李 娟，杜新華，陳 燕，高 雪，李俊雅，許尚忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

在肉牛育種工作中，培育出肉質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的肉牛品種是育種工作者努力的方向。脂肪酸結(jié)合蛋白3（Fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）作為與動(dòng)物肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的候選基因得到了廣泛關(guān)注。研究表明，該基因SNPs位點(diǎn)與哺乳動(dòng)物的背膘厚、大理石花紋、剪切力等脂肪沉積相關(guān)性狀存在顯著差異［1-2］。因此，開(kāi)展FABP3基因特性研究對(duì)優(yōu)質(zhì)肉牛新品種的培育具有重要指導(dǎo)意義。

FABP3基因是脂肪酸結(jié)合蛋白基因家族的一員，主要分布在動(dòng)物的心肌和骨骼肌細(xì)胞中［3］，參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)脂肪酸的合成，對(duì)脂肪的沉積、轉(zhuǎn)運(yùn)及基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用［4-5］。FABP3可結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸，促進(jìn)心肌和骨骼肌細(xì)胞中甘油三酯的沉積，被視為影響肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因［6］。在家畜育種中主要集中在FABP3基因多態(tài)位點(diǎn)與性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。F.Gerbens等［1，7-8］證明豬FABP3基因是影響肌內(nèi)脂肪的候選基因。Z.G.Huang等［9］報(bào)道肉羊FABP3的mRNA表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)；余剛等［10-12］報(bào)道，F(xiàn)ABP3基因與陜北白絨山羊的背膘厚、大理石花紋間存在極顯著相關(guān)性。李武峰等［13］發(fā)現(xiàn)肉牛FABP3基因位點(diǎn)與牛肉嫩度剪切力顯著相關(guān)，王卓和昝林森［14］發(fā)現(xiàn)，秦川牛FABP3基因與后腿圍、背膘厚、嫩度、大理石花紋等性狀存在極顯著相關(guān)。因此將該基因作為肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因來(lái)尋找改善肉品質(zhì)的方法，仍有大量的工作需要繼續(xù)［15］。

小鼠作為重要的模式動(dòng)物已得到廣泛應(yīng)用，其基因組改造技術(shù)成熟，且生理生化特點(diǎn)和發(fā)育過(guò)程與家畜相似；另一優(yōu)點(diǎn)是小鼠作為遺傳學(xué)研究材料其基因組計(jì)劃已完成，為研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供了條件基礎(chǔ)和技術(shù)手段。1982年，Palmiter實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的“超級(jí)轉(zhuǎn)基因鼠”首次證明了轉(zhuǎn)基因鼠的可行性；2001年，塞萊拉公司宣布完成了小鼠基因組測(cè)序的草圖，這極大促進(jìn)了小鼠作為重要轉(zhuǎn)基因模型的發(fā)展［16］。

在基因水平研究FABP3基因?qū)ε５燃倚笾敬x的調(diào)控機(jī)理仍處于探索中，將牛的FABP3基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，并驗(yàn)證其功能，是牛功能基因在模式動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證的一種有效方法。本研究主要對(duì)轉(zhuǎn)牛FABP3基因的小鼠及其子代進(jìn)行驗(yàn)證，并檢測(cè)目的基因在小鼠體內(nèi)的遺傳情況；同時(shí)，利用熒光定量和組織熒光技術(shù)驗(yàn)證小鼠不同組織中FABP3基因表達(dá)水平，以期探明轉(zhuǎn)牛FABP3基因小鼠的遺傳與表達(dá)特性，為牛FABP3基因功能研究奠定基礎(chǔ)，也為牛的分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用杜新華博士（2013年）在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所利用C57BL／6J品系供體鼠和公鼠獲得的受精卵，通過(guò)顯微注射質(zhì)粒PB［CMV-EGFP-FABP3］和輔助質(zhì)粒pcDNA-pBase制備得到的4只轉(zhuǎn)基因小鼠2雄（編號(hào)1、2號(hào)）2雌（編號(hào)3、4號(hào)），另外購(gòu)得非轉(zhuǎn)基因個(gè)體5只（C57BL／6J品系）作為對(duì)照組，1雄4雌［17］。制定交配方案為第1組：1號(hào)♂轉(zhuǎn)基因鼠與3號(hào)♀轉(zhuǎn)基因鼠交配；第2組：2號(hào)♂轉(zhuǎn)基因鼠與4號(hào)♀轉(zhuǎn)基因鼠交配；第3組：1號(hào)♂轉(zhuǎn)基因鼠與野生型雌性交配；第4組：2號(hào)♂轉(zhuǎn)基因鼠與野生型雌性交配；第5組：野生型個(gè)體自由交配作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 G0代轉(zhuǎn)基因小鼠RT-PCR驗(yàn)證 將獲得的4只轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行活體成像，確認(rèn)為陽(yáng)性個(gè)體；另外取10～20 mg鼠尾，按照天根動(dòng)物組織總RNA試劑盒的步驟提取鼠尾總RNA。RT-PCR反應(yīng)：（1）RNA變性，反應(yīng)體系：Oligod T Primer 1 μL、d NTP（10 mmol·L-1）1μL、總RNA 2μL、加RNase free dd H2O至10μL；將反應(yīng)液置于65℃保溫5 min，迅速置于冰上；（2）反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：上述變性反應(yīng)液10μL、5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL、RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5μL、Prime-Script II RTase（200 U·μL-1）1.0μL、RNase free dd H2O補(bǔ)至20μL，42℃反應(yīng)30～60 min，95℃滅活5 min，置于冰上冷卻，轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20℃保存；（3）PCR擴(kuò)增，以上述反應(yīng)得到的c DNA為模板，以FABP3-F：5′-CCGGAATTCGCCACCATGGTGGACGCCTTC-3′，R：5′-CGCGGATCCTGCCTGTTTCTCGTA-3′為引物擴(kuò)增FABP3基因。PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍后取1.0 μL、d NTP（10 mmol·L-1）2.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、Primer（10μmol·L-1）各0.5μL、Taq DNA酶0.5μL、加入dd H2O調(diào)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠RNA表達(dá)情況。

1.2.2 G1代轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性檢測(cè) 提取4只G0代轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA作為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體對(duì)照，提取G1代個(gè)體基因組DNA。步驟如下：剪取G1代小鼠鼠尾1 cm左右，根據(jù)試劑盒OMEGA Genomic DNA Isolation Kit步聚提取基因組DNA；利用Primer primer5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增牛FABP3 基因，其上游引物為 F：5′-AGCAGAAGAACGGCATCA-3′；下游引物為R：5′-TTGTGGTAGGCTTGGTCATA-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板1.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、d NTP（10 mmol·L-1）0.4μL、正反向引物各0.6μL、Taq DNA酶0.2μL、補(bǔ)dd H2O至20μL；擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃5 min；35個(gè)循環(huán)：94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min；最后，72℃延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束，電泳檢測(cè)陽(yáng)性條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序；然后，通過(guò)BLAST搜索比對(duì)以確定轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳情況。1.2.3 G1代轉(zhuǎn)基因小鼠FABP3表達(dá)水平檢測(cè)

為了驗(yàn)證牛FABP3基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平，以及該基因與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的共同作用下FABP3表達(dá)量的變化。選取第1組G1代陽(yáng)性個(gè)體2只、第2組1只、第3組1只、第4組1只、G0代個(gè)體1只、非轉(zhuǎn)基因個(gè)體4只作為陰性對(duì)照，利用熒光定量PCR檢測(cè)牛FABP3在轉(zhuǎn)基因小鼠子代心和骨骼肌中的表達(dá)水平。提取小鼠組織總RNA，電泳檢測(cè)18S、28S條帶清晰后，將RNA反轉(zhuǎn)錄，以小鼠β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用Primer primer5軟件分別設(shè)計(jì)引物（表1）。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)；相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并采用鄧肯式新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）進(jìn)行表達(dá)量差異分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in the Real-time PCR amplification

1.2.4 組織原位表達(dá)鑒定 選取G0代轉(zhuǎn)基因小鼠1只，G1代轉(zhuǎn)基因小鼠2只，非轉(zhuǎn)基因小鼠2只處死后，采集心、肝、腎、背部骨骼肌組織置于液氮速凍后，放入-80℃冰箱中保存待用。切片制備：切片機(jī)打開(kāi)預(yù)冷2 h，使切片機(jī)的箱體溫度達(dá)-18℃，刀頭溫度達(dá)到-20℃。將切片機(jī)的載物托涂上一層包埋劑待其冷凍后，將包埋劑的上端削平，每只小鼠取合適大小相同的組織部位，置于載物托上，包埋劑包埋待用，將載物托安裝到刀頭，調(diào)試刀頭后開(kāi)始切片，設(shè)置切片厚度為6μm。將切片置于熒光正置顯微鏡下100倍放大視野中觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因個(gè)體及后代的陽(yáng)性驗(yàn)證

2.1.1 G0代轉(zhuǎn)基因小鼠的陽(yáng)性驗(yàn)證 本研究所用轉(zhuǎn)基因載體攜帶EGFP，因此，在熒光燈照射下，4只G0代轉(zhuǎn)基因小鼠爪子及尾根部被毛覆蓋較少的地方可以看到綠色熒光（圖1左）。轉(zhuǎn)基因小鼠1、2、3、4號(hào)個(gè)體RT-PCR電泳結(jié)果表明，位于大約400 bp的位置有明顯的擴(kuò)增條帶（圖1右），與目標(biāo)基因片段大小相符，說(shuō)明4只小鼠是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體，且牛FABP3基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)。

2.1.2 G1代轉(zhuǎn)基因小鼠DNA水平陽(yáng)性檢測(cè)應(yīng)用交配方案，4組G0代小鼠交配共產(chǎn)生G1代仔鼠28只；提取G1代小鼠基因組DNA擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)共獲得19只陽(yáng)性個(gè)體（圖2）。轉(zhuǎn)基因小鼠子代陽(yáng)性率的檢測(cè)結(jié)果表明，第1組G1代個(gè)體的陽(yáng)性率最高（100%），第4組次之（75%），第2組為55.6%，第3組最低（42.8%）（表2）。表明4只G0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠個(gè)體可將目的基因遺傳給后代，但轉(zhuǎn)基因小鼠的后代遺傳比例存在差異。

圖1 4只轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性檢測(cè)Fig.1 The positive detecting on 4 transgenic mice

表2 轉(zhuǎn)基因小鼠各組陽(yáng)性率比較Table 2 Comparing the positive rate of genetic modified mice among different groups

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠子代個(gè)體基因組DNA鑒定Fig.2 PCR detection of genetic modified mice

2.1.3 陽(yáng)性個(gè)體的測(cè)序結(jié)果 通過(guò)PCR擴(kuò)增電泳為陽(yáng)性后，測(cè)序，顯示所得到的序列全部個(gè)體一致，F(xiàn)ABP3序列信息：AGCAGAAGGACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCT-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGTGGACGCCTTCGTGGGTACCTGGAAGTTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTCGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGGCAATATGACCAAGCCTACCACAAA。

圖3 FABP3轉(zhuǎn)基因序列搜索比對(duì)Fig.3 BLAST results of the transgene sequence FABP3

序列BLAST軟件搜索比對(duì)如圖3，結(jié)果表明，該序列前314個(gè)堿基與載體EGFP-C1序列的相似度達(dá)99%，而后127個(gè)堿基與牛FABP3的m RNA序列對(duì)比一致性達(dá)100%，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步證明攜帶牛FABP3基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入了小鼠的基因組DNA中，且能夠遺傳給下一代。

2.2 轉(zhuǎn)基因子代小鼠FABP3 mRNA表達(dá)差異

轉(zhuǎn)基因子代小鼠RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明（表3、表4），相對(duì)于陰性對(duì)照組而言，在心肌中轉(zhuǎn)基因小鼠FABP3的表達(dá)增加量在1～1.7倍，骨骼肌中目的基因的相對(duì)表達(dá)增加量在1～3倍，其中2號(hào)個(gè)體的總FABP3基因的表達(dá)增加量達(dá)3.21倍。在G1代轉(zhuǎn)牛FABP3基因小鼠陽(yáng)性個(gè)體中，1、2號(hào)小鼠在心肌和骨骼肌中的表達(dá)量都比較高，尤其是骨骼肌中相對(duì)陰性對(duì)照個(gè)體表達(dá)量達(dá)到3倍以上，通過(guò)鄧肯式新復(fù)極差檢驗(yàn)均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；3號(hào)小鼠心肌和骨骼肌中的表達(dá)量也較高，通過(guò)DMRT檢驗(yàn)在骨骼肌顯著表達(dá)（P＜0.05）；第4只是轉(zhuǎn)基因小鼠雄性與非轉(zhuǎn)基因小鼠雌性交配所生的后代，相對(duì)于陰性對(duì)照外源基因在小鼠心和骨骼肌中的表達(dá)量差異不顯著；第5只小鼠與第4只小鼠都是轉(zhuǎn)基因雄性個(gè)體與非轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的后代，外源基因的表達(dá)量沒(méi)有明顯的增加（圖4）；第6只小鼠為G0代，其表達(dá)量低于G1代個(gè)體，這可能與飼喂的日糧不同有關(guān)。

表3 牛FABP3基因在小鼠不同個(gè)體心肌中實(shí)時(shí)熒光定量PCRTable 3 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice heart muscle

表4 牛FABP3基因在小鼠不同個(gè)體骨骼肌中實(shí)時(shí)熒光定量PCRTable 4 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice skeletal muscle

2.3 組織原位表達(dá)

GFP是一種綠色熒光蛋白，它作為標(biāo)記載體可以更直接的在熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體是否轉(zhuǎn)入成功，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行了直接切片檢測(cè)。

對(duì)G0代轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織的綠色熒光蛋白進(jìn)行熒光檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因個(gè)體的載體不可能均勻分布在小鼠體內(nèi)，因此轉(zhuǎn)基因個(gè)體的組織出現(xiàn)了許多的小亮斑。結(jié)果表明（圖5），心肌中的熒光蛋白出現(xiàn)的亮斑相對(duì)較多，如圖5A1中的箭頭所指呈現(xiàn)綠色熒光斑點(diǎn)；肝中的表達(dá)量最低（圖5A2）；腎（圖5A3）中的熒光點(diǎn)也比較多，證明攜帶目的基因的載體EGFP蛋白存在于G0代轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)并得到了有效表達(dá)。

G1代小鼠切片中（圖5，B1～B4）GFP蛋白仍有表達(dá)，但是亮斑的數(shù)量相對(duì)G0代明顯有所減少。G1代中GFP蛋白的表達(dá)量最高的為骨骼肌、其次是心肌、腎、肝。證明轉(zhuǎn)基因小鼠所攜帶的熒光蛋白可以通過(guò)繁殖遺傳給后代，陰性對(duì)照個(gè)體可以看出細(xì)胞的分布，屬自身熒光，沒(méi)有出現(xiàn)GFP蛋白的熒光亮斑，且在熒光顯微鏡下觀測(cè)時(shí)，自身熒光很快會(huì)被淬滅。

圖4 牛FABP3基因在小鼠心肌和骨骼肌中的表達(dá)量柱狀圖Fig.4 The histogram of FABP3 expression of cattle in transgenic mice myocardial and skeletal muscle

圖5 G0、G1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體與陰性對(duì)照個(gè)體心、肝、腎、骨骼肌組織切片熒光比較100×Fig.5 The fluorescence detection of heart，liver，kidney，skeletal muscle in G0 and G1 generation 100×

3 討 論

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的陽(yáng)性鑒定及基因表達(dá)的研究是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后續(xù)功能驗(yàn)證的基礎(chǔ)。本研究驗(yàn)證了轉(zhuǎn)牛FABP3基因小鼠遺傳表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)牛FABP3基因可以被整合入小鼠基因組，并遺傳給子代，但不同的子代基因表達(dá)受到一定影響；不同交配組合其子代陽(yáng)性率差異也較大，第一組個(gè)體中的遺傳性較好，其陽(yáng)性率達(dá)到100%，這可能與目的片段的插入位點(diǎn)和整合位點(diǎn)有一定關(guān)系［18］，需要通過(guò)染色體步移或者基因捕獲等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

FABP3基因是影響脂肪沉積的關(guān)鍵基因，其表達(dá)上調(diào)時(shí)脂肪吸收和代謝能力增強(qiáng)，促進(jìn)心肌和肌肉細(xì)胞中甘油三酯的沉積，從而增加肌內(nèi)脂肪的含量［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中FABP3蛋白沉積存在較大差異，骨骼肌和心肌中總FABP3表達(dá)量較高，這與之前B.P.Atshaves等報(bào)道的FABP3促進(jìn)心肌中脂肪的沉積結(jié)果相一致［20］；說(shuō)明高油對(duì)FABP3表達(dá)起調(diào)控作用。本研究在m RNA水平檢測(cè)了一只G0代個(gè)體的FABP3表達(dá)，可能個(gè)體間存在差異，其表達(dá)量偏低。在組織表達(dá)檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)GFP蛋白在G1代中的表達(dá)明顯少于G0代，這可能是外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其子代中常常發(fā)生拷貝數(shù)丟失和表達(dá)沉默的現(xiàn)象［21］。

文獻(xiàn)報(bào)道FABP3基因主要分布在心肌和骨骼肌細(xì)胞中，且參與心肌和骨骼肌的脂肪代謝［22-23］，因此，在心肌和骨骼肌中的表達(dá)量較高。心肌中FABP3基因表達(dá)量過(guò)高會(huì)造成心肌損傷或細(xì)胞線粒體代謝紊亂，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡［24］。在本研究中，飼養(yǎng)的小鼠健康狀況良好，但是G0代小鼠的繁殖性狀不穩(wěn)定，產(chǎn)子率較低，且易出現(xiàn)死胎等，這可能與FABP3轉(zhuǎn)座子、載體插入小鼠基因組后對(duì)小鼠整體生產(chǎn)性能有影響，需待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究檢測(cè)了牛FABP3基因在模式動(dòng)物小鼠體內(nèi)的遺傳與表達(dá)特性，并通過(guò)繁殖后代驗(yàn)證了牛FABP3轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳性，F(xiàn)ABP3基因的小鼠可以攜帶外源基因遺傳。后期還需要對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳穩(wěn)定性方面繼續(xù)進(jìn)行研究，對(duì)遺傳穩(wěn)定個(gè)體進(jìn)行分子水平和蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證，為肉牛育種工作積累有價(jià)值基因。

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