色測定細(xì)胞活力（簡稱活力，Cell viability，CV）與體外培養(yǎng)24 h貼壁率（簡稱貼壁率，Cell adherent rate cultivated for 24 h，CAR）雙重評價(jià)方法，對雞BCs冷凍保存中，DMSO的濃度、冷凍及解凍速率進(jìn)行研究，欲建立雞BCs細(xì)管冷凍保存的有效方法，促進(jìn)其在胚胎干細(xì)胞與遺傳資源保存領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白來航雞與黑鳳雞種蛋由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所提供。

96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板、0.25 m L細(xì)管均購自IMV公司。倒置熒光顯微鏡（CK40-RFL，Olympus）、離心機(jī)（TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠制造）。胚胎程序冷凍儀（NH78200-EN，AIR LIQUIDE-DMC）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司），青霉素鈉、鏈霉素（Biosharp公司），二乙酸熒光素（FDA）（TCI公司），丙酮、二甲基亞砜（DMSO）等試劑（VETEC公司）。

1.2 方法

1.2.1 雞X期BCs的分離 種蛋儲存于10～18℃，采用10 d內(nèi)的種蛋。將蛋殼表面用70%酒精擦拭消毒，置于紫外線消毒過的蛋托上，轉(zhuǎn)移到無菌室，水平朝上靜置30 min左右。使用孔略大于胚盤的打孔器，制作濾紙環(huán)，滅菌。根據(jù)種蛋大小選取合適培養(yǎng)皿，種蛋保持靜止時(shí)的方位不變，從底部小心敲破蛋殼，兩手從底部破口處，往兩側(cè)迅速掰開，內(nèi)容物快速落入培養(yǎng)皿中。使胚盤位于水平面上，用眼科剪將卵黃膜外胚盤上方的濃蛋清完全剪開，暴露干燥的卵黃膜，用尖嘴小鑷子夾取濾紙環(huán)，孔正對胚胎，準(zhǔn)確貼在卵黃膜上。沿紙環(huán)小心將卵黃膜剪開，用鑷子夾住濾紙環(huán)邊緣，從卵黃上分離后在盛有0.9%生理鹽水的幾個(gè)培養(yǎng)皿中輕輕搖動，依次漂洗，去除卵黃，直到胚盤從卵黃膜上脫離［11］。

1.2.2 雞BCs體外培養(yǎng) 用剪去約3 mm的1 m L Tip吸取脫離的胚盤，轉(zhuǎn)入含生長培養(yǎng)基的液滴中，分離到足夠的胚盤（每次試驗(yàn)一般取16個(gè)左右胚）后，將胚轉(zhuǎn)移到2 m L離心管中，添加1 m L生長培養(yǎng)基，用1 m L Tip與1 m L移液槍，每次吸入1 m L再完全排出，反復(fù)進(jìn)行6下，制成密度約為8× 105m L-1的細(xì)胞懸液（按照每個(gè)胚50 000～60 000個(gè)細(xì)胞估算［1］），一部分用于冷凍備用，一部分調(diào)整密度為4×104m L-1后使用96孔板培養(yǎng)，作為對照細(xì)胞。每孔接種懸液200μL，在37℃5%CO2濃度與95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 冷凍 采用5種不同濃度DMSO（5℃保存）進(jìn)行冷凍保護(hù)劑優(yōu)化：1）5%DMSO＋30%FBS＋65%DMEM；2）10%DMSO＋30%FBS＋60% DMEM；3）15%DMSO＋30%FBS＋55%DMEM；4）20%DMSO＋30%FBS＋50%DMEM；5）25% DMSO＋30%FBS＋45%DMEM。優(yōu)化其他參數(shù)時(shí)選用4）配方。

將細(xì)胞密度為8×105m L-1的BCs懸液，5℃預(yù)冷處理10 min，1∶1緩慢添加冷凍保護(hù)液，5℃平衡30 min，用經(jīng)過預(yù)冷處理的0.25 m L的細(xì)管裝管。通過胚胎程序冷凍儀實(shí)現(xiàn)3步冷凍：（1）打開程序冷凍儀，設(shè)定好程序并倒入液氮，在儀器降溫至5℃時(shí)將細(xì)管放入程序冷凍儀，以-1℃·min-1的速率降溫至-7℃，保持10 min。（2）繼續(xù)以-1℃·min-1的速率降溫，比較降溫至-15、-35、-55、-75℃的效果（在優(yōu)化其他參數(shù)時(shí)，選擇-35℃）。（3）達(dá)到設(shè)定溫度后，將細(xì)管直接投入液氮保存。

1.2.4 解凍 細(xì)管從液氮中取出后，對兩種不同解凍速率進(jìn)行優(yōu)化：1）慢速解凍，立即投入到37℃水浴鍋中，分別保持10 s、1 min、2 min、3 min后進(jìn)行下一步操作（優(yōu)化其它參數(shù)時(shí)使用1 min）；2）快速解凍，立即投入到50℃水浴鍋中，分別保持5 s、20 s、40 s、1 min后進(jìn)行下一步操作。

隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)體制的改革，土地經(jīng)營日益集中化、規(guī)?；?，農(nóng)民專業(yè)合作社、家庭農(nóng)場等組織地膜使用量大，白色污染嚴(yán)重。應(yīng)加強(qiáng)對合作社等組織的管理，根據(jù)農(nóng)膜使用量，下達(dá)回收任務(wù)，并與其簽訂回收協(xié)議，采用收取保證金的方式，對于完成回收任務(wù)的退還保證金并給予資金獎勵(lì)。對于沒有完成回收任務(wù)的，則使用保證金組織第三方進(jìn)行回收清理，倒逼新型經(jīng)營主體開展廢舊農(nóng)膜污染防治工作。

解凍后的處理：將細(xì)管中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，緩慢添加10倍體積含10%FBS的生長培養(yǎng)基，用4 000 r·min-1離心5 min，去上清液，重復(fù)1次，計(jì)算活力后調(diào)整密度為4×104m L-1，按1.2.2方法培養(yǎng)。

1.2.5 活力與貼壁率檢測 FDA細(xì)胞活力檢測，將FDA加入到細(xì)胞液中，F(xiàn)DA終濃度為1μg·m L-1，37℃暗室染色3～5 min，取25μL制片后使用100～400倍的熒光顯微鏡（激發(fā)和發(fā)射波長分別為450～490和520 nm）觀察并計(jì)算活力，發(fā)綠色熒光的是活細(xì)胞，不發(fā)光的是死細(xì)胞，計(jì)數(shù)需在10 min內(nèi)完成。貼壁率檢測，按步驟1.2.2將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用倒置熒光顯微鏡對每一孔貼壁情況進(jìn)行觀察和評估，評估方法為貼壁細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比即貼壁率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞鏡檢圖

圖1中，圖1A為冷凍前BCs形態(tài)圖，圖1B為使用冷凍程序解凍后細(xì)胞形態(tài)圖。圖1C、D為FDA熒光染色結(jié)果，其中圖1D是開了少量可見光的效果，可以同時(shí)辨別出死、活細(xì)胞。圖1E～J為不同貼壁率細(xì)胞貼壁圖。貼壁細(xì)胞聚集成集落并且與未貼壁細(xì)胞有明顯界限，表現(xiàn)為塊狀或斑狀。

2.2 不同DMSO濃度對雞BCs冷凍保存的結(jié)果

由表1可知，1）在細(xì)胞活力上，未冷凍組與各冷凍組都有極顯著差異（P＜0.01）；DMSO濃度為20%組活力最高，為0.58，與15%組差異不顯著（P＞0.05），但與5%、10%和25%組差異極顯著（P＜0.01）；10%組細(xì)胞活力最差，為0.18，與5%組差異不顯著（P＞0.05）；15%組和25%組差異不顯著（P＞0.05）。2）在貼壁率上，未冷凍組與各冷凍組差異極顯著（P＜0.01）；其中20%組貼壁率最高，為30.5%，與15%組差異不顯著（P＞0.05），與25%組差異顯著（P＜0.05），與5%組和10%組差異極顯著（P＜0.01），15%組和25%組差異不顯著（P＞0.05）；5%組結(jié)果最差，貼壁率為0。

圖1 細(xì)胞鏡檢圖Fig.1 Cell microscopy

表1 不同DMSO濃度冷凍保存BCs的結(jié)果（n＝40）Table 1 The CV and CAR of BCs freezed by different DMSO concentrations

由圖2可以看出，不同DMSO濃度，解凍后細(xì)胞活力和貼壁率的變化趨勢基本相同，都是先升高后降低，在濃度為20%時(shí)達(dá)到最高值。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，濃度為5%時(shí)，細(xì)胞活力不為0，但培養(yǎng)24 h后貼壁率為0，說明該組細(xì)胞解凍后存活的也隨后死亡或是無法貼壁。

2.3 雞BCs不同冷凍速率處理結(jié)果

由表2可知，1）在活力上，未冷凍組與各冷凍組都有極顯著差異（P＜0.01）；-75℃組解凍后細(xì)胞活力最高，為0.53，但與-35℃、-55℃組解凍后的細(xì)胞活力差異不顯著（P＞0.05）；-15℃組解凍后的細(xì)胞活力最差，為0.03，且與各組之間差異都極顯著（P＜0.01）。2）在貼壁率上，未冷凍組與各冷凍組差異極顯著（P＜0.01）；不同冷凍速率各組間差異也極顯著（P＜0.01），其中-35℃組貼壁率最高，為36.6%，-15℃組最差，沒有細(xì)胞貼壁。

由圖3可以看出，不同冷凍速率處理下，解凍后活力和貼壁率有不同的變化趨勢。解凍后活力，在一定范圍內(nèi)，隨著投入液氮時(shí)溫度的降低，細(xì)胞活力有逐漸上升的趨勢，-75℃組活力最高，-15℃組活力最低；從解凍后貼壁率看，在一定范圍內(nèi)，隨著投入液氮時(shí)刻溫度的降低，活力先升高后逐漸下降，-35℃組活力最高，-15℃組最低；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，-15℃組活力不為0，但貼壁率為0，-75℃組活力最高，但貼壁率很低。

表2 不同冷凍速率結(jié)果的比較（n＝40）Table 2 The CV and CAR of different freezing rate

圖2 不同DMSO濃度冷凍結(jié)果折線圖Fig.2 The line chart of CV and CAR at different DMSO concentration

圖3 不同冷凍速率冷凍結(jié)果折線圖Fig.3 The line chart of CV and CAR at different freezing rate

2.4 雞BCs不同解凍速率處理結(jié)果

表3 37℃水浴不同時(shí)間解凍結(jié)果（n＝30）Table 3 The CV and CAR of different bath time in 37℃water

2.4.2 快速解凍 采用50℃水浴不同時(shí)間進(jìn)行解凍，結(jié)果見表4：1）在活力上，未冷凍組與冷凍組不同解凍速率之間均差異極顯著（P＜0.01）；水浴5 s效果最好，為0.70，與水浴20 s差異顯著（P＜0.05），與水浴40 s、1 min差異極顯著（P＜0.01）；水浴1 min效果最差，為0.41，與水浴40 s差異不顯著（P＞0.05），與水浴20 s差異顯著（P＜0.05）。2）在貼壁率上，未冷凍組與冷凍組各解凍速率間差異均極顯著（P＜0.01）；不同解凍速率之間差異也極顯著（P＜0.01）；其中水浴5 s效果最好，為36.9%，水浴1 min效果最差，為5.6%。

表4 50℃水浴不同時(shí)間解凍結(jié)果（n＝30）Table 4 The CV and CAR of different bath time in 50℃water

2.4.3 慢速與快速解凍的對比結(jié)果 由圖4可以看出，解凍后活力，37℃水浴整體上優(yōu)于50℃水浴，且變化趨勢較平緩；50℃水浴活力整體上隨水浴時(shí)間增加有下降趨勢，且變化幅度相對較37℃更大，但50℃水浴5 s獲得了最高活力。

由圖5可以看出，37℃水浴解凍，貼壁率隨著時(shí)間增加，先增加后下降，變化幅度較平緩，在整體上每一個(gè)速率都高于50℃水浴的結(jié)果，特別是在1～2 min時(shí)貼壁率最高；50℃水浴解凍，隨著水浴時(shí)間增加，貼壁率不斷下降，且下降幅度越來越大。

圖4 不同解凍速率對活力影響折線圖Fig.4 The line chart of CV thawed at different rate

圖5 不同解凍速率解凍后貼壁率折線圖Fig.5 The line chart of CAR thawed at different rate

3 討 論

3.1 冷凍保護(hù)劑濃度對雞BCs冷凍保存的影響

DMSO是一種滲透性細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。它能在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。本研究表明，一定范圍內(nèi)，隨著DMSO濃度增加，冷凍效果是先增加后降低，在20%時(shí)最高。這可能是由于低濃度的冷凍保護(hù)劑無法達(dá)到保護(hù)細(xì)胞受高濃度電解質(zhì)損傷的要求，而DMSO具有毒性，因此濃度過大時(shí)，對細(xì)胞的毒性作用就會顯現(xiàn)出來［12］。本研究使用濃度為20% DMSO作為冷凍保護(hù)劑，所得復(fù)蘇率最高結(jié)果為70%，低于王丙云等［10］和李碧春等［13］復(fù)蘇率最高為85.5%的結(jié)果，但接近K.Kino［8］的結(jié)果，可能是因?yàn)榛盍y定方法不同所致。

3.2 冷凍速率對雞BCs冷凍保存的影響

本試驗(yàn)在國內(nèi)首次使用胚胎程序冷凍儀對雞BCs進(jìn)行冷凍保存研究。對常規(guī)冷凍程序進(jìn)行了改進(jìn)，增加了細(xì)胞懸液預(yù)冷、-7℃平衡結(jié)晶兩個(gè)步驟。細(xì)胞預(yù)冷可降低冷凍保護(hù)劑加入時(shí)產(chǎn)生熱量對細(xì)胞的損傷，而且DMSO在常溫下對細(xì)胞有較大的毒副作用，預(yù)冷則可以減少這種傷害。-7℃平衡結(jié)晶可以讓細(xì)胞更好地度過“危險(xiǎn)期”，減少冷凍損傷，這與韓威等［14］結(jié)論一致。冷凍過程中均以-1℃·min-1的速率降溫［15］，對比降溫至-15、-35、-55、-75℃時(shí)投入液氮保存的不同效果，發(fā)現(xiàn)在-15～-75℃隨著溫度的下降細(xì)胞活力逐漸增加，-75℃時(shí)最高，這與M.Naito等［16］在降溫至-80℃投入液氮保存獲得較高活力類似。但復(fù)蘇后貼壁率卻呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，在-15～-75℃，其貼壁率是先增加后降低，最高結(jié)果出現(xiàn)在-35℃。細(xì)胞活力出現(xiàn)最高值的-75℃組，貼壁率卻是4組中除了-15℃組（沒有貼壁）以外最低的，可能是-75℃組，解凍后雖然活力高，但細(xì)胞已經(jīng)損傷，只是這些損傷的表達(dá)較慢，而且可能投入液氮前溫度越低，這種損傷越嚴(yán)重。在人類［17］和小鼠［18］胚胎冷凍上，也較多使用降溫至-30或-35℃再投入液氮，可能該溫度區(qū)域更適合胚胎的冷凍，對細(xì)胞造成的傷害較小。

3.3 解凍速率對雞BCs冷凍保存的影響

解凍速率在一定程度上決定復(fù)蘇細(xì)胞的存活力，解凍緩慢往往會導(dǎo)致細(xì)胞重結(jié)晶而死亡，而迅速升溫則可以使其重結(jié)晶的晶體減少，還可以使細(xì)胞處在高濃度物質(zhì)中的時(shí)間縮到最短，減少滲透性休克，恢復(fù)細(xì)胞的生理功能，從而降低細(xì)胞死亡率。解凍溫度必須控制在一定范圍內(nèi)，若細(xì)胞懸浮液的溫度過高，超過了細(xì)胞的耐受程度，就會造成細(xì)胞死亡。在解凍程序上，常規(guī)的方法是37℃水浴至融化［19］，但這種方法主觀性強(qiáng)，不易重復(fù)。本研究通過固定水浴時(shí)間進(jìn)行對比，使試驗(yàn)的重復(fù)性得到了保證。也發(fā)現(xiàn)雖然50℃水浴5 s細(xì)胞活力最高，但貼壁率最高則出現(xiàn)在37℃水浴1 min上，可能是細(xì)胞在某些溫度范圍內(nèi)受到損傷表達(dá)較緩慢，這也再次說明細(xì)胞活力不能完全代表細(xì)胞生命力。50℃水浴5 s雖然活力上最好，但隨著時(shí)間延長活力下降迅速，難以控制。37℃水浴解凍整體上無論是細(xì)胞活力還是貼壁率均高于50℃水浴結(jié)果，而且隨水浴時(shí)間增加變化較小，1～3 min內(nèi)均未出現(xiàn)較大差距，穩(wěn)定性好，更適合試驗(yàn)中使用。

3.4 雞BCs冷凍損傷評價(jià)方法

活力測定上，本研究室多次嘗試臺盼藍(lán)染色法，但無論是自配的或是購買的染色劑，按文獻(xiàn)報(bào)道的各種配比，都發(fā)現(xiàn)染色效果不佳，很難區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，特別是在卵黃等雜質(zhì)未去除干凈時(shí)誤差更大，而且計(jì)數(shù)時(shí)間短促，也不能顯示出細(xì)胞的存活狀態(tài)［20］。因此，本研究首次在雞BCs上使用FDA熒光染色測定細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)操作簡單快捷，死活細(xì)胞對比明顯，而且根據(jù)熒光的強(qiáng)弱還可以判斷出細(xì)胞的活力高低［21］，但使用中要注意染色劑的濃度和染色時(shí)間，如果濃度太高則在視野中背景就會較亮，活細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光就不明顯，而且死細(xì)胞有時(shí)也會照亮。染色時(shí)間不夠，則熒光物質(zhì)積累不足，效果不佳，染色時(shí)間過長，則會導(dǎo)致活細(xì)胞的熒光衰減。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在開少量可見光的情況下，可以同時(shí)看到發(fā)出綠色熒光的活細(xì)胞和不發(fā)光的死細(xì)胞，達(dá)到雙染的效果，計(jì)算活力更加快捷準(zhǔn)確。

本研究同時(shí)也使用了貼壁法來評估細(xì)胞的冷凍效果，因?yàn)橐罁?jù)細(xì)胞分化試驗(yàn)可知，雞BCs在體外培養(yǎng)時(shí)，一部分細(xì)胞貼壁生長并最終分化為不同類型的細(xì)胞，還有一部分細(xì)胞則懸浮聚集分化，形成簡單的類胚體［22］。所以通過BCs貼壁生長的難易程度，可以更加準(zhǔn)確的判定其作為潛在胚胎干細(xì)胞的活力，而且在增殖和傳代培養(yǎng)上，貼壁細(xì)胞都是最主要的對象，因此，冷凍復(fù)蘇后能貼壁的細(xì)胞才能更有利于干細(xì)胞研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞貼壁時(shí)間較未冷凍細(xì)胞要晚一些，而且貼壁速率也較慢，大概在24 h以后貼壁速率才與新鮮細(xì)胞差不多，這與有關(guān)報(bào)道［14，23］類似。原因可能是，復(fù)蘇后BCs細(xì)胞從冷凍時(shí)的休眠狀態(tài)到體外培養(yǎng)恢復(fù)正常增殖能力需要一定時(shí)間。因此選擇24 h作為觀察時(shí)間點(diǎn)不僅可以獲得較穩(wěn)定的結(jié)果，而且結(jié)果相對明顯。對比3組結(jié)果，采用活力與貼壁率兩類指標(biāo)評估，大體趨勢是一致的，但在冷凍速率和50℃水浴解凍試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)不同結(jié)果，還有待進(jìn)一步研究。由此，也可以發(fā)現(xiàn)，僅靠細(xì)胞活力評價(jià)細(xì)胞冷凍效果是不全面的，本實(shí)驗(yàn)室使用的貼壁法評價(jià)，將為新的細(xì)胞冷凍損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)開辟新思路。

4 結(jié) 論

雞BCs使用DMSO濃度為20%的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行細(xì)管冷凍，以-1℃·min-1的速率降溫至-7℃保持10 min，繼續(xù)以同樣速率降溫至-35℃投入液氮保存，37℃水浴1～2 min解凍細(xì)胞，不僅可以獲得較好的細(xì)胞活力，而且培養(yǎng)后可以獲得較高的貼壁率。

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