胡驍飛，魏鳳仙，楊繼飛，鄧瑞廣，張改平，3＊

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，鄭州450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州450002）

植酸是植物性飼料原料中一種常見抗?fàn)I養(yǎng)因子。植酸中的磷利用率極低，同時，植酸還降低了蛋白質(zhì)等其他養(yǎng)分的利用率［1］。植酸酶可以分解植酸，提高植酸磷及蛋白質(zhì)利用率。植物性飼料中植酸酶含量極少，因此，在飼料生產(chǎn)中經(jīng)常添加植酸酶以提高飼料養(yǎng)分利用率，減少氮、磷排放，緩解我國蛋白質(zhì)和磷資源的缺乏。為了防止飼料生產(chǎn)加工過程中由于漏加植酸酶而造成飼料的質(zhì)量下降，必須對飼料產(chǎn)品中植酸酶含量進行實時檢測，簡便、快捷的植酸酶檢測技術(shù)是目前各飼料生產(chǎn)企業(yè)及畜禽養(yǎng)殖企業(yè)所亟需的。

1 植酸對動物生產(chǎn)的危害

1.1 植酸概述

植酸（phytic acid）又名肌醇六磷酸，以植酸鹽（植酸鈣、鎂、鉀）形式廣泛存在于植物種子內(nèi)，植酸鹽又稱為菲丁。據(jù)估算，全球每年生產(chǎn)的作物所含有的植酸鹽大概為5 100萬t，其中含磷約為990萬t，這個數(shù)量相當(dāng)于每年所消耗的礦物肥料中磷資源的65%［2］。植酸是種子休眠發(fā)芽的重要養(yǎng)分之一，主要為種子發(fā)芽時提供充足的磷源［2］。植酸對動物或人體是有益的，具有抗氧化及防止癌癥發(fā)生，降低糖尿病發(fā)病率等功效［3-4］，還可以抑制α-淀粉酶及α-葡糖苷酶活性，從而降低Ⅱ型糖尿病的發(fā)生［5］。但糧食、飼料中的植酸對動物養(yǎng)殖是有害的。

1.2 飼料中植酸對動物生產(chǎn)的危害

植酸含有6個帶負(fù)電荷的磷酸根，因此具有很強的螯合能力，能夠與農(nóng)作物中的常量及微量礦物元素鈣、鉀、鎂、銅、鐵、錳、鈷等結(jié)合，形成不溶性的植酸鹽，難以被單胃動物消化，影響?zhàn)B分的吸收利用，從而降低飼料的營養(yǎng)價值，甚至引起動物產(chǎn)生礦物質(zhì)缺乏癥狀，且容易引起環(huán)境污染，因此，植酸被認(rèn)為是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子［6］。除與礦物質(zhì)元素結(jié)合影響其消化吸收外，植酸還能夠與農(nóng)作物中的蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉等養(yǎng)分結(jié)合形成不溶性的絡(luò)合物。動物體內(nèi)的消化酶作為一種蛋白質(zhì)也可以被植酸結(jié)合，使消化道中消化酶含量減少，活性降低；同時，植酸和鈣結(jié)合，降低了消化道中鈣離子濃度，而動物體內(nèi)消化酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶等）需要鈣離子激活，鈣離子濃度的降低也會導(dǎo)致這些消化酶的活性下降，從而使蛋白質(zhì)、淀粉等養(yǎng)分的消化利用率降低；植酸還導(dǎo)致動物內(nèi)源氨基酸和礦物質(zhì)損失增加；這些因素最終導(dǎo)致動物的生長性能下降［7-9］。目前，消除飼料原料中植酸對養(yǎng)分消化率影響的最有效措施就是在日糧中添加植酸酶。

2 植酸酶及其功能

2.1 植酸酶概述

植酸酶是將植酸及其鹽類分解釋放出磷元素及其他養(yǎng)分的酶類，該酶屬于由蛋白質(zhì)和糖組成的結(jié)合酶［10］。植酸酶的來源主要有三種，分別是植物源性植酸酶［11］、動物（內(nèi)）源性植酸酶［12］以及微生物（細(xì)菌和真菌）源性植酸酶［13］，目前市場銷售使用的幾乎全部為微生物植酸酶。植酸酶由于其顯著地分解飼料中植酸（鹽）的功能而被廣泛地應(yīng)用在豬［14］、蛋雞［15］及肉雞［16］飼料中，是目前動物營養(yǎng)領(lǐng)域應(yīng)用最為成功的飼料用酶添加劑。

2.2 植酸酶的功能

大量的研究表明，在蛋雞、豬及肉雞日糧中添加植酸酶可以增加動物消化道內(nèi)消化酶活性［17］，提高養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體蛋白的基因表達(dá)［18］，從而提高日糧中干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、能量及鈣、磷、微量元素等養(yǎng)分的消化利用率及沉積率［17，19-20］；提高動物日增重、日采食量，降低料肉比［14，18］；提高動物骨骼強度［14］；增加禽蛋蛋殼的硬度和韌度，降低破蛋率及軟殼蛋比例［21］；減少畜禽糞便中氮、磷含量［22，23］，降低畜牧養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境的污染。

由于在飼料中添加植酸酶替代一部分無機磷源的經(jīng)濟效果顯著，且有利于降低環(huán)境污染，因此，飼料生產(chǎn)、養(yǎng)殖企業(yè)把其作為一種必需的飼料添加劑，在動物日糧中添加植酸酶，同時減少無機磷源的添加。但是，在生產(chǎn)實踐當(dāng)中，可能會存在飼料生產(chǎn)過程由于疏忽而漏加或少加植酸酶的情況，由于飼料中已經(jīng)減少了無機磷源的添加，會造成日糧中可利用磷含量不能滿足動物需求，導(dǎo)致動物采食量下降、料肉比升高、生產(chǎn)性能降低［24］；動物骨骼中礦物元素含量及密度顯著降低、骨質(zhì)疏松、骨骼脆弱甚至癱瘓［25-27］；蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋重量、蛋殼質(zhì)量下降［27-28］。因此，對飼料中植酸酶含量進行實時監(jiān)控檢測，有效防止植酸酶漏加，對保證飼料產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，防止飼料安全事故發(fā)生，保持養(yǎng)殖效益至關(guān)重要。

3 植酸酶檢測方法

植酸酶活性是以測定磷元素濃度來確定的，因此，植酸酶活性測定方法也即無機磷元素濃度測定方法，定義為在一定溫度下（37℃），一定p H（5.5）條件下，每分鐘從一定濃度（5.0 mmol·L-1）植酸鈉溶液中釋放出1 mol無機磷，即為一個植酸酶單位。世界范圍內(nèi)植酸酶活性測定并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前最常用的檢測方法主要是比色法，包括鉬藍(lán)法和鉬黃法。

鉬藍(lán)法又叫鉬酸銨法，主要是為了測定樣品中磷含量［29］。樣品中磷在酸性溶液中和鉬酸銨結(jié)合為黃色磷鉬酸銨，在還原劑作用下變成藍(lán)色成為鉬藍(lán)，一定的波長下比色，根據(jù)藍(lán)色深淺計算磷含量。而利用鉬藍(lán)法測定植酸酶活性時，植酸酶活性定義為，在37℃，溶液p H5.5條件下，每分鐘分解釋放1 μmmol無機磷所需的酶量［30］。由于要使用還原劑及緩沖劑，操作相對復(fù)雜。另外，還原劑種類繁多，如氯化亞錫、碘化鉀、碘化氫、金屬鉬等，但沒有一種還原劑能很好地把靈敏性、準(zhǔn)確性、檢測范圍完美地體現(xiàn)出來，例如在利用氯化亞錫作還原劑時，測定方法靈敏度高，但檢測范圍比較窄［29］；而且使用的還原劑不同時，比色時使用的光線波長也不一樣，如使用硫酸亞鐵作還原劑，選取的波長大于720 nm，而使用維生素C作還原劑，則波長為620～660 nm最適宜［31］。

1981年，J.K.Heinonen和R.J.Lahti改進了鉬藍(lán)法。在此方法中，磷鉬酸鹽溶液直接溶解到丙酮溶液中，在丙酮中磷鉬酸鹽呈現(xiàn)亮黃色，直接用比色法進行測定，而不需要再用還原劑把磷鉬酸鹽還原成藍(lán)色。亮黃色形成后，由于多余的鉬酸鹽立即被反應(yīng)液中的檸檬酸鹽絡(luò)合，因此，磷酸鹽水解產(chǎn)生的磷，不會對測定溶液的色澤再產(chǎn)生影響，這也是該方法的最大優(yōu)點。另外，該方法不需要用還原劑，降低了還原劑種類對測定敏感度和測定范圍干擾［32］。這種方法測定時的最適宜的波長為400～420 nm［31］。

鉬酸銨-離心柱法也是鉬藍(lán)法的一種改進方法［33］。這種方法就是把樣品用0.2 mol·L-1、p H5.5的檸檬酸緩沖液室溫提取30 min，然后用0.45μm的濾膜過濾去除溶液的油層，然后再把濾過液通過離心柱分子篩（截留相對分子質(zhì)量30 000 u），以去除游離的磷酸鹽，植酸酶相對分子質(zhì)量在50 000 u以上，因此不能被分子篩過濾掉。和直接測定樣品方法相比，離心柱可以降低原料或飼料中游離磷造成的比較高的空白背景值，保證植酸酶分解的植酸磷成為比色反應(yīng)中的最主要因素，使測定的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性得到改善。當(dāng)動物日糧或原料中植酸酶含量在0～1 500 u·kg-1的范圍時，其變異系數(shù)為1%～6%，而直接測定方法變異系數(shù)為28%～39%。如果測定添加于飼料中的植酸酶活性時，相關(guān)系數(shù)R2＝0.99，差異極顯著（P＜0.01）。但這種方法處理相對比較復(fù)雜，分子篩大小會影響到測定結(jié)果，樣品提取時間也將影響測定結(jié)果。通過過濾去除植酸鹽水解釋放的結(jié)合蛋白或脂肪，這些物質(zhì)在比色測定時，會引起植酸酶活性測定時吸光度值的波動，引起測定誤差。

鉬黃法（又稱為釩-鉬酸銨或偏釩酸銨）法。該法原理是，在酸性條件下（如硝酸或鹽酸），植酸酶分解植酸（鹽）產(chǎn)生正磷酸鹽，然后加入硝酸化的酸性釩鉬酸銨終止反應(yīng)，正磷酸鹽和釩鉬酸結(jié)合形成黃色的絡(luò)合物，415 nm波長比色，無機磷濃度越高，黃色越深，把酶活性定義為37℃、p H 5.5條件下，每分鐘從濃度5.0 mmol·L-1的植酸鈉溶液中釋放出1 mol無機磷，即為一個植酸酶單位，以U表示［34-35］。鉬黃法比鉬藍(lán)法操作相對方便，由于不需加入還原劑，因此檢測耗費時間相對較短，而且顯色穩(wěn)定性比鉬藍(lán)法好，干擾相對較少。1994年，該法成為美國的標(biāo)準(zhǔn)植酸酶活性檢測方法。我國也在2002年將其確定為我國植酸酶活性測定標(biāo)準(zhǔn)方法，并于2009年進行了修訂［36-37］，該法主要用于飼料添加劑植酸酶產(chǎn)品及添加植酸酶的配合飼料中植酸酶活性鑒定。鉬黃法是無機磷與釩鉬酸銨形成有色絡(luò)合物，通過比色進行定量，而且要求是在酸性條件下，因此植酸鹽水解釋放的結(jié)合蛋白或脂肪等物質(zhì)在比色測定時，可能引起吸光度值的波動，造成測定誤差，同時原料或飼料中游離磷造成的比較高的空白背景值而使檢測值偏高。

固體瓊脂鑒別平板培養(yǎng)基法，這種方法用于定性測定植酸酶，主要用在區(qū)分篩選分泌植酸酶的細(xì)菌微生物時使用。該方法在瓊脂平板培養(yǎng)基中加入植酸鈣作為唯一的磷源，植酸鈣是不溶性的，所以瓊脂培養(yǎng)基顯示為白色混濁狀。當(dāng)含有分泌植酸酶的細(xì)菌微生物種植到這種平板培養(yǎng)基中后，由于微生物分泌出植酸酶而使培養(yǎng)基中的植酸鹽分解，從而在分泌植酸酶的微生物周圍的培養(yǎng)基形成一個透明帶，一旦培養(yǎng)基有透明帶形成，就定性認(rèn)為有植酸酶存在［38］。由于強酸也可以分解植酸鈣，因此在采用這種方法鑒別產(chǎn)植酸酶細(xì)菌時，如果遇到產(chǎn)強酸（如鹽酸）的細(xì)菌（如厭氧菌種鏈球菌）時，也會在白色渾濁的瓊脂培養(yǎng)基上形成一條透明帶，使人誤認(rèn)為是含有產(chǎn)植酸酶的細(xì)菌，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。為了克服假陽性結(jié)果產(chǎn)生的可能性，研究人員利用兩步復(fù)染法來進行植酸酶活性測定，把上述的瓊脂糖平板培養(yǎng)基室溫下浸入到二氯化鈷溶液中孵育5 min，然后用新配制的鉬酸銨／釩酸銨溶液替代二氯化鈷溶液再孵育5 min。由于二氯化鈷和植酸鹽螯合時對p H不敏感，所以產(chǎn)酸的細(xì)菌所形成的透明帶，經(jīng)復(fù)染后先顯示為紫色，而加入鉬酸銨／釩酸銨后，螯合物又由紫色變成黃色，而透明帶消失。而產(chǎn)植酸酶的細(xì)菌微生物周圍形成的透明帶還正常存在，這樣可以消除由于產(chǎn)酸細(xì)菌微生物形成的植酸酶假陽性［39］。經(jīng)過這個步驟，雖然降低了假陽性，但由于增加了復(fù)染步驟，必定造成測定耗時增加。

不論是定量還是定性檢測植酸酶活性的方法，都是以酶分解植酸鹽釋放磷酸根的出現(xiàn)為基礎(chǔ)。而能夠產(chǎn)生植酸酶的微生物（如細(xì)菌、真菌），本身可以產(chǎn)生磷酸酶（如外源磷酸酶，是一種非特異性酸性磷酸酶），同時還可以產(chǎn)生多聚磷酸鹽復(fù)合物［40］，磷酸酶分解多聚磷酸鹽復(fù)合物也可以產(chǎn)生大量的磷酸根。因此，在測定這些微生物的植酸酶活性時，常常會受到磷酸酶分解多聚磷酸鹽復(fù)合物產(chǎn)生的磷酸根濃度的干擾，定量測定會導(dǎo)致測定的植酸酶活性值過高，定性測定則會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。為了克服這些不利影響，2005年，D.F.Berry等［41］建立了一種新型植酸酶測定方法，反相色譜-紫外（HPLC-UV）法。使用植酸的能生色的底物類似物5-O-（6-苯甲酰氨基己基）D-肌醇-1，2，3，4，6-戊磷酸（T-IP5）作為探針，該探針作為測定植酸酶活性時的生色底物，使用HPLC和UV測定法進行定量測定，植酸酶作用于T-IP5時，可以脫掉磷酸根，形成一系列的部分脫磷酸的肌醇磷酸鹽T-IPx，（x＝5、4、3、2、1）。利用分析型的HPLC系統(tǒng)分析相應(yīng)的T-IPx濃度，在這個HPLC系統(tǒng)中，利用一個反相柱，洗脫緩沖液為四丁基氫氧化銨，T-IPx定量測定采用外標(biāo)法，通過測定一定時間內(nèi)T-IPx濃度降低的量，即可得到植酸酶的活性。而產(chǎn)生的磷酸根濃度則用紫外比色法進行定量，通過與T-IPx減少量的對比，可以推斷出反應(yīng)液中的磷酸根是由微生物植酸酶作用于T-IPx脫磷酸形成，還是由微生物磷酸酶作用于磷酸鹽復(fù)合物脫磷酸形成。這種方法相對比較準(zhǔn)確，排除了磷酸酶作用的影響，因此結(jié)果比較可靠。但過程相對比較復(fù)雜，因此耗時相對比較長。

2008年，近紅外光譜快速檢測技術(shù)（NIRS）被應(yīng)用于植酸酶活性檢測［42］。盡管這種技術(shù)縮短了檢測時間，但檢測準(zhǔn)確性并沒有增加，且該技術(shù)需要對光譜進行預(yù)處理，需要建立校正模型，因此熟練應(yīng)用該技術(shù)需要專業(yè)技術(shù)人員。

上述這些植酸酶檢測技術(shù)由于存在著種種的不足之處，難以在我國的飼料生產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖企業(yè)推廣應(yīng)用。而隨著植酸酶在飼料生產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖企業(yè)中廣泛普及使用，飼料生產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖企業(yè)迫切需要經(jīng)濟、簡便、快捷的植酸酶檢測技術(shù)，用以監(jiān)控檢測飼料原料及飼料中植酸酶含量，來確保飼料產(chǎn)品質(zhì)量。

4 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)是依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原理，結(jié)合酶標(biāo)記技術(shù)、同位素標(biāo)記、膠體金標(biāo)記技術(shù)等其他技術(shù)建立起來的一類靈敏度高、特異性強、檢測限低、檢測步驟簡便、快捷的檢測技術(shù)。

最經(jīng)典的免疫學(xué)檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），其具體步驟如下：①固化抗原（或抗體），即把抗原（或抗體）吸附固化到酶標(biāo)板或其他材料上，②加入酶［如辣根過氧化物酶（HRP）及堿性磷酸酶（ALP）等］標(biāo)記的抗體（或抗原），③加入所標(biāo)記酶的底物（HRP的底物一般為3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺，ALP的底物一般為對-硝基苯磷酸酯），④根據(jù)底物顯色的深淺計算樣品中靶標(biāo)物質(zhì)的含量［43］。常用的ELISA檢測方法，根據(jù)檢測樣品的相對分子質(zhì)量又可以分為2類；夾心ELISA，一般用于檢測大分子的物質(zhì)，如病毒抗原、抗體及其他大分子物質(zhì)等，這類物質(zhì)本身含有多個抗原決定簇，可以和不同的抗體（或抗原）結(jié)合；間接競爭ELISA，又稱阻斷ELISA，一般用于檢測相對分子質(zhì)量小于10 ku的物質(zhì)，如農(nóng)藥、獸藥、霉菌毒素等小分子化合物檢測，這類物質(zhì)屬于不完全抗原或半抗原，只有一個抗體結(jié)合位點，不能夠用夾心法進行檢測。

其他免疫學(xué)檢測方法有放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）、熒光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）、時間分辨熒光分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）、免疫測流層析分析技術(shù)（lateral flow immunoassay，LFIA）以及由上述方法衍生、改進的各種技術(shù)等［44-45］。免疫學(xué)檢測技術(shù)由于其快速、靈敏、可以現(xiàn)場實時監(jiān)測等優(yōu)點已廣泛應(yīng)用于食品、飼料中霉菌毒素、藥物殘留、違禁添加物監(jiān)控檢測［46-49］，以及致病性病原微生物（如傳染性法氏囊病毒、豬旋毛蟲等）的監(jiān)控檢測［50-51］。

5 應(yīng)用免疫檢測技術(shù)檢測植酸酶活性的設(shè)想

到目前為止，國內(nèi)外均很少見到利用免疫學(xué)方法檢測飼料中植酸酶含量的相關(guān)文獻(xiàn)報道。但有關(guān)抗植酸酶的多克隆抗體和單克隆抗體的制備已有報道［52-53］，多克隆抗體及單克隆抗體的制備成功，為植酸酶免疫學(xué)檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

植酸酶為大分子蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為50～55 ku［54］，具有多個抗原決定簇，因此可以用雙抗體夾心法來建立其免疫學(xué)檢測方法，具體操作步驟如下：1）將抗植酸酶單克隆抗體（如鼠源單克隆抗體）包被在聚苯乙烯酶標(biāo)板上，洗滌除去未結(jié)合的抗體，用封閉液將聚苯乙烯酶標(biāo)板孔中未結(jié)合植酸酶抗體的位點進行封閉，洗滌除去封閉液；2）加入受檢的植酸酶樣本，室溫反應(yīng)一定的時間，洗滌除去未結(jié)合的樣品；3）加入與包被的植酸酶單克隆抗體異源的抗體（如兔源植酸酶多克隆抗體），室溫反應(yīng)一定的時間，洗滌除去未結(jié)合的多克隆抗體；4）加入一定稀釋倍數(shù)的酶標(biāo)二抗（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，GaRIgG-HRP），室溫反應(yīng)一定的時間，洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；5）加入顯色液，室溫顯色一定時間；6）加入終止液（一般用2 mol·L-1的硫酸），終止反應(yīng)；7）用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀值。

根據(jù)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出檢測樣品中的植酸酶蛋白含量，然后根據(jù)單位蛋白質(zhì)中植酸酶活性最終確定飼料中植酸酶活性。這種方法不但靈敏度高，而且特異性強。如果研制成檢測ELISA試劑盒，則檢測樣品耗時2～3 h。

除了ELISA檢測方法，也可以基于免疫側(cè)流層析原理，利用膠體金標(biāo)記植酸酶單克隆抗體，植酸酶多克隆抗體進行攔截，建立植酸酶的免疫側(cè)流層析快速檢測試紙條。膠體金試紙有以下幾種核心組件構(gòu)成，主要包括支撐底板、層析膜（主要是硝酸纖維膜，也稱NC膜）、吸水紙、玻璃棉等。NC膜上噴涂有異源多克隆抗體（也即多克隆抗體和單克隆抗體來源不同，比如單克隆抗體來源于小鼠，則多抗隆抗體可以來源于兔或其他動物）形成檢測線，另外還噴涂有二抗（也可以是金黃色葡萄球菌A蛋白SPA）形成質(zhì)控線，兩條線是平行的；NC膜上檢測線外側(cè)粘附的玻璃棉噴涂有膠體金標(biāo)記的植酸酶單克隆抗體，稱為膠金墊；膠金墊的外側(cè)粘附有空白的玻璃棉用于吸收樣品溶液，稱為樣品墊；NC膜的質(zhì)控線外側(cè)粘附有吸水紙，也稱吸水墊，它保證樣品溶液向吸水墊的方向移動。試紙條的結(jié)構(gòu)見圖1和圖2。用試紙條檢測樣品時，如果樣品中含有植酸酶蛋白，則其與金標(biāo)單克隆抗體結(jié)合，然后再與檢測線上的異源多克隆抗體結(jié)合形成“三明治”樣的復(fù)合物，則檢測線顯示紅色；如果樣品中不含植酸酶蛋白，則金標(biāo)單克隆抗體不能和檢測線上的異源多克隆抗體結(jié)合，不能形成“三明治”樣的復(fù)合物，則檢測線不顯色；無論樣品溶液中是否含有植酸酶蛋白，金標(biāo)抗體均可以和質(zhì)控線上的二抗（或SPA）結(jié)合，顯示紅色，一旦質(zhì)控線不顯色，說明該試紙條已經(jīng)失效。這種試紙只需5～10 min就可以定性確定飼料中是否含有植酸酶。試紙檢測，不需要使用檢測儀器，使用比較簡單，因此，特別適合飼料企業(yè)、養(yǎng)殖單位現(xiàn)場實時監(jiān)控所生產(chǎn)的飼料品質(zhì)，所以植酸酶免疫學(xué)檢測技術(shù)產(chǎn)品，市場前景比較廣闊。

圖1 試紙結(jié)構(gòu)示意Fig.1 The structure chart of test strip

圖2 試紙平面示意Fig.2 The plan of test strip

盡管上述的免疫學(xué)檢測方法具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，但免疫學(xué)檢測方法本身也存在一定的不足之處。免疫學(xué)檢測方法以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，抗體本身的性質(zhì)、影響抗原和抗體特性結(jié)合的各種因素都會對免疫學(xué)檢測方法產(chǎn)生不利影響。如果所制備的抗體特異性不強，則容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；而抗體靈敏度不夠時，則會降低免疫學(xué)檢測方法的敏感性。抗原抗體結(jié)合反應(yīng)受到整個反應(yīng)體系中的離子強度、溶液p H等各種不同基質(zhì)影響［55］。畜禽飼料種類繁多，不同的飼料中飼料原料、添加劑及礦物質(zhì)元素添加量不同，因此制備出的檢測樣品溶液的離子強度、溶液p H都不一樣，如果對不同的樣品用同樣的處理方法將會嚴(yán)重影響免疫學(xué)檢測方法的靈敏度，導(dǎo)致測定值不準(zhǔn)確；而如果對不同的樣品，建立不同的處理方法，這樣需要消耗很多的時間，體現(xiàn)不出免疫學(xué)檢測方法的快速性。盡管試紙條對保存條件要求不高，但在寒冷的冬季，特別是冷凍天氣會導(dǎo)致金標(biāo)抗體溶解較慢，延長檢測時間，甚至導(dǎo)致試紙條失效。

6 小結(jié)與展望

盡管植酸酶理化檢測方法能夠相對準(zhǔn)確地測定植酸酶的活性，但飼料養(yǎng)殖企業(yè)急切需要的是能夠簡便、快速地定性飼料中是否含有植酸酶，這種矛盾可以用免疫學(xué)技術(shù)來很好的解決。一旦優(yōu)質(zhì)的植酸酶抗體能夠制備出來，除了建立常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)（ELISA試劑盒）外，還會與其他分析技術(shù)（如化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)）結(jié)合，衍生出更靈敏的植酸酶定量檢測技術(shù)。化學(xué)發(fā)光免疫分析，是將化學(xué)發(fā)光檢測的高靈敏與免疫反應(yīng)的高特異性相結(jié)合建立的分析技術(shù)，主要用于檢測各種（半）抗原、抗體、農(nóng)獸藥物、霉菌毒素、激素、酶及各種營養(yǎng)成分等的分析技術(shù)，該技術(shù)比常規(guī)ELISA靈敏度可以高出1～2個數(shù)量級［56］。

納米材料是目前各個領(lǐng)域研究熱點，被冠以“2l世紀(jì)最有前途的材料”的美譽，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)、機械、食品安全等各領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。除了上面已經(jīng)談到的直接用裸眼觀察測定結(jié)果的植酸酶金標(biāo)試紙條外，也可以用新型的納米材料（如納米熒光量子點）作為標(biāo)記材料，研發(fā)出新型的植酸酶快速檢測試紙條。目前納米熒光量子點作為標(biāo)記材料生產(chǎn)的快速檢測試紙也已經(jīng)在食品安全免疫檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用，納米熒光量子點標(biāo)記的試紙檢測靈敏度比膠體金試紙?zhí)岣?倍［57］。納米熒光量子點標(biāo)記試紙需要有紫外光源，該要求可能會限制此類試紙的適用范圍，但已經(jīng)有科研工作者提出用手機作為發(fā)光源的設(shè)想，一旦這種設(shè)想實現(xiàn)，則納米熒光量子點標(biāo)記試紙則會得到廣泛的應(yīng)用。由于這些免疫學(xué)檢測技術(shù)使用簡單、方便，特別適合飼料養(yǎng)殖企業(yè)使用，而這些免疫學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對于進一步保證飼料產(chǎn)品質(zhì)量、提高養(yǎng)殖效益將會有顯著的技術(shù)支撐作用。

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